馮一寧, 李因剛,祁 銘,周鵬燕,周 琦,董 樂,徐立安*

(1.南京林業(yè)大學(xué)，南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210037；2.浙江省林業(yè)科學(xué)研究院，浙江 杭州 310023)

閩楠(Phoebebournei)為樟科楠屬高大常綠喬木[1]，木材主要用于建筑、家具、造船等高檔用材[2]。由于閩楠具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，遭到生境破壞、過度采伐等人為影響，閩楠的野生資源逐漸減少，被列為國家二級(jí)珍稀瀕危植物[3]。閩楠天然分布于福建、江西、湖南、湖北等省，主要分布在閩、贛兩省[4]。野外調(diào)查顯示有一定規(guī)模的閩楠天然種群現(xiàn)已難以找到，而在福建省內(nèi)還偶有一定數(shù)量古樹和較為集中的閩楠天然群落。

目前在林木遺傳多樣性研究中主要應(yīng)用的分子標(biāo)記有基于分子雜交技術(shù)的RFLP,以PCR技術(shù)為核心的SSR、RAPD、AFLP和ISSR等。其中，簡(jiǎn)單序列重復(fù)(simple sequence repeat，SSR)分子標(biāo)記克服了RFLP對(duì)DNA檢驗(yàn)出的多態(tài)性低、操作較煩瑣，RAPD標(biāo)記技術(shù)重復(fù)性和穩(wěn)定性差且不能識(shí)別雜合位點(diǎn)，以及AFLP標(biāo)記對(duì)基因組的反應(yīng)條件和純度要求高等缺點(diǎn)，且結(jié)果更加可靠[5-9]。

隨著對(duì)閩楠研究的深入和分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展，有些學(xué)者已利用RAPD、ISSR等顯性標(biāo)記對(duì)閩楠開展了群體遺傳多樣性方面的研究[10-12]，為閩楠的保護(hù)和利用提供了一定依據(jù)；而共顯性SSR標(biāo)記對(duì)閩楠的研究，目前僅有時(shí)小東等[13]對(duì)楠木進(jìn)行的SSR標(biāo)記開發(fā)，劉丹等[14]分析了部分優(yōu)樹及其子代中的優(yōu)株遺傳變異和遺傳分化，黃雨芹等[15]探討了基于SSR標(biāo)記構(gòu)建閩楠核心種質(zhì)，而利用SSR標(biāo)記對(duì)閩楠天然群體進(jìn)行遺傳多樣性方面的研究鮮見報(bào)道。

本研究利用自主開發(fā)的18對(duì)SSR分子標(biāo)記，對(duì)福建省內(nèi)保存較好的3個(gè)代表性閩楠天然群體進(jìn)行群體檢測(cè)，研究其群體間及群體內(nèi)的遺傳變異水平及遺傳結(jié)構(gòu)特征，為閩楠天然群體的保護(hù)和利用提供進(jìn)一步參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究材料來源于南京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院閩楠課題組2018年收集的3個(gè)閩楠天然群體，包括福建政和(ZH)群體(為華東最大，保存最好的閩楠古樹群，有1 100余株，其中胸徑85 cm以上的有240余株，最大單株胸徑達(dá)到137 cm)、福建沙縣羅卜巖(LBY)群體(含少量成年大樹，更新較為旺盛，群落保存較好)和福建順昌(SC)群體(為古樹群，較為集中分布在500 m2范圍內(nèi)，人為干擾較大，幼苗更新很少)。3個(gè)群體的基本信息見表1。

表1 3個(gè)閩楠地理群體基本信息

從3個(gè)群體分別采集29、33和26份個(gè)體樣品。福建羅卜巖保護(hù)區(qū)選取了僅存的大部分胸徑30 cm以上的大樹(占樣本的少部分)，其他樣本胸徑10～20 cm；福建順昌群體采集了全部26株閩楠大樹(近90%樣本胸徑40～95 cm)；福建政和群體樣本均是胸徑大于45 cm的大樹。羅卜巖和政和群體樣本間距離為50 m以上。確定采樣單株后，在每個(gè)單株上采集5～10片新萌的嫩葉，置于塑料自封袋內(nèi)，注入10倍葉片質(zhì)量的變色硅膠干燥帶回實(shí)驗(yàn)室，存于-40 ℃冰箱內(nèi)。在樣品采集時(shí)對(duì)地理信息數(shù)據(jù)進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)采集，并對(duì)群體內(nèi)的所有采樣單株進(jìn)行胸徑測(cè)定(表1)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

采用改良的試劑盒法提取閩楠葉片基因組DNA，試劑盒為百泰克生物科技公司的植物材料DNA提取試劑盒，將DNA置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

從實(shí)驗(yàn)室前期基于楠木轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(EST)開發(fā)的SSR引物中篩選出18對(duì)多態(tài)性較高、穩(wěn)定性好的SSR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增(表2)。引物由金斯瑞生物科技有限公司合成。10 μL SSR-PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系包括：0.6 μL DNA，0.6μL F-Primer，0.6 μL R-Primer，0.4 μL Mg2+，0.5 μL DNTP，0.04 μLTaqDNA聚合酶，1 μL Buffer，6.26 μL ddH2O。反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 預(yù)變性2.5 min；94 ℃變性30 s，最佳退火溫度(Tm)30 s，72 ℃ 延伸30 s，27～30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸20 min，10 ℃保存。引物篩選過程利用聚丙烯酰胺凝膠電泳(質(zhì)量分?jǐn)?shù)8%)，以檢測(cè)引物多態(tài)性。用于群體檢測(cè)的PCR產(chǎn)物送于南京擎科生物公司進(jìn)行毛細(xì)管熒光電泳檢測(cè)。

表2 18對(duì)多態(tài)性SSR引物及其特征

1.3 數(shù)據(jù)分析

部分遺傳參數(shù)通過Popgene 32軟件完成，其中包括：觀測(cè)等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、觀測(cè)雜合度(Ho)、期望雜合度(He)、基因分化系數(shù)(Fst)、基因流(Nm)、Shannon多樣性指數(shù)(I)、近交系數(shù)(F)、Hardy-Weinberg平衡卡方檢驗(yàn)(HWE)、遺傳距離、遺傳相似系數(shù)。由Powermarker軟件完成多態(tài)性信息含量(PIC)的測(cè)定；利用Fstat軟件進(jìn)行等位基因豐富度(AR)的計(jì)算。

通過Structure軟件對(duì)群體遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，依據(jù)貝葉斯聚類模型采用混合祖先模型(admixture ancestry model)分析群體遺傳結(jié)構(gòu)[16]。將群體分類成亞群數(shù)量的K值取1～3(不大于群體數(shù))，且每個(gè)K值重復(fù)運(yùn)行5次，其中，基于馬爾可夫鏈法將迭代次數(shù)和運(yùn)行步數(shù)分別設(shè)為200 000和1 200 000。最佳的K值通過使用Structure Harvester軟件參照Evanno等[17]的方法確定，通過Clumpp進(jìn)行重復(fù)抽樣分析，用Distruct 1.1圖形化顯示結(jié)果。分子方差分析(AMOVA)使用GenA-lEx 6.5軟件完成，再利用FigTree 1.4.3軟件實(shí)現(xiàn)聚類分析[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR位點(diǎn)多態(tài)性

利用18對(duì)引物對(duì)閩楠3個(gè)群體共計(jì)88個(gè)體進(jìn)行檢測(cè)(部分產(chǎn)物電泳圖見圖1)，18個(gè)SSR位點(diǎn)的遺傳多樣性參數(shù)見表3。由表3可知，共擴(kuò)增出183個(gè)等位基因，每個(gè)位點(diǎn)檢測(cè)出4～19個(gè)等位基因，平均Na為10.167個(gè)；有效等位基因數(shù)介于2.305(ph_EST-SSR13)和10.103(ph_EST-SSR8)之間，平均有效等位基因數(shù)(Ne)為4.972。Shannon多樣性指數(shù)(I)為1.102～2.523，平均為1.771。在閩楠的物種水平上，平均期望雜合度(He=0.773)大于平均觀測(cè)雜合度(Ho=0.451)，除位點(diǎn)ph_EST-SSR7、ph_EST-SSR12和ph_EST-SSR17外，其余的期望雜合度均高于觀測(cè)雜合度，說明大部分位點(diǎn)出現(xiàn)了純合子偏多的現(xiàn)象。18個(gè)位點(diǎn)多態(tài)性信息含量(PIC值)平均為0.761，PIC值均大于0.5，表現(xiàn)出較高多態(tài)性。哈迪溫伯格平衡檢驗(yàn)結(jié)果顯示各位點(diǎn)等位基因頻率均極顯著偏離了平衡(P<0.01)。

表3 18個(gè)SSR位點(diǎn)的遺傳多樣性參數(shù)

2.2 群體遺傳多樣性

閩楠3個(gè)天然群體的遺傳多樣性比較分析結(jié)果(表4)表明，群體水平上的觀測(cè)等位基因數(shù)(Na)和有效等位基因數(shù)(Ne)均值分別為6.296和3.202。福建政和(ZH)群體的遺傳多樣性水平最高，觀測(cè)等位基因數(shù)(Na)、觀測(cè)雜合度(Ho)、期望雜合度(He)均最高，分別為6.944、0.521、0.641；福建羅卜巖(LBY)群體的遺傳多樣性水平最低，其Na、Ho、He分別為5.778、0.399、0.608；福建順昌群體的有效等位基因數(shù)(Ne=3.379)和等位基因豐富度(AR為7.444)較高，但其他多樣性指數(shù)均低于政和群體。因此，3個(gè)閩楠群體遺傳多樣性水平由大到小依次為：ZH>SC>LBY?？傮w來看，3個(gè)群體的遺傳多樣性水平差異不大。

表4 閩楠各個(gè)群體遺傳多樣性分析

F為近交系數(shù)，當(dāng)F>0時(shí)，F(xiàn)的值越大，表明純合子的比例越高；F的值越小，表明雜合子的比例越高。3個(gè)閩楠群體的F均值為0.280，其中ZH群體F值明顯低于LBY和SC群體，說明LBY和SC群體近交程度高于ZH群體。

2.3 群體遺傳分化和遺傳結(jié)構(gòu)

2.3.1 群體遺傳分化

3個(gè)閩楠群體的基因分化系數(shù)(Fst)為0.197(表3)，表明遺傳變異雖然主要存在于群體內(nèi)，還有一定變異(19.70%)存在于閩楠群體間?；趯?duì)閩楠群體的分子變異分析(AMOVA)結(jié)果(表5)也表明了3個(gè)閩楠群體以群體內(nèi)的變異為主(72%)，但有28%的變異存在于群體間。均表明群體間存在較明顯的遺傳分化。

表5 3個(gè)閩楠群體的分子方差檢驗(yàn)

2.3.2 群體遺傳結(jié)構(gòu)

采用Popgene軟件計(jì)算得出3個(gè)閩楠群體Nei’s遺傳相似系數(shù)和遺傳距離。結(jié)果顯示在3個(gè)群體中，遺傳相似系數(shù)最大的是羅卜巖和順昌群體間(0.499)，說明2個(gè)群體親緣關(guān)系較近，而福建政和與羅卜巖群體間的遺傳相似系數(shù)最小(0.406)，兩個(gè)群體的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。通過對(duì)比發(fā)現(xiàn)群體間的遺傳距離與遺傳相似系數(shù)結(jié)果一致，最近的遺傳距離為羅卜巖和順昌群體的0.696，最遠(yuǎn)的遺傳距離為羅卜巖和政和群體的0.860。

基于Structure、Clumpp和Distruct 1.1 對(duì)3個(gè)閩楠群體遺傳結(jié)構(gòu)的分析表明(圖2)，當(dāng)k=2時(shí)最能反映各群體的遺傳分化情況。其中，福建政和群體與另外兩個(gè)群體表現(xiàn)出了較明顯的遺傳分化，LBY和SC群體的大部分遺傳信息表現(xiàn)為相似的祖先來源。

利用FigTree 1.4.3軟件對(duì)閩楠3個(gè)群體88個(gè)單株進(jìn)行聚類分析(圖3)。由圖3可知，88個(gè)個(gè)體可以歸類為兩大類群。第Ⅰ大類群主要包括福建羅卜巖群體LBY 2—LBY 33號(hào)，福建順昌群體SC 1—SC 26號(hào)。第Ⅱ大類群包括福建羅卜巖群體LBY-1號(hào)，福建政和群體ZH 1—ZH 29號(hào)。因此遺傳距離較近的LBY和SC被聚為一類，而ZH單獨(dú)聚成一類，這與Structure聚類分析結(jié)果較一致。

3 討 論

3.1 閩楠群體遺傳多樣性與近交程度

本研究基于閩楠轉(zhuǎn)錄組開發(fā)并篩選出的18對(duì)SSR引物的平均PIC值為0.761，平均有效等位基因數(shù)(Ne)為4.972，明顯高于劉丹等[14]報(bào)道的10對(duì)SSR標(biāo)記的PIC值(0.27)，以及黃雨芹等[15]對(duì)237份閩楠分析獲得的平均有效等位基因數(shù)(2.115),表明所篩選的引物具有高度多態(tài)性。本研究分析得到的閩楠3個(gè)群體平均期望雜合度(He)為0.629，稍低于栲樹(Castanopsisfargesii)(0.654)[18]，稍高于遼寧蒙古櫟(Quercusmongolica)(0.624)[19]，高于鵝掌楸(Liriodendronchinense)(0.558)[20]，以及用7個(gè)SSR位點(diǎn)標(biāo)記對(duì)237份閩楠材料進(jìn)行研究的結(jié)果(0.442)[15]，表明研究的3個(gè)閩楠群體具有較高水平的遺傳多樣性,其中保存較好的群體(政和和順昌群體)高于人為干擾明顯的(羅卜巖)群體。

進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)3個(gè)閩楠物種水平上，平均期望雜合度(He=0.773)明顯大于平均觀測(cè)雜合度(Ho=0.451)，除引物ph_EST-SSR7、ph_EST-SSR12和ph_EST-SSR17外，其余的期望雜合度均高于觀測(cè)雜合度，說明大部分表現(xiàn)出純合子偏多的現(xiàn)象，可能由于閩楠為小群體的分布模式，容易引起近交，從而導(dǎo)致群體內(nèi)純合個(gè)體增加。本研究結(jié)果顯示，3個(gè)群體的期望雜合度(He)均較高且較為接近，而各群體的觀測(cè)雜合度(Ho)卻有較大差異。政和(ZH)群體觀測(cè)雜合度(Ho)為0.521，是3個(gè)群體中最高的，其近交程度最低。其原因?yàn)樵撊后w是保存最為完好的古樹群：群體分布面積大，群體內(nèi)古樹多、含各年齡層次的植株更新旺盛。順昌(SC)群體也是位于村莊附近的古樹群，但群體內(nèi)植株較少，且集中分布在較小的面積內(nèi)，導(dǎo)致近交程度較高。羅卜巖(LBY)群體觀測(cè)雜合度(Ho)為0.399，是3個(gè)群體中最低的，其近交程度最高。羅卜巖群體是位于省級(jí)自然保護(hù)區(qū)內(nèi)，分布面積較大，由于受保護(hù)前大多數(shù)古樹被砍伐，現(xiàn)有群體中多為幼樹，僅有少量零散分布的成年植株。因群體內(nèi)能隨機(jī)交配的成年大樹有限，增加了近交的程度，導(dǎo)致其觀測(cè)雜合度偏低。

3.2 閩楠群體遺傳分化和遺傳結(jié)構(gòu)

一般而言，基因分化系數(shù)(Fst)為0～0.05，表明物種群體間的遺傳分化水平很低；0.050.25時(shí)，表明群體間遺傳分化水平處于較高程度[21]。本研究揭示的3個(gè)閩楠群體間Fst為0.197，分子方差分析(AMOVA)數(shù)據(jù)表明28%的變異存在于群體間，說明群體間存在中等偏高程度的遺傳分化。江香梅等[10]基于6對(duì)RAPD標(biāo)記對(duì)江西和福建省8個(gè)閩楠天然群體160個(gè)個(gè)體進(jìn)行遺傳分析，閩楠遺傳分化系數(shù)(Gst)為0.373、AMOVA分子變異分析得出43.3%的變異存在于群體內(nèi)。根據(jù)筆者和前人研究發(fā)現(xiàn)，在閩楠主要分布區(qū)內(nèi)閩楠群體間產(chǎn)生了一定程度的遺傳分化，變異主要存在于群體內(nèi)，群體間存在一定的基因交流。3個(gè)閩楠群體基因分化系數(shù)高于同樣利用SSR標(biāo)記進(jìn)行遺傳結(jié)構(gòu)分析的銀杏(0.094)、栲樹(0.031)、蒙古櫟(0.065 5)、板栗(Castaneamollissima,0.099 3)等[16，18-19，22]，可能是由于人為活動(dòng)導(dǎo)致楠木個(gè)體被砍伐、部分群體消失、群體較小的現(xiàn)狀，造成了閩楠群體內(nèi)近交頻繁，群體內(nèi)變異變小，群體間分化增大。

ZH群體與LBY、SC兩個(gè)群體之間由于地理距離較遠(yuǎn)且有鷲峰山脈的阻隔，群體間難以進(jìn)行基因交流，導(dǎo)致了遺傳分化較大，結(jié)果使LBY和SC群體聚為一類，ZH單獨(dú)為一類。

根據(jù)福建省內(nèi)3個(gè)代表性閩楠群體的群落現(xiàn)狀調(diào)查和遺傳結(jié)構(gòu)特征研究，筆者認(rèn)為，由于歷史上對(duì)閩楠的過度利用，使其資源尤其是大樹(胸徑30～40 cm及以上)資源急劇減少，較大規(guī)模、未受干擾的閩楠群體已很罕見。令人欣慰的是，現(xiàn)有較大的群體往往有較高的遺傳多樣性，目前保護(hù)較好的政和群體和羅卜巖群體內(nèi)均更新良好，說明閩楠具有足夠的更新能力；而羅卜巖群體的現(xiàn)狀又表明，一些個(gè)體數(shù)量多但大樹少的閩楠群體可能具有較高遺傳多樣性，由于近交的增加，可能導(dǎo)致群體的衰退。因此，應(yīng)創(chuàng)造條件使群體內(nèi)充分異交，以維持閩楠群體較高的遺傳多樣性。