肖曉杰，丁明星，齊智利，胡曼麗，張 鑫*

1.贛南創(chuàng)新與轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院/ 心腦血管疾病防治教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/ 贛南醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院/ 贛南醫(yī)學(xué)院，贛州 341000；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，武漢 430070；3.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，武漢 430070

作為人體最大的器官，皮膚是隔離宿主體內(nèi)與外環(huán)境的第一道屏障，同時(shí)擁有豐富的免疫細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)，對(duì)于維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要[1]。然而，皮膚問題已經(jīng)給全球健康帶來了巨大負(fù)擔(dān)，皮膚病是造成非致命性損傷的重要原因之一[2]。作為人類伴侶的寵物，皮膚疾病也是頭號(hào)健康問題，其中寵物瘙癢及皮炎最常見。特應(yīng)性皮炎（atopic dermatitis，AD）是一種由多因素誘導(dǎo)的慢性復(fù)發(fā)性和炎癥性皮膚病，臨床表現(xiàn)以瘙癢為主，研究發(fā)現(xiàn)寵物AD 的臨床、免疫學(xué)、組織學(xué)和病理學(xué)特征與人類相似[3]。隨著我國(guó)寵物數(shù)量井噴式增長(zhǎng)，AD 在寵物犬中的發(fā)病趨勢(shì)不斷增加，寵主在寵物皮炎及瘙癢等疾病防治方面承受較大的經(jīng)濟(jì)壓力，開發(fā)有效的寵物皮膚修復(fù)藥物和功能性食品具有重要的寵物臨床意義和社會(huì)意義[4]。本研究自主研發(fā)了一款含有天然植物成分的犬低敏處方糧，為探究其對(duì)犬皮炎的防治調(diào)理效果，采用2, 4-二硝基氯苯（dinitrochlorobenzene，DNCB）誘導(dǎo)建立犬AD 模型，探討低敏處方糧對(duì)犬AD 的功效。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

試驗(yàn)動(dòng)物為15 只健康比格犬，年齡為8～10 月齡，12 h 明暗交替飼養(yǎng)，自由飲水，溫度22～26 ℃適應(yīng)性飼養(yǎng)1 個(gè)月。所有參加試驗(yàn)的犬均應(yīng)通過一般身體檢查和皮膚病學(xué)檢查，被判斷為健康且沒有接受任何可能影響結(jié)果的藥物治療。定期采集血液樣本進(jìn)行評(píng)估，以確保犬的健康。所有的犬飼養(yǎng)在潔凈環(huán)境中，并且在致敏之前未出現(xiàn)過敏性皮炎的臨床癥狀。本試驗(yàn)經(jīng)贛南醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)研究倫理委員會(huì)審批通過，所有動(dòng)物操作均符合贛南醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的操作指南。

1.2 試 劑

補(bǔ)骨脂提取物（西安瑞林生物科技有限公司），DNCB（安耐吉化學(xué)），無水乙醇（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），伊紅（BASO），蘇木素（谷歌生物）。對(duì)照組日糧為試驗(yàn)犬全價(jià)配合糧，犬低敏處方糧由贛南創(chuàng)新與轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院和江西惠寵科技有限公司聯(lián)合研發(fā)。

1.3 儀 器

血液分析檢測(cè)儀（美國(guó)Abaxis），3110 全自動(dòng)生化分析儀（日本，Hitachi），石蠟包埋機(jī)（德國(guó)Leica），脫水機(jī)（德國(guó)Leica），切片機(jī)（德國(guó)Leica），Micro 17R 高速離心機(jī)（美國(guó)Thermo）。

1.4 處方糧制備方法

低敏處方糧配方營(yíng)養(yǎng)值確認(rèn)流程：犬低敏處方糧的配方目標(biāo)營(yíng)養(yǎng)值設(shè)計(jì)參考國(guó)標(biāo)《GB/T 31216-2014 全價(jià)寵物食品-犬糧》和美國(guó)飼料管理協(xié)會(huì)（AAFCO），針對(duì)寵物犬過敏機(jī)制和營(yíng)養(yǎng)需求所制定；選擇低致敏性、高蛋白、低脂肪原料進(jìn)行配方制作，嚴(yán)格控制原料種類，減少過敏原，并保證所有原料和添加劑符合《飼料原料目錄》《飼料添加劑目錄》規(guī)定。

試驗(yàn)用犬低敏處方糧生產(chǎn)流程：使用粉碎機(jī)對(duì)大顆粒原料進(jìn)行粉碎，過孔徑為0.25 mm 篩后按配方進(jìn)行稱取，將物料加入混合機(jī)內(nèi)攪拌均勻。調(diào)整膨化機(jī)的溫度、進(jìn)料速度、轉(zhuǎn)刀速度，進(jìn)行膨化制粒。將擠壓膨化后的顆粒物料放置于烘干機(jī)中，60～70 ℃的條件下干燥3～4 h，使其水分含量降至5%～10%。將干燥好的犬糧裝在真空包裝袋內(nèi)，將真空時(shí)間調(diào)整為6 s，使用真空包裝機(jī)進(jìn)行真空抽提包裝。

1.5 動(dòng)物模型

15 只比格犬隨機(jī)分為3 組：對(duì)照組（n=5）、模型組（n=5）、補(bǔ)骨脂處方糧組（n=5）。所有犬每隔1 d在肩胛區(qū)皮膚中皮內(nèi)接種 0.1 mL 0.1% DNCB，DNCB 用丙二酮溶解，共注射14 次。在完成最后1次注射2 周后，試驗(yàn)犬在腹部區(qū)域的皮膚上接受貼斑試驗(yàn)。犬腹部剃毛后，模型組及處方糧組犬進(jìn)行5%的DNCB 乙醇貼片誘導(dǎo)皮炎模型，每只犬貼片8個(gè)，將貼片放置并固定于犬剃毛處，持續(xù)作用24 h，對(duì)照組貼8 片僅含無水乙醇的貼片。貼斑后，將處方糧組的犬糧更換為富含補(bǔ)骨脂的低敏處方糧，模型組和對(duì)照組繼續(xù)喂食普通日糧。對(duì)照組和模型組每天09:00、15:00 進(jìn)行2 次飼喂，飼喂量如表1 所示，持續(xù)喂養(yǎng)4 周。試驗(yàn)期間，記錄每日飲食量。

表1 犬每日飼喂量

1.6 評(píng)價(jià)指標(biāo)

1）臨床檢查。在試驗(yàn)前、貼斑前、試驗(yàn)終點(diǎn)進(jìn)行體重評(píng)價(jià)。貼斑試驗(yàn)后每隔1 d 進(jìn)行1 次臨床檢查，持續(xù)2 周。所有犬經(jīng)過專業(yè)獸醫(yī)進(jìn)行的嚴(yán)格臨床檢查，主要對(duì)皮膚炎性病變程度以及犬瘙癢程度進(jìn)行評(píng)分[5]。每天1 次，對(duì)貼斑部位皮膚進(jìn)行宏觀病變?cè)u(píng)分。四分制：0、1、2、3 分，所有觀察到的病變都被拍照并描述其位置、特征和嚴(yán)重程度。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下：0，無明顯反應(yīng)；1 分，紅斑；2 分，紅斑、硬結(jié)或水腫（丘疹）；3 分，紅斑伴起泡或反應(yīng)更嚴(yán)重。每天2 次，間隔6 h，觀察犬對(duì)瘙癢的行為表現(xiàn)，進(jìn)行瘙癢程度評(píng)分，具體如下：0，沒有瘙癢；1～2 分，輕度瘙癢；3～4 分，中度瘙癢；5 分，持續(xù)而劇烈的瘙癢。

2）血液學(xué)分析。于0 周-24 h（貼斑試驗(yàn)24 h后）和4 周（貼斑后4 周）采集血液進(jìn)行血常規(guī)和血生化分析，血液樣本由惠康動(dòng)物檢測(cè)（武漢）有限公司醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)分析。

3）皮膚組織取材分析。0 周-24 h 和4 周取少量皮膚樣本，并對(duì)取材部位進(jìn)行縫合。采集后立即將組織固定于10%福爾馬林中，用于后期H＆E 染色。

4）Q-PCR 試驗(yàn)檢測(cè)炎癥因子表達(dá)。0 周-24 h和4 周取皮膚樣本，樣品液氮速凍后保存，用于RNA 提取及Q-PCR 檢測(cè)分析。設(shè)計(jì)犬的炎癥因子引物，分析處方糧組、模型組與對(duì)照組之間的基因表達(dá)差別，引物如下：白細(xì)胞介素6（IL-6），F(xiàn)：CTCCTGACCCAACCACAGAC R：TCCTGACCCAACCACAGAC R：GGAAATCCTCCAGACTCCGC；白細(xì)胞介素4 （IL-4），F(xiàn)：CCTCACAGCGAGAAACGACT，R：ATCTGCCGCAGTACAGTAGC；腫瘤壞死因子-α（Tnf-α）F：AAGAGCTCCCAAATGGCCTC，R：CTCAGCTTCGGGGTTTGCTA。

1.7 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較，數(shù)據(jù)指標(biāo)分析采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，組間采用雙尾t檢驗(yàn)或Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P＜0.05 認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 低敏處方糧評(píng)價(jià)試驗(yàn)流程

如圖1 所示，比格犬在接受0.1% DNCB 致敏后，模型組和處方糧組采用高濃度5% DNCB 進(jìn)行貼斑誘導(dǎo)皮膚超敏反應(yīng)，對(duì)照組只貼含對(duì)照溶劑的貼斑。貼斑后，對(duì)照組和模型組繼續(xù)喂食普通日糧，處方糧組更換飼料為補(bǔ)骨脂處方糧，直至試驗(yàn)結(jié)束。

2.2 低敏處方糧成分含量

表2 為低敏處方糧各營(yíng)養(yǎng)成分含量。

表2 低敏處方糧營(yíng)養(yǎng)成分含量

2.3 低敏處方糧對(duì)犬皮炎模型的影響

1）低敏處方糧對(duì)皮炎模型犬體重的影響。在試驗(yàn)前、貼斑前及終末時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行犬體重評(píng)價(jià)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對(duì)照組、模型組、處方糧組組間體重均一，且不同時(shí)間點(diǎn)動(dòng)物體重穩(wěn)定，各組間無顯著差異（表3）。

表3 試驗(yàn)動(dòng)物體重 kg

2）低敏處方糧對(duì)犬皮炎模型血常規(guī)的影響。如表4，在試驗(yàn)前后分析犬血常規(guī)，處方糧喂養(yǎng)對(duì)犬血液指標(biāo)改變不顯著，也證實(shí)處方糧的安全性。

表4 0 周-24 h 與4 周各組血液學(xué)檢測(cè)結(jié)果

3）低敏處方糧對(duì)犬皮炎模型血生化的影響。由表5 可知，與對(duì)照組及模型組相比，處方糧組0 周和4 周時(shí)大部分血生化指標(biāo)，特別是肝腎功能指標(biāo)均未見明顯異常，結(jié)合整個(gè)試驗(yàn)中的體重變化，說明低敏處方糧對(duì)犬的生理指標(biāo)無顯著影響，進(jìn)一步證實(shí)處方糧的安全性。

表5 0 周-24 h 和4 周各組血生化檢測(cè)結(jié)果

4）低敏處方糧對(duì)犬皮炎模型炎癥反應(yīng)的影響。試驗(yàn)犬在貼斑后24 h 開始出現(xiàn)皮膚紅腫、瘙癢等癥狀，且皮膚紅腫處在貼斑后7 d 出現(xiàn)皮膚皰疹、大量滲出物等嚴(yán)重皮炎現(xiàn)象，而后逐漸出現(xiàn)結(jié)痂的皮炎癥狀。同模型組相比，低敏處方糧組犬在連續(xù)喂食5～7 d 后皮炎表現(xiàn)減輕，具體評(píng)價(jià)指標(biāo)為皮炎病變?cè)u(píng)分（圖2-a）以及皮膚瘙癢評(píng)分（圖2-b）明顯降低。

5）低敏處方糧對(duì)犬皮炎模型皮膚病理的影響。貼斑后24 h（0 周-24 h），與對(duì)照組相比，模型組與處方糧組皮膚出現(xiàn)病理結(jié)構(gòu)改變，主要包括角質(zhì)層不完整，顆粒層細(xì)胞排列不規(guī)則，真皮層炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，主要以淋巴細(xì)胞為主。貼斑后4 周，模型組犬皮膚角質(zhì)層顯著增厚，表皮層增厚，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)較之前減輕，處方糧喂養(yǎng)4 周后真皮層增厚及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)情況有所改善（圖3）。

6）低敏處方糧對(duì)犬皮炎模型炎癥基因表達(dá)的影響。如圖4 所示，與對(duì)照組比較，模型組犬皮膚組織中炎性因子的表達(dá)顯著升高，處方糧喂食4 周后IL-4、IL-6、TNFα等炎癥基因表達(dá)顯著下調(diào)，說明處方糧喂養(yǎng)能改善皮膚組織的炎癥反應(yīng)，降低敏感性。

3 結(jié) 語

特應(yīng)性皮炎（atopic dermatitis，AD）是一種由多因素誘導(dǎo)的慢性復(fù)發(fā)性和炎癥性皮膚病，臨床表現(xiàn)以瘙癢為主，AD 是人類和寵物皮膚病中最常見的疾病[6]。目前認(rèn)為，犬AD 受遺傳和環(huán)境因素影響，是皮膚表皮屏障受損和對(duì)環(huán)境過敏原/抗原的異常免疫反應(yīng)以及皮膚微生物組改變相互作用的結(jié)果[7]。犬AD 的進(jìn)展與皮膚及循環(huán)淋巴細(xì)胞群的變化有關(guān)，在急性炎癥中，促炎因子能誘導(dǎo)Th2 細(xì)胞反應(yīng)，在慢性反應(yīng)時(shí)，可以觀察到CD4、CD8 細(xì)胞的改變而引起Th1/Th2 失衡[8]。當(dāng)前，針對(duì)AD 往往采用包括皮膚屏障修復(fù)、抗炎、免疫治療在內(nèi)的多模式治療，但相關(guān)治療方案仍缺少有力的科研論證[9]。已有證據(jù)表明，富含有必需氨基酸、益生菌、益生元、酶解蛋白成分等的膳食補(bǔ)充劑對(duì)犬AD 具有保護(hù)作用[10]。有證據(jù)表明，口服益生菌在AD 患者中能起到積極作用，揭示了腸道-皮膚軸的存在，為AD 的預(yù)防及治療提供思路[11]，提示飲食因素能夠改變腸道微生物群而增強(qiáng)皮膚健康[12]，為皮膚健康問題的保護(hù)、預(yù)防和治療提供了新思路。筆者所在課題組研發(fā)了一款低敏處方糧，原料上選擇低敏且經(jīng)過水解的蛋白，降低食物過敏發(fā)生率；其次，營(yíng)養(yǎng)組成上采用易消化蛋白、適宜脂肪、低纖維、高能量濃度，減少犬貓采食量，減輕腸道負(fù)擔(dān)；同時(shí)，添加不飽和脂肪酸，強(qiáng)化皮膚屏障，支持敏感犬貓的皮膚健康。在試驗(yàn)過程中，模型組和處方糧組每只試驗(yàn)犬的飼喂量都經(jīng)過計(jì)算，保證滿足每只犬的每日靜止能量需求，在完全采食的情況下，模型組試驗(yàn)犬體重稍有降低，可能是炎癥反應(yīng)影響了腸胃功能。而處方糧組的犬體重未有下降，可能原因是試驗(yàn)糧選用了易消化的水解蛋白，通過調(diào)整高能量密度降低了采食量和腸道負(fù)擔(dān)，并在此基礎(chǔ)上添加不飽和脂肪酸和B 族維生素強(qiáng)化了腸道屏障，因此，能在同樣滿足能量需求的情況下保持體重。

補(bǔ)骨脂（Psoralea corylifoliaLinn.）是豆科植物補(bǔ)骨脂的成熟果實(shí)，是中醫(yī)常用的藥材，具有抗炎、抗菌、抗腫瘤、抗風(fēng)濕等活性，臨床上常用來治療白癜風(fēng)、牛皮癬等皮膚疾病[13-14]。補(bǔ)骨脂中主要含有香豆素、單萜酚、黃酮、苯并呋喃類等活性成分，其中補(bǔ)骨脂素（psoralen）屬于其中的呋喃香豆素類化合物，能夠調(diào)節(jié)Th1/Th2 淋巴細(xì)胞平衡，促進(jìn)TNF-α、IL-6、IL-1β 釋放，發(fā)揮顯著的抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用[15]。補(bǔ)骨脂作為常用的飼料植物類添加物，廣泛用于獸用功能性飼料的開發(fā)[16]。本研究采用AD 犬模型，證實(shí)了含補(bǔ)骨脂低敏處方糧在長(zhǎng)期喂食過程中對(duì)犬AD 的炎癥癥狀具有明顯的改善作用，提示基于營(yíng)養(yǎng)學(xué)、抗炎、抗免疫等的食品開發(fā)具有較好的前景。