李曉婧， 焦勇杰， 李超婧， 王富軍， 王 璐

(東華大學(xué) a.紡織面料技術(shù)教育部重點實驗室，b.產(chǎn)業(yè)用紡織品教育部工程研究中心，c.紡織學(xué)院， 上海 201620)

傷口快速有效愈合是整個醫(yī)學(xué)界關(guān)注的問題。成纖維細(xì)胞是負(fù)責(zé)生產(chǎn)、重塑和維持細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的細(xì)胞[1]。在傷口愈合早期，成纖維細(xì)胞通過向肌成纖維細(xì)胞分化并分泌ECM獲得收縮力以閉合傷口[2-4]。傷口上皮化完成后，若肌成纖維細(xì)胞未及時凋亡，會產(chǎn)生過量的ECM從而形成瘢痕組織[2-6]。因此，探究成纖維細(xì)胞-肌成纖維細(xì)胞分化對于損傷后結(jié)締組織的生理重建和纖維化病變研究具有重要意義[7-9]。文獻(xiàn)報道[2,10-11]指出，成纖維細(xì)胞-肌成纖維細(xì)胞的分化受到生化和物理因素的影響。而生物體內(nèi)細(xì)胞所在的動態(tài)微環(huán)境中存在很多會影響細(xì)胞行為，如基因/蛋白質(zhì)表達(dá)的物理和生化因素[12-13]。其中，物理因素如施加的外力或ECM的結(jié)構(gòu)和力學(xué)性能，特別是ECM納米和微米級表面拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，對于調(diào)控細(xì)胞行為而言最為有效、簡便與穩(wěn)定[14]。

串晶結(jié)構(gòu)是由中間纖維狀晶體與垂直于纖維軸方向的片晶構(gòu)成的結(jié)晶結(jié)構(gòu)[15]，其中由溶液孵育法誘導(dǎo)的串晶結(jié)構(gòu)因操作簡單、可用材料廣泛、片晶尺寸和密度可控，可便捷地調(diào)控材料的表面結(jié)構(gòu)、力學(xué)和熱學(xué)性能，影響細(xì)胞的黏附、增殖等行為，被廣泛應(yīng)用于組織工程[16-17]。Guo等[16]發(fā)現(xiàn)，靜電紡聚己內(nèi)酯(PCL)串晶結(jié)構(gòu)纖維支架可為內(nèi)皮細(xì)胞提供適宜的生長微環(huán)境，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞遷移和增殖，有效改善血管內(nèi)皮化。Liu等[18]制備了負(fù)載BMP-2的電紡PCL串晶結(jié)構(gòu)纖維支架，研究表明除化學(xué)因素外，粗糙度較大的串晶結(jié)構(gòu)纖維也會影響干細(xì)胞的募集、遷移和分化。針對串晶結(jié)構(gòu)對各類細(xì)胞行為影響的文獻(xiàn)研究較多，但鮮有關(guān)于串晶結(jié)構(gòu)片晶密度對成纖維細(xì)胞行為的影響及其機(jī)制的研究報道。

靜電紡絲是一種簡單而有效的納米纖維成型技術(shù)，調(diào)節(jié)靜電紡絲參數(shù)可以制備具有不同直徑和結(jié)構(gòu)的纖維支架[2,19]。本研究采用靜電紡絲技術(shù)結(jié)合溶液孵育結(jié)晶法制備表面光滑和不同片晶密度的微/納復(fù)合串晶結(jié)構(gòu)纖維支架，根據(jù)纖維支架理化性能表征結(jié)果及體外細(xì)胞試驗結(jié)果，分析拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)對成纖維細(xì)胞增殖、表型以及成纖維細(xì)胞分化和基質(zhì)合成基因表達(dá)的影響，以期了解串晶結(jié)構(gòu)纖維支架在成纖維細(xì)胞分化中的作用及其作為傷口修復(fù)和基質(zhì)再生支架的潛力。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

PCL(Mw=8 000 g/mol)，三氯甲烷(CF)、N-N二甲基甲酰胺(DMF)、乙酸戊酯，Sigma試劑有限公司；六孔板，F(xiàn)lexcell公司；人皮膚成纖維細(xì)胞(HFF-1)，中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；高糖培養(yǎng)基(不含谷氨酰胺)、胎牛血清(FBS)、Trizol細(xì)胞裂解液，賽默飛世爾科技(中國)有限公司；活/死染料，上海凱基生物技術(shù)股份有限公司；細(xì)胞計數(shù)試劑盒(CCK-8試劑盒)，上海翊圣生物科技有限公司；EasyScript?One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix，北京全式金生物公司。

1.2 不同拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)纖維膜的制備

將質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%的PCL溶入CF和DMF的混合溶劑(VCF∶VDMF=9∶1)中，磁力攪拌至少16 h形成均一穩(wěn)定的紡絲液進(jìn)行靜電紡絲。靜電紡絲參數(shù)：針頭23 G，正電壓20 kV，負(fù)電壓1.5 kV，接收距離18 cm，推注速率1 mL/h，溫度23～27 ℃，相對濕度40%～50%。紡絲完成后將纖維膜放在37 ℃的真空烘箱中干燥24 h，記PCL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%的光滑纖維膜為P12。在此基礎(chǔ)上采用溶液孵育結(jié)晶方法獲得具有不同片晶密度的串晶結(jié)構(gòu)纖維膜。具體步驟：稱取不同質(zhì)量的PCL溶于乙酸戊酯中，制得質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%和1.0%的PCL結(jié)晶稀溶液，在60 ℃下加熱3 h使PCL完全溶解，冷卻至室溫后將5 cm×5 cm的纖維膜分別浸泡在0.5%和1.0%稀溶液中15 min，分別記成型的串晶結(jié)構(gòu)纖維膜為P12-SK1和P12-SK2。

1.3 理化性能測試與表征

1.3.1 微觀形貌

通過場發(fā)射掃描電鏡(FE-SEM，Hitachi SU8010型，日本)觀察不同拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)纖維膜的微觀形貌，并采用Image J軟件測試?yán)w維直徑，每種纖維膜樣品選取100根纖維。

1.3.2 表面粗糙度

研究[14]表明納米級表面粗糙度會對細(xì)胞的黏附產(chǎn)生影響，而黏附是貼壁細(xì)胞在基質(zhì)上存活、生長和增殖的前提，因此納米級粗糙度對細(xì)胞增殖和分化等活動有著重要影響。采用原子力顯微鏡(Keysight 5500 AFM-SPM型，美國)分析樣品的表面粗糙度，掃描面積為25 μm×25 μm。

1.3.3 水接觸角和結(jié)晶度

采用OCA15EC型接觸角儀(Dataphysics型，德國)測量樣品的水接觸角(WCA)以評估纖維膜的表面親水性。滴加2 μL PBS液滴接觸纖維膜10 s后拍照，每個樣品測量5次，結(jié)果取平均值。采用X射線衍射儀(XRD，D/Max-2550 PC Rigaku型，日本)測試并計算纖維膜的結(jié)晶度。

1.3.4 力學(xué)性能

纖維支架的力學(xué)性能受單絲力學(xué)性能和纖維堆積密度的綜合影響[20]，而支架的力學(xué)性能和結(jié)構(gòu)特性在控制細(xì)胞增殖和遷移方面起著重要作用[21]。為探究支架的力學(xué)性能在調(diào)控細(xì)胞行為方面的作用，采用動態(tài)機(jī)械分析儀(TA Q800型，美國)測定樣品的力學(xué)性能。樣品在37 ℃下平衡3 min后以1 N/min速率拉伸至樣品斷裂。按照式(1)計算斷裂強(qiáng)度，選取應(yīng)力-應(yīng)變曲線的線性部分按照式(2)計算彈性模量。

σ=F/S

(1)

式中：σ為斷裂強(qiáng)度，MPa；F為斷裂強(qiáng)力，N；S為試樣橫截面積，mm2。

E=σ/ε

(2)

式中：E為彈性模量，MPa；ε為試樣應(yīng)變。

1.4 體外細(xì)胞行為表征

1.4.1 細(xì)胞毒性

HFF-1細(xì)胞用于探索不同纖維膜的細(xì)胞活力。將HFF-1細(xì)胞(4×104mL-1)種植在滅菌后的纖維膜樣品上培養(yǎng)1 d，無樣品組作為空白對照，對活/死細(xì)胞進(jìn)行染色，采用Nikon Ti-s型生物倒置熒光顯微鏡拍照。

1.4.2 細(xì)胞增殖

將滅菌后的樣品和細(xì)胞(12×104mL-1)在6孔板中預(yù)培養(yǎng)72 h，隨后再培養(yǎng)1和3 d進(jìn)行細(xì)胞增殖測試，每48 h更換培養(yǎng)基，采用CCK-8法進(jìn)行細(xì)胞增殖測定，讀取450 nm處的吸光度。

1.4.3 細(xì)胞形態(tài)

細(xì)胞表型作為細(xì)胞-材料相互作用的指標(biāo)之一，基質(zhì)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)可以對細(xì)胞的鋪展產(chǎn)生顯著影響。將滅菌后的樣品和細(xì)胞在6孔板中預(yù)培養(yǎng)72 h，再繼續(xù)培養(yǎng)3 d，固定細(xì)胞后，配制12個梯度(10%，20%，30%，40%，50%，60%，70%，75%，80%，90%，95%，100%)的乙醇溶液對細(xì)胞進(jìn)行脫水處理。干燥后鍍金處理，采用場發(fā)射掃描電鏡觀測細(xì)胞形態(tài)。

1.4.4 基因表達(dá)

轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β1)/Smad信號通路是調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞分化以及膠原形成的經(jīng)典通路，是誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞分化最有效的細(xì)胞因子[22-23]。成纖維細(xì)胞具有力學(xué)敏感性和收縮性，在力學(xué)刺激下，成纖維細(xì)胞分泌TGF-β1到ECM中誘導(dǎo)膠原合成和成熟并參與α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)的合成，α-SMA具有強(qiáng)大收縮力，可以促進(jìn)傷口收縮和組織再生[24-25]。但在傷口愈合后期，過量的基質(zhì)蛋白會導(dǎo)致組織變硬，產(chǎn)生瘢痕。瘢痕組織分為兩種：增生性瘢痕組織主要是Ⅲ型膠原蛋白(COL Ⅲ)升高，瘢痕疙瘩則是I型膠原蛋白(COL I)和COL Ⅲ過度紊亂[26]。研究[2,27]表明，ECM的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)在成纖維細(xì)胞的表型、分化，以及膠原蛋白和TGF-β1的合成和分泌等方面有著重要作用。因此，為探究串晶結(jié)構(gòu)對成纖維細(xì)胞行為的影響，使用qPCR(quantitative polymerase chain reaction)檢測誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞分化和參與基質(zhì)合成膠原的基因表達(dá)。

使用Trizol試劑分離總RNA。采用EasyScript?One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix合成第一鏈cDNA(反轉(zhuǎn)錄)。所測基因及其相應(yīng)合成引物的詳細(xì)信息見表1。再采用QuantStudioTM3型Real-Time PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，最后對所得qPCR數(shù)據(jù)中的Ct值進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。采用2-ΔΔCt相對定量分析方法進(jìn)行處理：將各試驗組基因的Ct值與相應(yīng)β-肌動蛋白(β-actin)的Ct值相減，記所得相對值為ΔCt，再將此ΔCt值與所選對照(P12)的ΔCt相對值相減，所得相對值記為ΔΔCt，最后求得2-ΔΔCt即為相對RNA水平。

表1 qPCR引物序列Table 1 Primer sequences used for quantitative polymerase chain reaction

1.5 統(tǒng)計分析

定量數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差形式表示，組間統(tǒng)計分析采用單因素方差分析(ANOVA)。統(tǒng)計結(jié)果的顯著性水平：***表示p<0.001；**表示p<0.01；*表示p<0.05。

2 結(jié)果與討論

2.1 形貌分析

不同表面拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)纖維支架SEM圖如圖1所示。由圖1(a)可知，成功制備了直徑均勻且無串珠的光滑纖維，且隨著稀溶液中PCL質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，串晶結(jié)構(gòu)纖維直徑逐漸增大，分別為P12 (1.33±0.15) μm、P12-SK1 (1.82±0.17) μm、P12-SK2 (2.30±0.26) μm。PCL分子從溶液中析出并附著在纖維表面，在原有纖維上外延生成納米結(jié)晶結(jié)構(gòu)，隨著PCL質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，稀溶液中的PCL分子與纖維接觸位點增多，導(dǎo)致纖維表面結(jié)構(gòu)結(jié)晶密度增大，但由于幾何尺寸限制，片晶取向隨著纖維直徑的增大而降低[28-31]。

圖1 不同表面拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)纖維支架SEM圖Fig.1 SEM images of fiber scaffolds with different surface topologies

2.2 粗糙度

圖2為不同表面拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)纖維支架的原子力圖。纖維支架表面粗糙度隨稀溶液中PCL質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加從(0.71±0.13) μm增加到(0.85±0.10) μm和(1.04±0.15) μm。這是因為隨著PCL質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，溶液中有更多準(zhǔn)備結(jié)晶的PCL鏈聚集在纖維周圍，使得PCL鏈接觸到纖維的可能性增加，致使纖維支架表面粗糙度增大[16]。

圖2 不同表面拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)纖維支架的AFM 3D視圖Fig.2 AFM 3D views of fiber scaffolds with different surface topologies

2.3 結(jié)晶度和接觸角

通過XRD測試了不同表面拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)纖維支架的結(jié)晶度，試驗結(jié)果顯示，隨著稀溶液中PCL質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，結(jié)晶度從(30.82±16.10)%增加到(38.43±3.73)%和(45.97±2.90)%。這是由于稀溶液中PCL鏈含量增加導(dǎo)致纖維支架的結(jié)晶度隨聚合物中己內(nèi)酯含量的增加而增加[28]。

聚合物支架的表面特性是控制細(xì)胞反應(yīng)的關(guān)鍵因素，接觸角決定支架的表面潤濕性，進(jìn)而影響?zhàn)B分?jǐn)U散、蛋白質(zhì)滲透以及細(xì)胞和基質(zhì)之間的黏附[21,28,32]，因此采用接觸角探究支架的表面潤濕性。隨著稀溶液中PCL質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，P12-SK1和P12-SK2接觸角分別從P12(132.18±1.68)°降低為(128.25±2.49)°和(126.54±0.93)°，這可能是因為串晶結(jié)構(gòu)使纖維間距增加導(dǎo)致水滴更容易滲透，從而顯示出較小的水接觸角[30]。但由于所有支架都是疏水的，且變化較小，因此更有意義的是探究表面拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)對細(xì)胞行為的影響。

2.4 力學(xué)性能

不同表面拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)纖維支架的力學(xué)性能如圖3所示。由圖3可知，與光滑纖維相比，串晶結(jié)構(gòu)纖維可以提高材料的彈性模量和斷裂強(qiáng)度，彈性模量從(2.66±0.13) MPa增加到(4.38±0.53)和(9.24±1.20) MPa，斷裂強(qiáng)度從(1.23±0.12) MPa增加到(1.43±0.09)和(2.17±0.22) MPa。P12-SK2彈性模量和斷裂強(qiáng)度增加顯著,這是因為片晶尺寸過大，造成纖維之間機(jī)械互鎖，導(dǎo)致強(qiáng)力過度增加。研究[33]證明串晶結(jié)構(gòu)可提高纖維膜整體的力學(xué)性能。與P12相比，P12-SK1和P12-SK2斷裂伸長率雖然有所下降，但不存在顯著性差異。

圖3 不同表面拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)纖維支架的力學(xué)性能Fig.3 Mechanical properties of fiber scaffolds with different surface topologies

2.5 細(xì)胞毒性

對支架進(jìn)行活/死細(xì)胞染色，結(jié)果如圖4所示，其中活細(xì)胞顯示綠色熒光。培養(yǎng)1 d后，3個試驗組支架上的細(xì)胞與圖4(d)空白對照組無差異，細(xì)胞生長狀態(tài)良好，表明PCL光滑纖維以及串晶結(jié)構(gòu)纖維支架的生物相容性好，為細(xì)胞提供了良好的生存環(huán)境。

圖4 在不同表面拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)纖維支架上培養(yǎng)的HFF-1 細(xì)胞活/死染色熒光圖Fig.4 Fluorescence images of HFF-1 live/dead cells cultured on fiber scaffolds with different surface topologies

2.6 細(xì)胞增殖

在不同表面拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)纖維膜上預(yù)培養(yǎng)72 h后再培養(yǎng)1、3 d的HFF-1細(xì)胞增殖情況如圖5所示。由圖5可知：所有支架的吸光度均隨時間增加而增加，表明光滑和串晶結(jié)構(gòu)纖維具有良好的生物相容性，均支持HFF-1細(xì)胞生長。但P12上的成纖維細(xì)胞呈現(xiàn)過度增殖趨勢，其1、3 d的吸光度分別是空白對照組的1.63和1.54倍。研究[25]表明成纖維細(xì)胞的持續(xù)激活會增強(qiáng)細(xì)胞增殖，促使ECM過度沉積，導(dǎo)致組織纖維化和瘢痕形成。因此，串晶結(jié)構(gòu)對成纖維細(xì)胞的過度增殖有抑制作用，在抑制纖維化領(lǐng)域有潛在的應(yīng)用。

圖5 不同表面拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)纖維支架上的HFF-1細(xì)胞增殖情況Fig.5 Proliferation of HFF-1 cells on fiber scaffolds with different surface topologies

2.7 細(xì)胞形態(tài)

改變ECM表面拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)是一種成熟的控制細(xì)胞表型的方法。圖6為HFF-1細(xì)胞在不同表面拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)上的表面形態(tài)。由圖6可知，細(xì)胞在纖維基質(zhì)上鋪展面積大且分泌較多的ECM，尤其是微/納復(fù)合的P12-SK1，細(xì)胞鋪展良好。而P12-SK2上的細(xì)胞收縮，鋪展面積小，可能是因為纖維膜片晶密度過大，類似2 D致密的表面結(jié)構(gòu)抑制了整合素的表達(dá)，從而抑制了細(xì)胞的鋪展[25]。

圖6 不同表面拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)纖維支架的HFF-1細(xì)胞形態(tài)Fig.6 Morphology of HFF-1 cells on fiber scaffolds with different surface topologies

2.8 基因表達(dá)

圖7為HFF-1細(xì)胞在不同表面拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)上的纖維化基因和基質(zhì)重塑基因表達(dá)。由圖7可知，隨著培養(yǎng)時間的增加，基質(zhì)中的基因表達(dá)均有所增加，表明拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)可以觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)化，將物理信號轉(zhuǎn)化為影響細(xì)胞基因/蛋白表達(dá)的生化信號。細(xì)胞可以通過整合素傳導(dǎo)ECM物理信號，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞行為。研究[34-35]表明，ECM拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)和剛度變化可以改變ECM與整合素的結(jié)合，進(jìn)而影響潛在TGF-β1的激活。相比P12-SK1和P12-SK2，P12具有較高的TGF-β1、α-SMA和COL Ⅲ表達(dá)，其α-SMA的表達(dá)量是P12-SK1和P12-SK2的2倍、COL Ⅲ分別是P12-SK1和P12-SK2的3.76和6.14倍，增加了成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的分化和增生性瘢痕組織形成的可能。雖然微/納復(fù)合的P12-SK1和P12-SK2較P12具有較低的TGF-β1、α-SMA表達(dá)，可以減少成纖維細(xì)胞的分化和瘢痕組織形成，但P12-SK2因細(xì)胞鋪展面積小且所有基因的表達(dá)量均低，具有延遲的傷口愈合效果，尤其是作為ECM主要成分的COL I表達(dá)較少，約為P12-SK1的20%，無法滿足結(jié)締組織的承重要求[25]。而具有適當(dāng)納米片晶密度的P12-SK1可以產(chǎn)生類似于新生兒傷口的愈合過程，在早期產(chǎn)生較多的COL Ⅲ，在后期具有適當(dāng)?shù)腃OL I/COL Ⅲ比例(3∶1)，可有效促進(jìn)傷口愈合，加強(qiáng)結(jié)締組織承重能力，減少瘢痕組織[36-37]。以上結(jié)果均表明纖維拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)可以影響成纖維細(xì)胞的基因表達(dá)和表型變化。

圖7 不同表面拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)纖維支架上的HFF-1基因表達(dá)Fig.7 HFF-1 gene expression on fiber scaffolds with different surface topologies

3 結(jié) 語

采用靜電紡絲和溶液孵育結(jié)晶法制備具有不同納米纖維密度的串晶結(jié)構(gòu)纖維膜。通過對纖維膜進(jìn)行理化性能和體外細(xì)胞試驗表征發(fā)現(xiàn)，與P12相比，微/納復(fù)合的P12-SK1和P12-SK2纖維，可以增加纖維膜的力學(xué)性能和粗糙度，影響細(xì)胞外基質(zhì)與細(xì)胞的接觸位點，可調(diào)節(jié)細(xì)胞形態(tài)、基質(zhì)合成(COL I、COL Ⅲ)和肌成纖維細(xì)胞激活標(biāo)志基因(TGF-β1、α-SMA)的表達(dá)，對傷口愈合和減少瘢痕具有較好的效果。但P12-SK2較P12-SK1具有更大的片晶密度、更小的細(xì)胞鋪展面積和更少的COL I、COL Ⅲ表達(dá)，最終會導(dǎo)致修復(fù)效果不良。綜上，低密度微/納復(fù)合纖維膜P12-SK1不僅具有優(yōu)異的理化和生物相容性，還可以加快組織修復(fù)，減少瘢痕，在組織愈合中具有一定的應(yīng)用潛力。