孫葉芬，岳倩俠，杜倩倩，楊 爽，金傳山，張 偉,3，程世云，李翔宇，陳 慶

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽 合肥 230012;2.中藥飲片制造新技術(shù)安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230012;3.省部共建安徽道地中藥材品質(zhì)提升協(xié)同創(chuàng)新中心，安徽 合肥 230012; 4.安徽省食品藥品檢驗(yàn)研究院，安徽 合肥 230051; 5.安徽濟(jì)人藥業(yè)股份有限公司，安徽 亳州 236800;6.安徽宏方藥業(yè)有限公司，安徽 亳州 236800)

白芍配方顆粒以白芍飲片為原料，經(jīng)提取、濃縮、干燥、制粒等工藝制成的具有一定規(guī)格的供臨床直接使用的顆粒[1]。根據(jù)白芍配方顆粒國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)[2]，課題組前期對(duì)企業(yè)生產(chǎn)的3批白芍配方顆粒進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果出膏率、浸出物含量、芍藥苷含量、特征圖譜等指標(biāo)均符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)要求。但由于白芍成分復(fù)雜，僅通過(guò)芍藥苷來(lái)研究白芍配方顆粒生產(chǎn)過(guò)程中量值傳遞，難以準(zhǔn)確表征生產(chǎn)過(guò)程中整體質(zhì)量變化。

中藥質(zhì)量標(biāo)志物是與中藥的功能屬性密切相關(guān)，可進(jìn)行定性、定量的化學(xué)物質(zhì)，可以作為反映中藥安全性和有效性的標(biāo)志性物質(zhì)進(jìn)行質(zhì)量控制，體現(xiàn)中藥組方配伍的整體性、多元性的質(zhì)量控制概念，可為中藥質(zhì)量控制指標(biāo)的合理選擇提供研究途徑[3-8]。本課題組前期結(jié)合質(zhì)量標(biāo)志物的基本原則，確定白芍質(zhì)量標(biāo)志物為沒(méi)食子酸、氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、沒(méi)食子酰芍藥苷、苯甲酰芍藥苷共6個(gè)成分。

因此，本研究在符合白芍配方顆粒國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的制備工藝基礎(chǔ)上，通過(guò)研究白芍質(zhì)量標(biāo)志物中6個(gè)成分在提取、濃縮、干燥、制粒等生產(chǎn)環(huán)節(jié)的量值傳遞情況，尋找其關(guān)鍵影響因素，優(yōu)化制備工藝，提升白芍配方顆粒整體質(zhì)量。

1 儀器與材料

1.1 儀器與試劑 Thermo Fisher UltiMate3000高效液相色譜儀(LPG-3400SDN四元泵，DAD-3000檢測(cè)器)：賽默飛世爾科技有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(YRE-201D)：鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；百萬(wàn)分之一微量分析天平(EX-H3052)：上海贊維衡器有限公司；超聲波清洗器(JK-300DB)：合肥金尼克機(jī)械制造有限公司；噴霧干燥器(ADL311-A)：浚和儀器科技有限公司。

1.2 藥材與試劑 3批白芍飲片(批號(hào)分別為P21032601、P21031301、P21031302)：安徽濟(jì)人藥業(yè)有限公司；沒(méi)食子酸(批號(hào) 110831-201906，純度 91.5%)、芍藥苷(批號(hào)：110736-202145，純度98.00%):中國(guó)食品藥品檢定研究院；氧化芍藥苷(批號(hào) 21092304，純度 99.42%)、芍藥內(nèi)酯苷(批號(hào) 21031706，純度 98.75%)、沒(méi)食子酰芍藥苷(批號(hào) DST190723-064，純度 98.00%)、苯甲酰芍藥苷(批號(hào) 21091008，純度 98.40%)：成都普菲德生物技術(shù)有限公司；甲醇(色譜醇，批號(hào) A22T0105)、乙腈(色譜醇，批號(hào) A22T0218)：美國(guó)阿斯頓化學(xué)技術(shù)有限公司；磷酸(分析純，批號(hào) 2021110801)：成都市科隆化學(xué)品有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 白芍配方顆粒原制備工藝

2.1.1 提取工藝 白芍飲片加10倍量水浸泡0.5 h，煎煮提取1.5 h，過(guò)300目篩，藥渣再加8倍水，煎煮1.0 h，過(guò)300目篩，合并2次濾液。

2.1.2 濃縮工藝 將濾液加入減壓濃縮系統(tǒng)中，于真空度-0.08 MPa，70 ℃下濃縮至相對(duì)密度為1. 07～1.09 g/mL的濃縮液。

2.1.3 干燥工藝 將濃縮液持續(xù)攪拌，以進(jìn)風(fēng)溫度170～180 ℃、出風(fēng)溫度60～90 ℃、送料泵25～50 r/min進(jìn)行噴霧干燥，得干膏粉。

2.1.4 制粒工藝 干膏粉中加適量糊精，混合均勻，干法制粒，軋輪轉(zhuǎn)速 8 r/min，壓力7 MPa，水平送料速度30 r/min，粉碎，過(guò)篩，即得。

2.2 含量測(cè)定方法

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取對(duì)照品沒(méi)食子酸、氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、沒(méi)食子酰芍藥苷和苯甲酰芍藥苷適量，分別置于10 mL容量瓶中，加70%甲醇溶解并定容至刻度，得質(zhì)量濃度分別為沒(méi)食子酸70.42 μg/mL、氧化芍藥苷199.60 μg/mL、芍藥內(nèi)酯苷40.08 μg/mL、芍藥苷21.12 μg/mL、沒(méi)食子酰芍藥苷100.00 μg/mL和苯甲酰芍藥苷102.80 μg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備

(1)白芍飲片供試品溶液制備 白芍粉末約0.5 g，精密稱定，置于25 mL量瓶中，加稀乙醇定容至刻度，超聲處理(功率240 W，頻率45 kHz)30 min，放冷，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

(2)提取液、濃縮液、干膏粉、配方顆粒供試品溶液制備 精密量取提取液2.0 mL、濃縮液1.0 mL，精密稱取干膏粉、配方顆粒各0.1 g，分別置于25 mL容量瓶中，加入稀乙醇定容至刻度，超聲處理(功率240 W，頻率45 kHz)30 min，放冷，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 色譜條件 Aglient ZORBAX SB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相為乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B)，梯度洗脫(0～5 min，5% A→9% A；5～8 min, 9% A→15% A；8～23 min，15% A→25% A；23～28 min，25% A→35% A；28～35 min，35% A→90% A)；流速1.0 mL/min，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為10 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)為257 nm(1～14 min)、230 nm(14～35 min)。見(jiàn)圖1。

注：1.沒(méi)食子酸；2.氧化芍藥苷；3.芍藥內(nèi)酯苷；4.芍藥苷；5.沒(méi)食子酰芍藥苷；6.苯甲酰芍藥苷

2.2.4 方法學(xué)考察

(1)線性關(guān)系考察 精密稱取6種對(duì)照品適量，置于5 mL量瓶中，用70%甲醇溶解并定容。精密量取對(duì)照品溶液，分別稀釋至對(duì)應(yīng)濃度，以對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制各組分標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程和相關(guān)系數(shù)。結(jié)果表明，6種成分在如下范圍內(nèi)成良好的線性關(guān)系。見(jiàn)表1。

表1 線性關(guān)系考察結(jié)果

(2)精密度試驗(yàn) 取供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，分別計(jì)算各組分色譜峰峰面積RSD值，結(jié)果沒(méi)食子酸、氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、沒(méi)食子酰芍藥苷、苯甲酰芍藥苷峰面積的RSD值分別為0.06%、0.16%、0.17%、0.09%、0.26%、0.07%，表明該儀器精密度良好。

(3)重復(fù)性試驗(yàn) 取供試品溶液，按“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，進(jìn)樣。沒(méi)食子酸、氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、沒(méi)食子酰芍藥苷、苯甲酰芍藥苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD值分別為1.95%、2.75%、2.45%、1.93%、2.62%、1.70%，表明該方法重復(fù)性良好。

(4)穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液分別于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣。沒(méi)食子酸、氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、沒(méi)食子酰芍藥苷、苯甲酰芍藥苷峰面積的RSD值分別為0.86%、1.84%、2.15%、0.39%、0.89%、0.99%，供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

(5)加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的白芍飲片6份，每份0.25 g，按1∶1分別加入沒(méi)食子酸、氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、沒(méi)食子酰芍藥苷、苯甲酰芍藥苷對(duì)照品適量，進(jìn)樣，并計(jì)算回收率。平均加樣回收率分別為92.57%、99.58%、98.40%、105.56%、94.58%、92.63%，RSD值分別為0.96%、2.37%、0.79%、0.43%、1.79%、1.19%。結(jié)果表明該方法準(zhǔn)確可靠。

2.3 白芍配方顆粒原制備工藝中白芍質(zhì)量標(biāo)志物6種成分含量測(cè)定及量值傳遞分析 精密吸取3批各供試品溶液10 μL，按“2.2.3”項(xiàng)下方法進(jìn)樣，測(cè)定供試品溶液中6種成分含量，計(jì)算轉(zhuǎn)移率。含量和轉(zhuǎn)移率計(jì)算公式：w(飲片)/%=[ρ(指標(biāo)成分)/(mg/mL)]×[V(稀釋液)/mL]/[m(稱樣量)/g]/1 000×100；w(提取液或濃縮液)/%=[ρ(指標(biāo)成分)/(mg/mL)]×n(稀釋倍數(shù))×[V(總樣品)/mL]/[m(總飲片)/g]/1 000×100；w(干膏粉或顆粒)/%=[ρ(指標(biāo)成分)/(mg/mL)]×[V(稀釋液)/mL]/[m(稱樣量)/g]×[m(總樣品)/g]/[m(總飲片)/g]/1 000×100。r(轉(zhuǎn)移率)/%=w(樣品中指標(biāo)成分)/w(飲片中指標(biāo)成分)×100。并采用SPSS 23.0軟件對(duì)飲片-提取液、提取液-濃縮液、濃縮液-干膏粉、干膏粉-配方顆粒中6種成分含量和轉(zhuǎn)移率進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。見(jiàn)表2、表3。

表2 白芍配方顆粒制備過(guò)程中6種質(zhì)量標(biāo)志物的含量

表3 白芍配方顆粒制備過(guò)程中6種質(zhì)量標(biāo)志物的轉(zhuǎn)移率

結(jié)果顯示，提取過(guò)程中，氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、沒(méi)食子酰芍藥苷、苯甲酰芍藥苷的含量分別下降44.00%、24.56%、27.28%、19.57%、37.25%，其中氧化芍藥苷、芍藥苷、沒(méi)食子酰芍藥苷、苯甲酰芍藥苷的含量顯著降低(P<0.05)；干燥過(guò)程中，6種成分含量均有降低趨勢(shì)，且芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、沒(méi)食子酰芍藥苷、苯甲酰芍藥苷的轉(zhuǎn)移率分別降低10.78%、11.29%、15.62%、11.38%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；在提取-濃縮和干燥-制粒兩個(gè)過(guò)程中，6種成分含量無(wú)顯著下降(P>0.05)，且轉(zhuǎn)移率相對(duì)較高。

從各過(guò)程中6種成分含量和轉(zhuǎn)移率的變化來(lái)看，提取過(guò)程和干燥過(guò)程為關(guān)鍵生產(chǎn)環(huán)節(jié)，根據(jù)原制備工藝參數(shù)，經(jīng)研究表明，6種成分含量均隨著溫度的升高而降低，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)先增加后趨于平緩而后下降的趨勢(shì)。因此，提取時(shí)間和干燥溫度為關(guān)鍵影響因素，可進(jìn)一步優(yōu)化。

2.4 白芍配方顆粒制備工藝優(yōu)化

2.4.1 出膏率的測(cè)定 精密量取提取液25 mL，分別置于已干燥至恒質(zhì)量的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，殘?jiān)?05 ℃干燥3 h，置干燥器中冷卻30 min，迅速精密稱定質(zhì)量，計(jì)算出膏率。

2.4.2 熵權(quán)法確定權(quán)重 按文獻(xiàn)[9-13]的方法計(jì)算權(quán)重。

(1)數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化處理 假設(shè)m個(gè)評(píng)價(jià)對(duì)象n個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)的原始數(shù)據(jù)矩陣為X=(Xij)mn，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理后的數(shù)據(jù)矩陣Y=(Yij)mn。對(duì)于正向指標(biāo)，采用下列公式進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。Xij=(aij-minj{aij})/(maxj{aij}-minj{aij})，Xij表示第i次試驗(yàn)時(shí)第j個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)的取值，i=1，2，3，…，m；j=1，2，3，…，n。

(3)計(jì)算各指標(biāo)信息熵(Hj)

(4)計(jì)算各指標(biāo)的權(quán)重系數(shù)(Wj)

2.4.3 工藝關(guān)鍵參數(shù)優(yōu)化

(1)第1次提取時(shí)間考察 稱取4份白芍飲片(100 g)，加入10倍量水，浸泡30 min，分別煎煮40、60、80、100 min后，300目篩濾過(guò)，濾渣加8倍量水，煎煮40 min，300目篩濾過(guò)，合并濾液，得提取液。測(cè)定6種成分含量和出膏率，計(jì)算各指標(biāo)權(quán)重系數(shù)和綜合評(píng)分。根據(jù)綜合評(píng)分確定40 min為最佳提取時(shí)間。見(jiàn)表4、表5。

表4 第1次提取時(shí)間考察時(shí)各指標(biāo)熵值及權(quán)重系數(shù)(n=3)

表5 第1次提取的樣品考察結(jié)果(n=3)

(2)第2次提取時(shí)間考察 稱取3份白芍飲片(100 g)，加入10倍量水，浸泡30 min，煎煮40 min，300目篩濾過(guò)，濾渣加8倍量水煎煮，分別煎煮30、40、50 min，300目篩濾過(guò)，合并濾液，得提取液。測(cè)定6種成分含量和出膏率，計(jì)算各指標(biāo)權(quán)重系數(shù)和綜合評(píng)分。根據(jù)綜合評(píng)分確定40 min為最佳提取時(shí)間。見(jiàn)表6、表7。

表6 第2次提取時(shí)間考察時(shí)各指標(biāo)熵值及權(quán)重系數(shù)(n=3)

表7 第2次提取的樣品考察結(jié)果(n=3)

(3)干燥溫度考察 將4份濃縮液過(guò)濾后，分別按照140、150、160、170 ℃進(jìn)行噴霧干燥，即得干膏粉。測(cè)定6種成分含量和出膏率，計(jì)算各指標(biāo)權(quán)重系數(shù)和綜合評(píng)分。根據(jù)綜合評(píng)分確定最佳干燥溫度為140 ℃。見(jiàn)表8、表9。

表8 干燥溫度考察時(shí)各指標(biāo)熵值及權(quán)重系數(shù)

表9 不同干燥溫度下樣品考察結(jié)果(n=3)

結(jié)果表明，白芍配方顆粒最佳工藝：100 g白芍飲片加10倍量水浸泡30 min，煎煮40 min，濾過(guò)，加8倍量水煎煮40 min，濾過(guò)，合并濾液；以70 ℃進(jìn)行減壓濃縮，濃縮至相對(duì)密度為1.07～1.09 g/mL，濾過(guò)；以進(jìn)風(fēng)溫度140 ℃進(jìn)行噴霧干燥，得干膏粉；加入適量糊精，進(jìn)行干法制粒。

2.4.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 取3批白芍飲片按最佳工藝進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，提取液、干膏粉中6種成分含量和轉(zhuǎn)移率的RSD值均小于4.0%，表明工藝重復(fù)性好、穩(wěn)定、可行。見(jiàn)表10、表11。

表10 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)所得6種成分的含量及出膏率(n=3)

表11 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)所得6種成分的轉(zhuǎn)移率(n=3)

2.5 優(yōu)化前后6種質(zhì)量標(biāo)志物的轉(zhuǎn)移率比較 將優(yōu)化前后提取液、干膏粉的轉(zhuǎn)移率導(dǎo)入SPSS 23.0軟件中進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)6種成分的轉(zhuǎn)移率在優(yōu)化后的提取液、干膏粉中均有不同程度的增加，其中芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、沒(méi)食子酰芍藥苷、苯甲酰芍藥苷轉(zhuǎn)移率在提取液中分別增加16.81%、9.51%、12.96%、7.67%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；在干膏粉中分別增加15.67%、11.81%、11.63%、11.20%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明優(yōu)化后白芍配方顆粒質(zhì)量明顯提升。見(jiàn)圖2、圖3。

注：A.沒(méi)食子酸；B.氧化芍藥苷；C.芍藥內(nèi)酯苷；D.芍藥苷；E.沒(méi)食子酰芍藥苷；F.苯甲酰芍藥苷；與優(yōu)化前比較，*P<0.05

注：A.沒(méi)食子酸；B.氧化芍藥苷；C.芍藥內(nèi)酯苷；D.芍藥苷；E.沒(méi)食子酰芍藥苷；F.苯甲酰芍藥苷；與優(yōu)化前比較，*P<0.05

3 討論

本實(shí)驗(yàn)在符合白芍配方顆粒國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)工藝的基礎(chǔ)上，通過(guò)6種白芍質(zhì)量標(biāo)志物成分(沒(méi)食子酸、氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、沒(méi)食子酰芍藥苷、苯甲酰芍藥苷)的含量和轉(zhuǎn)移率分析白芍配方顆粒生產(chǎn)過(guò)程中的量值傳遞規(guī)律，發(fā)現(xiàn)在濃縮和干燥兩個(gè)過(guò)程中6種成分能夠較好傳遞，轉(zhuǎn)移率較高，而在提取過(guò)程和干燥過(guò)程中，除了沒(méi)食子酸外的5種成分轉(zhuǎn)移率相對(duì)較低，傳遞較差。結(jié)合實(shí)驗(yàn)室研究，確定提取時(shí)間和干燥溫度為生產(chǎn)過(guò)程中的關(guān)鍵影響因素。

實(shí)驗(yàn)以出膏率和質(zhì)量標(biāo)志物成分的含量為指標(biāo)，通過(guò)熵權(quán)法確定權(quán)重，計(jì)算綜合評(píng)分，優(yōu)選提取時(shí)間和干燥溫度參數(shù)。結(jié)果確定最佳參數(shù)為“兩次提取時(shí)間均為40 min，以140 ℃進(jìn)行噴霧干燥”。與原工藝相比，優(yōu)化后工藝的6種成分的轉(zhuǎn)移率均有增加，其中芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、沒(méi)食子酰芍藥苷、苯甲酰芍藥苷等成分轉(zhuǎn)移率的增加具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明白芍質(zhì)量標(biāo)志物在一定程度上得到了保留，白芍配方顆粒的質(zhì)量得到提升。

本研究基于質(zhì)量標(biāo)志物研究白芍配方顆粒生產(chǎn)過(guò)程中的質(zhì)量傳遞規(guī)律，較詳盡地反映生產(chǎn)過(guò)程中質(zhì)量的變化和關(guān)鍵影響因素，并通過(guò)對(duì)關(guān)鍵影響因素進(jìn)行工藝優(yōu)化，提高了質(zhì)量標(biāo)志物成分的轉(zhuǎn)移率，為白芍配方顆粒的生產(chǎn)和質(zhì)量控制提供了科學(xué)依據(jù)。