丁曉磊，張 悅，林司曦，葉建仁

(南京林業(yè)大學(xué)，南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，南京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，江蘇 南京 210037)

林業(yè)有害生物危害已成為當(dāng)前制約我國林業(yè)建設(shè)和經(jīng)濟(jì)發(fā)展的重要障礙[1]。松材線蟲病(pine wilt disease)作為林業(yè)毀滅性病害之一，具有傳播迅速、防治困難，以及一旦染病全株迅速枯死且不可逆轉(zhuǎn)等特點。松樹感病后最快40 d即可枯死，如不及時除治，從單棵松樹發(fā)病到數(shù)百公頃的松林毀滅僅需3～5 a的時間。正是由于該病的嚴(yán)重性，其病原松材線蟲(Bursaphelenchusxylophilus)已成為國際上公認(rèn)的重要檢疫性有害生物。松材線蟲原產(chǎn)于北美，對鄉(xiāng)土松種并未造成明顯的損失[2]。但從20世紀(jì)初起，松材線蟲先后傳入日本、中國和韓國等東亞地區(qū)，給該地區(qū)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失和生態(tài)破壞[3]，并于1999年傳入葡萄牙，隨后擴(kuò)散至西班牙，危害歐洲大片松林[4-5]。1982年我國首次在南京發(fā)現(xiàn)松材線蟲病，并在隨后的40年內(nèi)迅速擴(kuò)展蔓延，至2021年底，我國有19個省(自治區(qū)、直轄市)的728個縣級行政區(qū)被劃分為疫區(qū)，防控形勢異常嚴(yán)峻[6]。

各國學(xué)者一直試圖通過闡明松材線蟲的致病機(jī)制來推進(jìn)病害防控，研究者們圍繞該病害已經(jīng)開展了許多研究也取得了諸多成果，但其致病機(jī)制目前尚無定論[7-16]。隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，松材線蟲致病的分子機(jī)制研究不斷取得突破。近20年來，纖維素酶、果膠裂解酶、細(xì)胞色素酶等松材線蟲致病關(guān)鍵基因及其潛在調(diào)控功能研究已見報道[14-17]，而高通量測序技術(shù)的發(fā)展和普及為研究該病提供了新的方法。首代短讀長測序組裝的松材線蟲基因組草圖在2011年發(fā)布[18]，為后續(xù)分子致病機(jī)理的研究提供了重要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)支持。此后關(guān)于該病害的致病機(jī)理研究主要聚焦在致病基因、非編碼RNA和種群變異等方面[8, 19-22]，但大多以解析具有潛在調(diào)控作用的基因為主[20-24]。近年來，三代長讀長測序和染色體空間結(jié)構(gòu)測序技術(shù)將分子生物學(xué)研究帶入了新的階段，使高質(zhì)量染色體級別基因組的組裝變得切實可行，越來越多物種的基因組也同步得到了更新[25-27]。日本學(xué)者和筆者所在研究團(tuán)隊分別在2021年、2022年公布了2個版本的松材線蟲染色體級別基因組，為開展松材線蟲的分子生物學(xué)研究奠定了重要基礎(chǔ)[28-29]。在此，筆者對近年來松材線蟲高通量測序相關(guān)研究進(jìn)行綜述，全面概括利用該技術(shù)在松材線蟲分子致病研究中取得的重要進(jìn)展，以期為后續(xù)開展松材線蟲致病的相關(guān)分子生物學(xué)研究提供借鑒。

1 早期松材線蟲病相關(guān)致病基因研究

在高通量測序技術(shù)問世之前，松材線蟲致病相關(guān)分子機(jī)制主要采用基因同源克隆、抑制消減雜交文庫和基因芯片等手段進(jìn)行相關(guān)基因功能研究[14-17, 30]。如2006年Kikuchi等[14]對松材線蟲2個果膠裂解酶基因進(jìn)行了同源克隆，發(fā)現(xiàn)這2個基因主要在松材線蟲的食道中特異表達(dá)，證明了它們在線蟲侵入寄主過程中發(fā)揮著重要作用。Kang等[15]和Hirao等[17]分別于2009年和2012年對不同齡期的松材線蟲進(jìn)行了差減文庫分析，發(fā)現(xiàn)了19個特異表達(dá)的基因，其中半胱氨酸蛋白酶、毒液過敏原相關(guān)基因等與致病性密切相關(guān)；Qiu等[30]通過基因芯片技術(shù)對接種前后的松材線蟲進(jìn)行基因表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)1 310個基因中，633個基因上調(diào)、677個基因下調(diào)。這些差異基因中包含大量致病相關(guān)基因(如果膠裂解酶基因、細(xì)胞色素P450、UGTs、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因等)，注釋結(jié)果表明這些致病相關(guān)基因主要參與了細(xì)胞壁降解和生殖過程。以上研究發(fā)現(xiàn)了多個與松材線蟲致病相關(guān)的關(guān)鍵基因,為闡明松材線蟲致病機(jī)理奠定了重要基礎(chǔ)，但由于當(dāng)時缺少基因組數(shù)據(jù)，學(xué)者們難以深入挖掘松材線蟲特有或未知基因，阻礙了對該病致病機(jī)理的進(jìn)一步認(rèn)識。

2 基于初代基因組的相關(guān)致病基因研究

日本學(xué)者在2011年公布了首個基于短讀長測序的松材線蟲基因組草圖，為廣大研究者提供了約75 Mb、5 527個scaffolds和12 568個注釋基因的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)[18]。自此，松材線蟲的分子生物學(xué)相關(guān)研究進(jìn)入了有參基因組時代，極大地方便了研究人員的實驗設(shè)計和對關(guān)鍵致病基因的挖掘。

2011年Li等[31]在松材線蟲基因組中挖掘到了1個新的2-半胱氨酸過氧化物酶BRP-RX，進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)在BRP-RX的一級結(jié)構(gòu)中有1個由23個連續(xù)疏水氨基酸組成的跨膜α-螺旋，推測其可能在線蟲抵御寄主植物 ROS 防御系統(tǒng)中起著關(guān)鍵作用，是一個潛在的促進(jìn)松材線蟲侵染松樹的遺傳因子。2012年Wang等[32]對松材線蟲精氨酸激酶BxAK1進(jìn)行了克隆和RNA干擾驗證，結(jié)果表明沉默該基因可以顯著提升松材線蟲的死亡率并降低其繁殖率，揭示了其作為防控靶標(biāo)的潛在可能性。2015年Xu等[33]對3個松材線蟲致病相關(guān)細(xì)胞色素酶P450基因進(jìn)行了克隆，相關(guān)功能分析表明上述基因與松材線蟲傳播、繁殖和致病力相關(guān)。2020年Liu等[34]開展了松材線蟲自噬基因相關(guān)研究，發(fā)現(xiàn)松材線蟲自噬基因與宿主體內(nèi)活性氧代謝密切相關(guān)，且在氧脅迫下能夠誘導(dǎo)自噬基因的表達(dá)，明確了自噬基因在松材線蟲致病過程中可能發(fā)揮的作用。除了以上研究成果，越來越多關(guān)于松材線蟲分子生物學(xué)探索中開始使用高通量測序技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組水平的差異基因挖掘和基因組水平的遺傳變異研究?；趨⒖蓟蚪M和海量測序數(shù)據(jù)的幫助，松材線蟲分子生物學(xué)相關(guān)研究在近10年來取得了長足進(jìn)展。

3 松材線蟲高通量轉(zhuǎn)錄組測序相關(guān)研究

3.1 基于轉(zhuǎn)錄組測序的松材線蟲功能基因挖掘

轉(zhuǎn)錄組測序能夠在海量數(shù)據(jù)的支持下揭示松材線蟲致病相關(guān)基因的表達(dá)模式，以及預(yù)測基因功能和發(fā)現(xiàn)未知基因，達(dá)到對轉(zhuǎn)錄水平變化的高覆蓋度分析。2012年Yan等[35]對松材線蟲與擬松材線蟲的轉(zhuǎn)錄組(RNA-seq)進(jìn)行de-novo組裝的嘗試，基于松材線蟲與擬松材線蟲分別獲得了23 765和21 782個轉(zhuǎn)錄本片段，并發(fā)現(xiàn)了6個尚未報道的類毒液過敏原蛋白(VAPs)基因，認(rèn)為松材線蟲與擬松材線蟲可能在進(jìn)化過程中形成了相似的分子機(jī)制以適應(yīng)在宿主體內(nèi)的生活。2016年Tsai等[8]利用RNA-seq分析了松材線蟲在接種48 h后基因轉(zhuǎn)錄的變化，發(fā)現(xiàn)有60個與解毒物質(zhì)相關(guān)的基因在接種后明顯上調(diào)表達(dá)，而下調(diào)表達(dá)的基因則主要屬于膠原蛋白家族，并且雌性松材線蟲的尾尖突在接種后產(chǎn)生了較為明顯的表型變化。因此，作者認(rèn)為松材線蟲在侵染松樹的過程中可能會通過自身表型的變化來適應(yīng)外界環(huán)境的變化。2016年，Ding等[36]對不同毒力的4個松材線蟲蟲株進(jìn)行RNA-seq分析，發(fā)現(xiàn)了差異表達(dá)的238個轉(zhuǎn)錄本和84個外顯子。差異基因功能分析發(fā)現(xiàn)，不同毒力蟲株表現(xiàn)出不同的生長、繁殖特征和氧化還原酶活性，明確了以上基因與獨立分化之間的關(guān)系。Espada等[9]在2016年利用RNA-seq對松材線蟲早期侵染階段進(jìn)行效應(yīng)子的篩選，發(fā)現(xiàn)多個在感染早期高表達(dá)的效應(yīng)子并進(jìn)行了初步的功能研究，這也是松材線蟲效應(yīng)子相關(guān)研究的首次報道。Hu等[37]和Zhao等[38]分別于2019年和2020年通過RNA-seq成功鑒定了松材線蟲中的BxSapB1和BxSapB2等2個效應(yīng)子。其中BxSapB1可以導(dǎo)致本氏煙草細(xì)胞死亡，并對松材線蟲毒力有一定的影響；BxSapB2是一種分泌蛋白，在松材線蟲的食管腺細(xì)胞和化感器中高表達(dá)，且在松材線蟲與寄主的互作中扮演重要角色。2019年日本研究者Tanaka等[7]對松材線蟲不同發(fā)育階段進(jìn)行RNA-seq測序，發(fā)現(xiàn)超過9 000個基因在不同發(fā)育階段有差異表達(dá)，其中與線蟲生物學(xué)有關(guān)的基因多涉及生殖和蛻皮方面。2019年Wang等[39]通過RNA-seq測序來研究松材線蟲在低溫下的分子反應(yīng)模式，分析了6個低溫相關(guān)BxGPCR基因的轉(zhuǎn)錄豐度后發(fā)現(xiàn)，BxGPCR基因在低溫下轉(zhuǎn)錄水平顯著升高，而BxGPCR17454基因沉默后的松材線蟲其低溫存活率顯著下降。這一研究結(jié)果部分揭示了松材線蟲的低溫適應(yīng)分子機(jī)制。2021年，Chen等[40]對擴(kuò)散性階段的松材線蟲進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序分析，發(fā)現(xiàn)其主要功能富集在細(xì)胞自噬和壽命相關(guān)通路。后續(xù)實驗發(fā)現(xiàn)，松材線蟲中海藻糖相關(guān)基因的協(xié)同表達(dá)促進(jìn)了3齡幼蟲的形成，并幫助其在-20 ℃下存活。其他轉(zhuǎn)錄組相關(guān)研究還包括石榴苷、甲維鹽和蒎烯處理對松材線蟲相關(guān)基因表達(dá)量的影響[41-43]。為了闡明細(xì)菌在松材線蟲病中可能發(fā)揮的作用，陳陽雪等[44]采用對野生型和含有馬尾松內(nèi)生細(xì)菌GD2的松材線蟲分別進(jìn)行接種實驗，對接種后松材線蟲進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，比較了不同處理后篩選出的143個差異表達(dá)基因，其后續(xù)功能分析表明菌株GD2可以通過提高松材線蟲的免疫調(diào)節(jié)能力來影響松材線蟲病的發(fā)生。

3.2 松材線蟲非編碼RNA鑒定

目前關(guān)于松材線蟲非編碼RNA的研究較少，且多數(shù)都圍繞在基于高通量測序的miRNA鑒定和表達(dá)水平分析等方面，很少涉及某個miRNA的調(diào)控機(jī)制研究。如2010年Huang等[45]首次發(fā)現(xiàn)松材線蟲體內(nèi)存在非編碼RNA，有49個miRNA在種間高度保守，可能調(diào)控979個靶標(biāo)基因。其中14個miRNA參與調(diào)控了松材線蟲的耐熱性，初步揭示了非編碼RNA與松材線蟲環(huán)境適應(yīng)性之間的關(guān)系。2015年，Ding等[22]構(gòu)建了松材線蟲侵染松樹后4個不同階段的miRNA文庫，獲得了數(shù)百個進(jìn)化上相對保守的miRNA和未知候選miRNA數(shù)據(jù)集，表達(dá)豐度分析發(fā)現(xiàn)大部分miRNA在松材線蟲病發(fā)病中期呈現(xiàn)高水平表達(dá)，揭示了miRNA在松材線蟲致病過程中的潛在調(diào)控作用。Modesto等[46]研究了miRNAs在松材線蟲侵染Pinuspinaster早期發(fā)揮的調(diào)節(jié)作用，鑒定出105個響應(yīng)松材線蟲侵染的miRNAs，并根據(jù)預(yù)測的靶標(biāo)，認(rèn)為這些miRNAs中的一部分與茉莉酸反應(yīng)途徑、ROS解毒和萜類生物合成的作用有關(guān)。此外，通過對抗病和感病植物的比較，還鑒定出了8個在植物防御和抗病方面具有潛在功能的miRNAs。2017年，Xie等[47]以馬尾松為供體植物，利用高通量測序技術(shù)研究了松材線蟲侵染后前3 d針葉中miRNA的表達(dá)。結(jié)果表明，松材線蟲侵染后3 d內(nèi)，差異表達(dá)的miRNAs在樣品中呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，其中以感染后第2天采集的樣品表達(dá)最高。對感染后不同時間針葉中miRNA靶基因的分析表明，植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和RNA轉(zhuǎn)運(yùn)兩條途徑富含miRNAs。Cai等[48]于2022年利用miRDeep2、mireap和miR分析器等miRNA預(yù)測工具或通過同源作圖，已在至少36種寄生蠕蟲(包括松材線蟲)中鑒定出了不同的miRNA種群。

4 松材線蟲伴生微生物群落高通量測序相關(guān)研究

松材線蟲伴生微生物群落一直以來被一些學(xué)者認(rèn)為可能與松材線蟲病毒力和繁殖力等密切相關(guān)?；诟咄繙y序的宏基因組技術(shù)可以全面分析松材線蟲體表和體內(nèi)攜帶的微生物群落情況，明確線蟲和微生物之間的互作機(jī)制。2012年，Cheng等[49]采用核糖體RNA通用引物擴(kuò)增后對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行RNA-seq測序的方法分析了松材線蟲伴生微生物群落,結(jié)果發(fā)現(xiàn)松材線蟲微生物群落的解毒機(jī)制以苯甲酸降解代謝為主，不同于松材線蟲基于細(xì)胞色素CYP450代謝的解毒通路。實驗分析還表明，大多數(shù)可培養(yǎng)的細(xì)菌不僅可以耐受0.4%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的α-pinene，還能作為其生長的碳源，故而認(rèn)為松材線蟲和其共生微生物之間已經(jīng)建立了互惠互利的解毒機(jī)制。2014年，Xiang等[50]通過細(xì)菌16S rDNA高通量測序研究了4株不同毒力的松材線蟲和4株擬松材線蟲的內(nèi)生細(xì)菌結(jié)構(gòu)差異，基于運(yùn)算分類單元(operational taxonomic unit，OTU)的結(jié)果表明，松材線蟲強(qiáng)毒蟲株AMA3和ZL1的菌群豐富度均高于中毒蟲株AA3、HE2和所有擬松材線蟲蟲株，不同種群線蟲所攜帶的內(nèi)生細(xì)菌差異顯著。2016年，Wu等[51]利用Biolog結(jié)合高通量測序分析了松材線蟲繁殖型和擴(kuò)散型之間伴生細(xì)菌群落差異，高通量分析表明寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonassp.)、無色桿菌(Achromobactersp.)和鞘氨醇桿菌(Sphingobacteriumsp.)在繁殖型松材線蟲中更豐富，而檸檬酸桿菌(Citrobacteramalonaticus)、弧菌(Vibriosp.)和腸桿菌科(Enterobacteriaceae)在擴(kuò)散型松材線蟲中含量更高，這種變化可能有助于松材線蟲適應(yīng)環(huán)境的改變。Xue等[42]為探討松材線蟲內(nèi)生細(xì)菌嗜麥芽窄食單胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)對松材線蟲致病力的影響，對無菌線蟲和攜帶嗜麥芽窄食單胞菌的松材線蟲進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序，結(jié)果表明嗜麥芽窄食單胞菌可通過調(diào)節(jié)松材線蟲寄生、免疫和致病相關(guān)基因的表達(dá)來影響松材線蟲的毒力和繁殖，此結(jié)果為進(jìn)一步探討松材線蟲病的發(fā)病機(jī)制提供了依據(jù)。為了弄清松材線蟲侵染寄主對寄主內(nèi)生細(xì)菌的影響，蘆偉等[52]以 2年生馬尾松苗為試驗材料，采用 Illumina MiSeq 高通量測序技術(shù)分析受松材線蟲侵染后的馬尾松莖干內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成與多樣性的變化情況，發(fā)現(xiàn)在屬水平上馬尾松莖干內(nèi)生細(xì)菌組成種類與豐度均發(fā)生明顯改變，表明松材線蟲侵染會對馬尾松莖干內(nèi)生細(xì)菌產(chǎn)生顯著影響。尹詩恒等[53]為了探究松材線蟲侵染下松干、松針與根系部位內(nèi)生細(xì)菌菌群的結(jié)構(gòu)變化，充分挖掘馬尾松內(nèi)生細(xì)菌資源，采用變性梯度凝膠電泳(DGGE)及高通量測序技術(shù)，對松材線蟲侵染下3年生馬尾松不同部位內(nèi)生細(xì)菌的結(jié)構(gòu)多樣性進(jìn)行分析，結(jié)果表明受侵染后的馬尾松根部基本不受影響，但樹干部位內(nèi)生細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)變化極顯著，其次是松針。Deng等[54]通過從微孔膜和0.5 g土壤中提取基因組DNA,對細(xì)菌16S rDNA基因的V3—V4區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增并進(jìn)行高通量測序，對健康紅松和紅松早期及后期感染松材線蟲的葉圈和根際細(xì)菌、真菌群落進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)隨著松材線蟲病感染程度的加重，大多數(shù)細(xì)菌群趨向于共排除而不是共生。

5 松材線蟲高通量基因組測序相關(guān)研究

5.1 松材線蟲短讀長基因組重測序

在基因組水平上，高通量測序能夠檢測松材線蟲不同種群間的核苷酸位點差異和基因家族擴(kuò)張現(xiàn)象，為解析該病害的進(jìn)化過程、明確關(guān)鍵性狀的生物靶標(biāo)及分析種間差異提供有效的技術(shù)手段。2015年P(guān)alomares-Rius等[20]將日本境內(nèi)不同地理來源的松材線蟲進(jìn)行了基于單核苷酸多態(tài)性(SNPs)的差異分析。該研究首次報道了松材線蟲體內(nèi)含有約3 Mb的SNPs位點，占到了基因組的4.1%。這些高水平的遺傳變異也表明松材線蟲在毒力與生態(tài)適應(yīng)性方面具有較高的多樣性。2020年Zhang等[55]通過開展松材線蟲、動物寄生線蟲和植物寄生線蟲等線蟲種的比較基因組分析，發(fā)現(xiàn)松材線蟲的51個基因家族都存在基因擴(kuò)張情況，基中參與外源解毒途徑的黃素單加氧酶(FMO)、細(xì)胞色素P450(CYP450)、醇脫氫酶(ADH)、葡萄糖醛基轉(zhuǎn)移酶(UGT)和谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST)等基因的擴(kuò)張現(xiàn)象尤為顯著。雖然大多數(shù)的擴(kuò)張可能是由DNA片段重復(fù)產(chǎn)生，但其中9個ADH基因可能是通過水平基因轉(zhuǎn)移現(xiàn)象從真菌中獲得。研究認(rèn)為宿主防御化學(xué)物質(zhì)導(dǎo)致了松材線蟲外源解毒途徑的基因家族擴(kuò)展，促進(jìn)了其在樹脂道中的生存，提高了線蟲在宿主體內(nèi)的適應(yīng)性。2021年Filipiak等[56]為了對4株具有不同毒力的蟲株進(jìn)行重測序分析，發(fā)現(xiàn)1 576個與毒力差異有潛在關(guān)聯(lián)的位點，為在分子水平上區(qū)分不同毒力松材線蟲蟲株提供了分子靶標(biāo)。2019年，黃金思等[57]通過Illumina Hi-seq 4000平臺對采集自廣東省不同區(qū)域的30株松材線蟲蟲株進(jìn)行基因組重測序，利用生物信息學(xué)軟件對其SNPs位點信息及基因型進(jìn)行分析，最后通過主成分和聚類分析將這30株蟲株分為3類，完成了基于SNP標(biāo)記的廣東省松材線蟲種群分化研究。2021年Ding等[28]在松材線蟲新的染色體級別基因組基礎(chǔ)上對來自中國和美國的181個菌株進(jìn)行了重測序分析，發(fā)現(xiàn)了約780萬個SNPs位點，并將中國松材線蟲種群細(xì)化為4個類群。后續(xù)分析發(fā)現(xiàn)，不同類群線蟲與地理來源關(guān)系密切，不同地區(qū)間存在嚴(yán)重的交叉感染現(xiàn)象。此外，該研究還建立了一種基于機(jī)器學(xué)習(xí)的松材線蟲疫源追溯體系，為控制病害蔓延提供了有力的防控手段。

5.2 基于長讀長測序技術(shù)的松材線蟲基因組組裝

第2代測序技術(shù)的出現(xiàn)，極大地推進(jìn)了基因組層次研究的進(jìn)展，使得基因組測序工作變得比較簡單。但其缺點也日益凸顯，最主要的問題是第2代測序讀長短，測通困難[58]，這給序列拼接、組裝及注釋等分析帶來巨大的困難。而第3代測序技術(shù)是在單一的、由 DNA 分子組成的陣列上進(jìn)行的合成測序。這種技術(shù)可以大大增加獨立分析的 DNA 片段的數(shù)目，增強(qiáng)產(chǎn)出序列的長度，極大地簡化了基因組組裝過程[59]。目前，在第3代測序技術(shù)的幫助下，已陸續(xù)完成了各物種基因組版本更新，提高了測序結(jié)果的完整度和精細(xì)度，且很多物種已有端粒至端粒的完整精細(xì)圖譜。高質(zhì)量的基因組無疑為后續(xù)所有分子生物學(xué)相關(guān)研究提供了重要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)支持，Dayi等[29]在2020年將其發(fā)布的初代基因組使用Nanopore長讀長序列和HI-C技術(shù)進(jìn)行了更新，獲得了松材線蟲染色體級別基因組。幾乎同時期，Ding等[28]利用PacBio+Illumina +Bionano+Hi-C多項技術(shù)對松材線蟲進(jìn)行了基因組組裝，兩項研究均獲得了6條近完整的染色體序列，將基因組大小提高至78 Mb。以上新基因組的scaffold長度均達(dá)到了12 Mb，是早期基因組(0.2 Mb)的60倍，平均scaffold長度為其24倍。此外，功能注釋和RNA-seq數(shù)據(jù)分析證明，借助新版本基因組可以鑒定出更多的新基因和亞型，這將有助于研究人員獲取更完整的松材線蟲轉(zhuǎn)錄組信息。以上兩個版本的基因組數(shù)據(jù)可以完成對松材線蟲復(fù)雜重復(fù)區(qū)域的高度覆蓋，彌補(bǔ)了上一版本松材線蟲基因組草圖的不足，為后續(xù)相關(guān)研究奠定了重要的基礎(chǔ)。

6 結(jié) 語

隨著高通量測序技術(shù)的快速發(fā)展，越來越多的松材線蟲關(guān)鍵致病基因、非編碼RNA，以及種群遺傳差異位點被報道，加深了對松材線蟲分子致病機(jī)理的理解。尤其是隨著松材線蟲最新版本基因組數(shù)據(jù)的公布，研究者們將向著更為精細(xì)、前沿的研究領(lǐng)域探索。在轉(zhuǎn)錄組相關(guān)研究方面，可嘗試開展空間轉(zhuǎn)錄組、單細(xì)胞測序等在松材線蟲中尚未使用的新技術(shù)[60-62]，在染色體基因組的支持下尋找松材線蟲中具有潛在調(diào)控功能的長鏈非編碼RNA、融合基因和環(huán)狀RNA等罕見核酸分子；挖掘可能存在的甲基化、RNA編輯、結(jié)構(gòu)變異等未知現(xiàn)象。在基因組學(xué)研究方面，可以開展基因家族擴(kuò)增、大樣本全基因組關(guān)聯(lián)分析和數(shù)量性狀定位等研究，以挖掘與致病力和繁殖力等重要性狀緊密關(guān)聯(lián)的基因或位點，闡明松材線蟲不同種群在進(jìn)化過程中發(fā)生的適應(yīng)性變化。以上新的研究方向?qū)樗刹木€蟲病相關(guān)分子研究提供全新的思路和切入點，有助于深入揭示其潛在的致病機(jī)理。