單宇峰，馬 帥，葉 可，祝東梅，鄭菲菲

華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院/ 水產(chǎn)養(yǎng)殖國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，武漢 430070

黃鱔（Monopterus albus）隸屬于硬骨魚綱、合鰓目、合鰓科、黃鱔屬，是我國(guó)重要的淡水特色名優(yōu)養(yǎng)殖品種，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值。近年來(lái)黃鱔養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大，集約化程度高，網(wǎng)箱養(yǎng)殖成為主要方式[1]。目前，鱔苗大多是從市場(chǎng)上收購(gòu)的野生苗種，其習(xí)慣攝食小魚小蝦，黃鱔的攝食習(xí)性一旦固定之后很難改變[2]，在馴食過程中因缺乏適口餌料導(dǎo)致收獲的鱔種不多，再加上受網(wǎng)箱中的溫度變化、水質(zhì)變化、餌料改變和藥物刺激等因素的影響，鱔苗經(jīng)常出現(xiàn)“不開口”的情況[3]，嚴(yán)重制約了黃鱔的養(yǎng)殖規(guī)模和產(chǎn)量。

研究表明，食物中的微生物與魚類消化道微生物群落的形成緊密相關(guān)，同一種魚攝食不同種類的食物也會(huì)造成魚類腸道微生物群落結(jié)構(gòu)和種類的差異[4-5]。魚類腸道微生物與其形成共生關(guān)系，腸道微生物對(duì)魚類的食物消化吸收、分解利用，甚至生長(zhǎng)、攝食都有利[6-7]。目前，有學(xué)者探究分析鱔苗不吃食的原因[3]，但是具體的內(nèi)因還沒有相關(guān)研究，為探究黃鱔“不開口”的內(nèi)在原因，本研究采用細(xì)菌16S rRNA 高通量測(cè)序技術(shù)比較分析網(wǎng)箱投喂魚漿養(yǎng)殖模式下“開口”與“不開口”黃鱔胃腸道的微生物組成和群落結(jié)構(gòu)特征差異，旨在為鱔苗的馴食及健康養(yǎng)殖提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1）儀器與試劑。①儀器：Nanodrop NC2000；SynergyHTX 型酶標(biāo)儀；Legend Micro 21 型高速離心機(jī)；1795 型微型離心機(jī)；BC/BD-629HK 型臥式冷藏冷凍轉(zhuǎn)換柜；HYC-360 型4 ℃冰箱；G560E 型振蕩器；9902 型96 well PCR 儀；5424EQ766751 型24 孔離心機(jī)；DYY-6C 型電泳儀；BSC-1300 型無(wú)菌操作臺(tái)。

②試劑：KOD FX Neo（TOYOBO）擴(kuò)增聚合酶，購(gòu)于美國(guó)NEB 公司；DNA 抽提試劑盒，購(gòu)于美國(guó)Omega Bio-Tek 公司；DNA 膠回收試劑盒購(gòu)于美國(guó)Monarch 公司。

2）樣品采集。隨機(jī)選取仙桃市西流河鎮(zhèn)網(wǎng)箱投喂魚漿養(yǎng)殖模式下“開口”和“不開口”的黃鱔各3尾，“開口”黃鱔體重為（110.43±23.46）g，“不開口”黃鱔體重為（30.25±7.40）g。用MS222 麻醉后，用75%乙醇擦拭黃鱔體表消毒，迅速在無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)解剖，按組織特點(diǎn)分別取黃鱔的胃和腸道[8]，3 尾黃鱔的相同組織放入2 mL 凍存管中混為1 個(gè)樣本，以減少個(gè)體差異的影響。樣品取好后迅速放于液氮中凍存?zhèn)溆?。胃編?hào)為CX，腸道編號(hào)為CY；“開口”組、“不開口”組黃鱔樣品編號(hào)分別為S、T。

1.2 DNA 提取和PCR 擴(kuò)增

用DNA 提取試劑盒提取黃鱔胃、腸微生物總DNA，用Nanodrop 定量DNA，同時(shí)用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA 質(zhì)量。

兩步建庫(kù)法：第一步以DNA 為模板，設(shè)計(jì)帶接頭的引物進(jìn)行PCR，第二步以第一步的PCR 產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR。用16S rRNA V3-4 區(qū)通用引物（338F：5＇-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3＇，806R：5＇-G GACTACHVGGGTWTCTAAT-3＇）進(jìn)行目標(biāo)區(qū)域PCR 擴(kuò)增；擴(kuò)增體系（30 μL）：基因組DNA（50 ±10） ng、338F （10 μmol/L）0.9 μL、806R（10 μmol/L）0.9 μL、KOD FX Neo Buffer 15 μL、dNTP （2 mmol/L each）6 μL、KOD FX Neo 0.6 μL、ddH2O 補(bǔ)至30 μL；PCR 程序：98 ℃2 min，98 ℃30 s，50 ℃30 s，72 ℃60 s，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃5 min，4 ℃直到停止。Solexa PCR（20 μL 體系）：目的區(qū)域PCR 純化產(chǎn)物5 μL、2 μmol/L MPPI-a 2.5 μL、2 μmol/L MPPI-b 2.5 μL、2×Q5 HF MM 10 μL，反應(yīng)條件：98 ℃30 s，98 ℃10 s，65 ℃30 s，72 ℃ 30 s，10 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 30 s；72 ℃5 min；1.8%的瓊脂糖凝膠，電壓120 V，40 min；將PCR 產(chǎn)物根據(jù)電泳定量（ImageJ 軟件）結(jié)果，按照質(zhì)量比1∶1 進(jìn)行混樣；混樣后，采用OMEGA DNA 純化柱進(jìn)行過柱純化；1.8%的瓊脂糖凝膠，120 V 40 min 電泳后，切目的片段并回收；構(gòu)建好的文庫(kù)使用illumina Novaseq6000 PE250 測(cè)序。

1.3 測(cè)序數(shù)據(jù)分析

將測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行處理后利用USEARCH version 10.0 軟件在相似性97%的水平上對(duì)序列進(jìn)行OTU 分析；再利用R 語(yǔ)言工具繪制稀釋性曲線圖、Venn 圖、群落結(jié)構(gòu)圖和熱圖；使用QIIME2 軟件對(duì)樣品Alpha 多樣性指數(shù)進(jìn)行評(píng)估，分析樣品間物種多樣性；使用QIIME 軟件進(jìn)行PCA 分析，比較不同樣品在物種多樣性方面存在的相似程度。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品測(cè)序質(zhì)量分析

基于Illumina Novaseq 測(cè)序及數(shù)據(jù)預(yù)處理共獲得741 382 條有效序列；以97%相似性水平為標(biāo)準(zhǔn)劃分各樣品的可操作分類單元（OTU）數(shù)量（表1）。利用已測(cè)得的rDNA 序列中已知的各OTU 相對(duì)比例與其相對(duì)應(yīng)的OTU 數(shù)量的期望值來(lái)構(gòu)建稀釋性曲線，各樣品曲線都達(dá)到平臺(tái)期（圖1），說(shuō)明隨著測(cè)序深度的增加，測(cè)序量達(dá)到飽和且測(cè)序質(zhì)量比較好、數(shù)據(jù)量合理，測(cè)序的深度基本能夠覆蓋樣品中的所有物種。

2.2 Alpha 多樣性分析

根據(jù)“開口”和“不開口”黃鱔胃腸道微生物OTU 數(shù)量，進(jìn)行Alpha 指數(shù)分析。通過覆蓋率（coverage）來(lái)評(píng)估抽樣的完整性，本研究中各樣品OTUs 的覆蓋率是99.98%～100%，說(shuō)明各樣品中的全部微生物種類幾乎都被檢測(cè)到（表1）。OTU、Chao1 和ACE 表征豐富度，數(shù)值越高，表明群落的總數(shù)越高（即豐富度越高）；Shannon 和Simpson 指數(shù)表征物種多樣性，數(shù)值越高，表明群落的多樣性越高。結(jié)果表明，“不開口”黃鱔胃中微生物群落豐富度和多樣性都較高，“開口”黃鱔腸道中微生物群落豐富度和多樣性都較高。

2.3 Venn 圖分析

為進(jìn)一步分析“開口”與“不開口”黃鱔微生物群落組成的差異，根據(jù)樣品的OTU 數(shù)量繪制Venn圖。如圖2 所示，“開口”組黃鱔胃的OTU 數(shù)量為186 個(gè)，腸道的OTU 數(shù)量為322 個(gè)；“不開口”黃鱔胃的OTU 數(shù)量為311 個(gè)，腸道的OTU 數(shù)量為217個(gè)，這說(shuō)明各試驗(yàn)組黃鱔微生物在OUT 水平上具有一定差異。各試驗(yàn)組共有的OTU 數(shù)量為65 個(gè)，各樣品特有的OTU 數(shù)量分別為44、88、76、42 個(gè)，分別占各自所有OTU 總數(shù)的23.66%、27.33%、24.44%、19.35%。

2.4 PCA 分析

PCA 分析可以反映樣品的差異和距離，樣品間距離越近，則表示這2 個(gè)樣品的組成越相似。試驗(yàn)結(jié)果顯示，4 組黃鱔腸道與胃中的微生物組成相差甚遠(yuǎn)，即均存在顯著性差異（圖3）。

2.5 腸道微生物群落結(jié)構(gòu)和組成分析

樣品中所有OUT 經(jīng)物種注釋，在門和屬的水平分析不同組別的優(yōu)勢(shì)菌種。圖4 為門水平上微生物的相對(duì)豐度，“開口”與“不開口”黃鱔的胃腸道微生物主要由厚壁菌門、變形菌門以及擬桿菌門組成，優(yōu)勢(shì)菌均是厚壁菌門，但菌群比例存在差異。與“開口”組相比，“不開口”黃鱔的胃中厚壁菌門比例減少，變形菌門比例增加；與“開口”組相比，“不開口”黃鱔的腸道中變形菌門顯著減少，擬桿菌門顯著增加。

圖5 為屬水平上微生物的相對(duì)豐度，4 個(gè)組別中優(yōu)勢(shì)菌群均差異顯著。就黃鱔胃而言，“開口”黃鱔優(yōu)勢(shì)菌群為瘤胃球菌屬和霍爾德曼氏菌屬，其占比分別為24.89%、18.30%；而“不開口”黃鱔的優(yōu)勢(shì)菌群為糞桿菌屬和羅氏菌屬，其占比分別為26.85%、15.27%。就黃鱔的腸道而言，“開口”黃鱔優(yōu)勢(shì)菌群為埃希氏菌屬和丹毒梭菌屬，分別占細(xì)菌總數(shù)的16.45%、17.46%；而“不開口”黃鱔的優(yōu)勢(shì)菌群為另枝菌屬與瘤胃球菌屬，分別占細(xì)菌總數(shù)的19.61%、12.72%。

2.6 熱圖分析

對(duì)黃鱔胃腸道微生物在屬水平上進(jìn)行聚類式熱圖分析，由圖6 可以看出，4 組樣品中黃鱔胃腸道微生物主要聚為兩大分支，“開口”黃鱔的胃和“不開口”黃鱔腸道樣品聚為一支，“不開口”黃鱔的胃和“開口”黃鱔腸道樣品聚為一支。

“開口”黃鱔胃中的小桿菌屬、霍爾德曼氏菌、瘤胃菌屬豐度顯著高于其他組；韋榮氏球菌屬、埃希氏菌屬、丹毒梭菌屬和鏈球菌屬在“開口”黃鱔腸道豐度較高。而“不開口”黃鱔的胃豐度較高的菌群為不動(dòng)桿菌屬、克雷伯氏菌、毛螺菌屬和羅氏菌屬。就黃鱔的腸道而言，“不開口”黃鱔腸道豐度較高的菌群為另枝菌屬和瘤胃球菌屬。

3 討 論

魚類的腸道微生物菌落多樣性對(duì)于魚類自身的機(jī)體免疫力、抵抗病害、營(yíng)養(yǎng)吸收和消化等有重要影響[9]。本研究采用了細(xì)菌16S rRNA 高通量測(cè)序技術(shù)分析“開口”和“不開口”黃鱔的胃和腸道的微生物的結(jié)構(gòu)組成，研究結(jié)果顯示“開口”和“不開口”2 種情況下特有的OTU 數(shù)量多，說(shuō)明這2 種情況下黃鱔腸道的細(xì)菌群落組成存在一定的差異。有研究表明，魚類腸道不同部位菌群結(jié)構(gòu)不同，并且食物的改變會(huì)對(duì)魚類腸道微生物菌群產(chǎn)生快速而顯著的影響[10]。本文分析“開口”和“不開口”黃鱔胃和腸道的細(xì)菌群落和腸道微生物多樣性發(fā)現(xiàn)，對(duì)于胃而言，“不開口”黃鱔的胃微生物菌落豐度和物種多樣性都較高。但由于胃只有較強(qiáng)的消化能力，而無(wú)吸收細(xì)胞分布[8]，所以即使“不開口”黃鱔胃中微生物菌落豐度和物種多樣性都較高但依舊無(wú)法吸收營(yíng)養(yǎng)，導(dǎo)致個(gè)體較小。對(duì)于腸道來(lái)說(shuō)，“開口”黃鱔的腸道微生物菌落豐度和物種多樣性都高于“不開口”黃鱔。黃鱔胃和腸道微生物多樣性和豐度存在一定差異，可能是由于胃和腸道的組織結(jié)構(gòu)、消化酶活力等存在不同。胃有較強(qiáng)的消化能力，沒有吸收細(xì)胞分布，黏膜層和肌層的厚度也比腸道薄，而腸道的吸收能力較強(qiáng)，并且其前后段組織也存在差異[8]。胃的蛋白酶和淀粉酶活力也比腸道更高，淀粉酶活力也隨pH 值產(chǎn)生變化，胃的pH 值相比于腸道偏酸，因此酶活力也不同[11]。黃鱔胃和腸道微生物的多樣性和豐度差異可能受這些因素的綜合影響。

本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，“開口”與“不開口”黃鱔的胃和腸道微生物主要由厚壁菌門、變形菌門以及擬桿菌門3 種類群組成，以往研究也表明厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門是魚類腸道微生物中常見的優(yōu)勢(shì)菌群[12]。相比于“開口”黃鱔，“不開口”黃鱔胃中變形菌門、擬桿菌門比例均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，而厚壁菌門的比例則呈下降趨勢(shì)。就黃鱔的腸道而言，“不開口”黃鱔中厚壁菌門與變形菌門的比例相比于“開口”黃鱔都有所減少，而擬桿菌門的比例則上升。各組的具體優(yōu)勢(shì)菌群也存在差異，經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)“開口”黃鱔胃中的厚壁菌門和廣古菌門的豐度顯著高于“不開口”黃鱔?！安婚_口”黃鱔的胃中豐度較高的菌群為疣微菌門。研究表明，腸道中的厚壁菌門對(duì)多糖水解和糖類轉(zhuǎn)運(yùn)有著極重要的作用[13]。

由熱圖可知在屬的水平上，“開口”黃鱔胃中的小桿菌屬、霍爾德曼氏菌屬豐度顯著高于其他組別。韋榮氏球菌屬、埃希氏菌屬、丹毒梭菌屬和鏈球菌屬在“開口”黃鱔腸道豐度較高。這與屬水平上微生物相對(duì)豐度柱狀圖基本一致。致病菌的比例較高，說(shuō)明魚漿投喂的黃鱔患病風(fēng)險(xiǎn)較高?！安婚_口”黃鱔的胃豐度較高的菌群為毛螺菌屬和羅氏菌屬。有研究顯示，腸道內(nèi)毛螺菌屬和羅氏菌屬數(shù)量增多與腸道炎癥密切相關(guān)[14]。因此，推測(cè)“不開口”的黃鱔因?yàn)殚L(zhǎng)期“不開口”攝食導(dǎo)致腸道炎癥。熱圖和相對(duì)豐度柱狀圖都顯示“不開口”黃鱔腸道豐度較高的菌群為另枝菌屬和瘤胃球菌屬。資料顯示，另枝菌屬的失衡也與腸道炎癥和病變相關(guān)[15]，而瘤胃球菌則與肝臟損傷有著緊密聯(lián)系[16]。因此，推測(cè)黃鱔“不開口”可能會(huì)導(dǎo)致其胃和腸道內(nèi)諸如毛螺菌屬、羅氏菌屬、另枝菌屬和瘤胃球菌屬等有害菌群失衡。

研究表明，水蚯蚓干品粗蛋白含量約為62%，必需氨基酸含量高達(dá)35%，是理想的“開口”餌料[3]。人工配合飼料動(dòng)物性原料所占比例越高，黃鱔魚種培育規(guī)格越大，成活率越高，效果越好[17]。且在飼料中添加1.0%復(fù)方中草藥對(duì)黃鱔生長(zhǎng)、非特異性免疫、腸道消化酶活性及魚體品質(zhì)有明顯的促進(jìn)和改善作用[18]。也有研究表明，當(dāng)飼料中甜菜堿添加量達(dá)到1.15～2.10 g/100 g 時(shí)，黃鱔生長(zhǎng)率最高，飼料系數(shù)最低，肝臟脂肪含量較少，這與用動(dòng)物性餌料養(yǎng)殖的效果基本接近[19-20]。另外，飼料中添加0.2%復(fù)合益生菌或投喂含有枯草芽孢桿菌益生菌都能在一定程度上提高黃鱔的免疫力，促進(jìn)魚體生長(zhǎng)[21-22]；添加枯草芽孢桿菌、植物乳桿菌和釀酒酵母菌復(fù)合益生菌還可改善黃鱔肝臟、胃及腸道的結(jié)構(gòu)，提高腸道消化酶活力和抗氧化能力[23]。