林宗粵，程宇星，吳劍純，吳漪彤，王佳樂

(1. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州 510145；2. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510000；3. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510080)

胃癌是我國發(fā)病率和病死率最高的消化道惡性腫瘤，也是世界范圍內(nèi)腫瘤相關(guān)死亡的第二大原因，病死率僅次于肺癌，嚴(yán)重威脅著人們的生命健康[1]。慢性萎縮性胃炎(CAG)是胃癌病理進(jìn)展中重要的一環(huán)，以胃黏膜腺體萎縮和不典型增生為特征，臨床以上腹脹痛及消化不良為主要表現(xiàn)[2]。其病程較長，難以治愈且易于惡變，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)仍缺乏公認(rèn)的有效治療手段。近年來，中醫(yī)藥在CAG等慢性胃病中的作用逐漸受到關(guān)注，中藥復(fù)方在改善CAG患者癥狀及逆轉(zhuǎn)CAG進(jìn)程方面顯示出明顯優(yōu)勢[3]。中醫(yī)將CAG歸于“胃萎”“痞滿”等范疇，多認(rèn)為該病以胃陰不足、肝郁氣滯為病機(jī)特點(diǎn)，治宜養(yǎng)陰疏肝、理氣和胃。一貫煎為疏肝滋陰首選方，可有效緩解CAG患者臨床癥狀[4]，然而關(guān)于其具體作用機(jī)制的研究報(bào)道較少。Lahner等[5]研究報(bào)道，CAG的發(fā)病與下丘腦-垂體-甲狀腺軸功能異常密切相關(guān)，患者血循環(huán)中甲狀腺激素含量降低。李玉鳳等[6]報(bào)道，轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)/Smad信號通路的異常激活在CAG發(fā)病過程中發(fā)揮著重要作用，通過抑制其活化可有效阻斷病情進(jìn)展。本實(shí)驗(yàn)通過建立CAG癌前病變大鼠模型，探討了不同劑量一貫煎對甲狀腺激素水平及TGF-β1/Smad信號通路的影響，旨在為其防治CAG提供實(shí)驗(yàn)理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級雄性Wistar大鼠60只，體重(160±20)g，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)提供，動(dòng)物合格證號：SYXK(粵)2022-0006。實(shí)驗(yàn)前1周飼養(yǎng)于溫度(22±2)℃，相對濕度40%～70%的SPF級動(dòng)物房中。本實(shí)驗(yàn)內(nèi)容經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會審核通過(20210921019)。

1.2實(shí)驗(yàn)藥物及試劑 一貫煎方藥組成：北沙參9 g、麥冬9 g、當(dāng)歸9 g、生地黃15 g、枸杞子12 g、川楝子10 g。換算為大鼠灌胃等效劑量為5.76 g/kg，以此為中劑量，高劑量為11.52 g/kg，低劑量為2.88 g/kg；維酶素片購自河北環(huán)海藥業(yè)有限公司(0.2 g/片)。N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍(MNNG)購自Fluka公司，大鼠總?cè)饧谞钕僭彼?T3)、甲狀腺素(T4)、促甲狀腺素(TSH)ELISA試劑盒購自南京森貝伽生物科技有限公司，Ki67抗體試劑盒購自武漢博士德公司，Anti-TGF-β1、Smad3、Smad4購自Santa Crutz公司；總RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.3實(shí)驗(yàn)方法 將大鼠按體重隨機(jī)分組為空白組、模型組、維酶素組、一貫煎低劑量組、一貫煎中劑量組、一貫煎高劑量組，每組10只?？瞻捉M大鼠正常飲食飲水；其余各組大鼠采用自由飲用MNNG+乙醇灌胃+饑飽失常多因素法制備CAG癌前病變模型：將100 μg/mL MNNG溶液裝于外涂黑漆的水瓶中，每日更換，大鼠自由飲用12周，同時(shí)給予40%乙醇溶液灌胃，并輔以饑飽失常(2 d飽食，1 d禁食)，12周后取胃黏膜做病理學(xué)觀察，以出現(xiàn)固有腺體萎縮、異型增生等形態(tài)學(xué)改變?yōu)樵炷３晒?。模型制備成功后，一貫煎低、中、高劑量組分別給予4.84，9.68，19.35 g/kg一貫煎灌胃，維酶素組給予0.3 g/kg維酶素灌胃，空白組和模型組給予等量生理鹽水灌胃，1次/d，持續(xù)灌胃12周。

1.4觀察指標(biāo)及方法

1.4.1胃黏膜血流量 灌胃結(jié)束后，采用中性紅清除法測定各組大鼠胃黏膜血流量：采用水合氯醛400 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，經(jīng)尾靜脈采血1 mL后固定大鼠，切開腹壁，分離股靜脈和股動(dòng)脈，經(jīng)十二指腸向胃內(nèi)插管，收集0.5 mL胃液作為對照，沿右股靜脈輸注4 mg/kg的中性紅溶液2 mL，輸注完成后再以微量注射泵繼續(xù)輸注4 mL的中性紅溶液，每隔15 min收集1次胃液，共收集2 h，隨后取血4 mL，采用分光光度計(jì)法于540 nm下分別測定胃液、血液的中性紅濃度，計(jì)算胃黏膜血流量(胃液中性紅濃度/血液中性紅濃度×單位時(shí)間內(nèi)胃液分泌量)。

1.4.2胃黏膜組織形態(tài)學(xué) 灌胃結(jié)束，各組大鼠腹主動(dòng)脈取血后處死，取部分胃黏膜組織，置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，分別放入梯度乙醇溶液和二甲苯中水化和透明，液體石蠟中包埋，切片機(jī)切5 μm厚切片，經(jīng)脫蠟至水、蘇木素-伊紅(HE)染色、鹽酸酒精分化后，再置于梯度乙醇中水化，二甲苯透明，采用中性樹膠封片，于倒置光學(xué)顯微鏡下觀察各組大鼠胃黏膜組織形態(tài)并拍照。

1.4.3胃黏膜組織Ki67陽性表達(dá)情況 采用免疫組織化學(xué)法檢測：取制備好的胃黏膜組織石蠟切片，滴加0.3% H2O2封閉20 min，蒸餾水水洗后進(jìn)行抗原熱修復(fù)，滴加5% BSA封閉20 min，滴加一抗置于4 ℃冰箱孵育過夜，滴加二抗于37 ℃溫育20 min，滴加SABC 37 ℃溫育20 min，滴加DAB顯色劑，蒸餾水水洗，中性樹膠封片，倒置光學(xué)顯微鏡下觀察Ki67的陽性表達(dá)情況，隨機(jī)選取5個(gè)視野，采用Image J軟件計(jì)算平均光密度值。

1.4.4血清中甲狀腺激素水平 取各組大鼠腹主動(dòng)脈血，離心機(jī)3 000 r/min下離心分離血清，分裝保存于-20 ℃冰箱。血清臨用前置于室溫平衡1 h，3 000 r/min離心20 min，吸取上清，按照試劑盒說明書，采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測血清中T3、T4和TSH水平。

1.4.5胃黏膜組織TGF-β1/Smad通路相關(guān)因子蛋白表達(dá)情況 采用Western blot法檢測：取各組大鼠部分胃黏膜組織，剪碎后加入裂解液于冰上裂解，提取組織總蛋白，采用BCA試劑盒于562 nm波長下測定蛋白濃度。蛋白樣本于水浴鍋中煮沸變性，制備分離膠和濃縮膠，經(jīng)蛋白樣品上樣，凝膠電泳分離，PVDF轉(zhuǎn)膜后加入5%脫脂牛奶封閉2 h，滴加一抗(1∶1 000)于4 ℃冰箱過夜，TBST清洗，加入二抗(1∶5 000)，室溫孵育2 h，洗膜，滴加ECL，凝膠成像系統(tǒng)曝光，以β-actin為內(nèi)參，用Image J軟件分析條帶灰度值，分別計(jì)算TGF-β1、Smad3、Smad4蛋白相對表達(dá)量。

1.4.6胃黏膜組織中TGF-β1/Smad通路相關(guān)因子mRNA表達(dá)情況 采用RT-PCR法檢測：取各組大鼠部分胃黏膜組織，剪碎研磨后采用Trizol一步法提取組織總RNA，采用紫外分光光度儀測定組織中RNA濃度，將RNA反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，以cDNA為模板，按RT-PCR試劑盒步驟檢測TGF-β1、Smad3、Smad4 mRNA表達(dá)量。反應(yīng)參數(shù)：94 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共擴(kuò)增 40個(gè)循環(huán)，以β-actin為內(nèi)參，mRNA相對表達(dá)量采用2-ΔΔCt方法計(jì)算。TGF-β1引物序列：上游為5’-CCAAGGAGACGGAATACAGG-3’，下游為5’-GTGTTGGTTGTAGAGGGCAAG-3’；Smad3引物序列：上游為5’-GAATCCACGAGCAGAGCAACG-3’，下游為5’-TCGAGGTGACACGCCTCAGTC-3’；Smad4引物序列：上游為5’-TCAGCCAGCTACTTACCACCA-3’，下游為5’-ACACGTCCCCTTCACCTTTAC-3’；β-actin引物序列：上游為5’-TGTATGCCTCTGGTCGTACCAC-3’，下游為5’-ACAGAGTACTTGCGCTCAGGAG-3’。

?《文孫氏證言》，載朱成山主編《侵華日軍南京大屠殺幸存者證言》，社會科學(xué)文獻(xiàn)出版社2005年版，第470頁。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠胃黏膜血流量比較 空白組、模型組、維酶素組、一貫煎低劑量組、一貫煎中劑量組和一貫煎高劑量組大鼠胃黏膜血流量分別為28.79±4.81，11.65±4.29，25.43±5.17，17.34±6.24，19.38±4.49，23.62±6.02。模型組大鼠胃黏膜血流量明顯少于空白組(P<0.05)；維酶素組和一貫煎各劑量組大鼠胃黏膜血流量均明顯多于模型組(P均<0.05)，且維酶素組和一貫煎高劑量組明顯多于一貫煎低劑量組(P均<0.05)。

2.2各組大鼠胃黏膜組織形態(tài) HE染色顯示，空白組大鼠胃黏膜細(xì)胞、腺體排列規(guī)整，未見損傷和炎性浸潤；模型組大鼠胃黏膜細(xì)胞排列不規(guī)則，胃黏膜變薄，腺體萎縮，固有層大量漿細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤，可見部分黏膜細(xì)胞出現(xiàn)異型增生；與模型組比較，維酶素組和一貫煎各劑量組大鼠胃黏膜細(xì)胞排列較整齊，腺體排列較規(guī)則，腺體萎縮和炎細(xì)胞浸潤減少，異型增生情況明顯改善，其中維酶素組和一貫煎高劑量組改善更明顯。見圖1。

圖1 空白組和慢性萎縮性胃炎癌前病變各組大鼠胃黏膜組織形態(tài)(HE，×200)

2.3各組大鼠胃黏膜Ki67表達(dá)情況 空白組大鼠胃黏膜僅見少量Ki67陽性表達(dá)，平均光密度值為0.003±0.002；模型組大鼠胃黏膜中Ki67陽性表達(dá)明顯增多，平均光密度值為0.014±0.003，明顯高于空白組(P<0.05)；維酶素組和一貫煎低、中、高劑量組大鼠胃黏膜中Ki67陽性表達(dá)明顯減少，平均光密度值分別為0.004±0.003，0.008±0.005，0.007±0.003，0.006±0.004，均明顯低于模型組(P均<0.05)。見圖2。

圖2 空白組和慢性萎縮性胃炎癌前病變各組大鼠胃黏膜組織Ki67陽性表達(dá)情況(IHC，×200)

2.4各組大鼠血清T3、T4、TSH水平比較 模型組大鼠血清T3、T4、TSH水平均明顯低于空白組(P均<0.05)；維酶素組和一貫煎各劑量大鼠血清T3、T4、TSH水平均明顯高于模型組(P均<0.05)；一貫煎各劑量組血清T3、TSH水平比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)；一貫煎中、高劑量組血清T4水平均明顯低于一貫煎低劑量組(P均<0.05)，且一貫煎高劑量組明顯低于一貫煎中劑量組(P<0.05)。見表1。

表1 空白組和慢性萎縮性胃炎癌前病變各組大鼠血清T3、T4、TSH水平比較

2.5各組大鼠胃黏膜組織中TGF-β1/Smad通路相關(guān)因子蛋白表達(dá)情況 與空白組比較，模型組大鼠胃黏膜組織中TGF-β1蛋白相對表達(dá)量明顯升高(P<0.05)，Smad3、Smad4蛋白相對表達(dá)量均明顯降低(P均<0.05)；與模型組比較，維酶素組和一貫煎各劑量組大鼠胃黏膜組織中TGF-β1蛋白相對表達(dá)量均明顯降低(P均<0.05)，Smad3、Smad4蛋白相對表達(dá)量均明顯升高(P均<0.05)；一貫煎各劑量組TGF-β1、Smad3、Smad4蛋白相對表達(dá)量比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見圖3。

2.6各組大鼠胃黏膜組織中TGF-β1/Smad通路相關(guān)因子mRNA表達(dá)情況 與空白組比較，模型組大鼠胃黏膜組織中TGF-β1mRNA相對表達(dá)量明顯升高(P<0.05)，Smad3、Smad4 mRNA相對表達(dá)量均明顯降低(P均<0.05)；與模型組比較，維酶素組和一貫煎各劑量組大鼠胃黏膜組織中TGF-β1mRNA相對表達(dá)量均明顯降低(P均<0.05)，Smad3、Smad4 mRNA相對表達(dá)量均明顯升高(P均<0.05)；一貫煎各劑量組TGF-β1、Smad3、Smad4 mRNA相對表達(dá)量比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表2。

表2 空白組和慢性萎縮性胃炎癌前病變各組大鼠胃黏膜組織中TGF-β1/Smad通路相關(guān)因子mRNA相對表達(dá)量比較

3 討 論

胃癌早期癥狀不明顯，且缺乏特異性的診斷標(biāo)志物，多數(shù)患者明確診斷時(shí)已是晚期，預(yù)后較差[7]。CAG屬于胃癌癌前病變，以黏膜萎縮、炎癥和不典型增生等病理學(xué)表現(xiàn)為主要特征[8]，如何防止其向胃癌轉(zhuǎn)化是臨床重點(diǎn)關(guān)注的問題。

Ki67是一種細(xì)胞增殖因子，與惡性腫瘤生長、轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)，其陽性率可反映腫瘤細(xì)胞生長情況和惡性程度[13]。本實(shí)驗(yàn)中模型組大鼠胃黏膜中Ki67陽性表達(dá)明顯增多，一貫煎各劑量組陽性表達(dá)較模型組明顯減少，提示一貫煎可有效減輕病變黏膜組織的增殖活性，降低CAG癌變風(fēng)險(xiǎn)。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為肝與脾參與調(diào)節(jié)機(jī)體的情志活動(dòng)與津血代謝，肝脾虛損?？缮婕艾F(xiàn)代內(nèi)分泌系統(tǒng)的異常，與甲狀腺代謝功能的減退聯(lián)系密切[14]。以往實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，肝郁脾虛大鼠血循環(huán)中甲狀腺激素含量顯著降低[15]。本實(shí)驗(yàn)中，模型組大鼠血清T3、T4和TSH水平較空白組顯著降低，一貫煎各劑量組血清T3、T4和TSH水平均較模型組明顯升高，提示一貫煎可調(diào)節(jié)下丘腦-垂體-甲狀腺軸功能。

TGF-β1是一種能調(diào)控增殖、分化、凋亡等生物學(xué)過程的多效生長調(diào)節(jié)因子，通過活化其下游的Smad信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白發(fā)揮生物學(xué)作用[16]。相關(guān)研究表明，在CAG胃黏膜組織中存在TGF-β1的過度表達(dá)[6，17]，TGF-β1可通過促進(jìn)平滑肌細(xì)胞增生及異型細(xì)胞的增殖參與CAG發(fā)病過程[18]。Smad3蛋白能夠抑制TGF-β1的活化和增殖功能，其通過與Smad4結(jié)合并形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合物后，負(fù)向調(diào)節(jié)TGF-β1介導(dǎo)的信號通路[19]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組大鼠胃黏膜組織中TGF-β1表達(dá)上調(diào)，Smad3、Smad4表達(dá)下調(diào)；一貫煎各劑量組與模型組比較，TGF-β1表達(dá)下調(diào)，Smad3和Smad4表達(dá)上調(diào)。提示一貫煎能夠有效抑制CAG大鼠體內(nèi)TGF-β1/Smad通路的活性。

綜上所述，一貫煎可逆轉(zhuǎn)CAG大鼠胃黏膜病變，調(diào)節(jié)大鼠下丘腦-垂體-甲狀腺軸功能，作用機(jī)制可能與抑制TGF-β1/Smad通路的激活有關(guān)。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。