宋思源 舒 鵬

(1 南京中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，南京，210029； 2 南京中醫(yī)藥大學，南京，210029； 3 江蘇省中醫(yī)院，南京，210029)

胃癌是指發(fā)生于胃黏膜的惡性腫瘤，是全球第三大最常見的癌癥死亡原因，僅次于肺癌和肝癌[1]。早期胃癌五年生存率可達90%以上，術(shù)后1年復發(fā)和轉(zhuǎn)移率約為50%，而2年率則高達70%[2]，而進展期胃癌五年生存率低于30%[3]。目前，進展期胃癌治療方法主要包括化療、免疫治療和靶向治療[4]。中醫(yī)藥以“辨證論治”“標本兼顧”等在控制胃癌發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移方面具有獨特優(yōu)勢。中藥可調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境，抗腫瘤[5]。

茯苓味甘、淡，性平，具有利水滲濕，健脾寧心功效?，F(xiàn)代藥理學研究表明，茯苓中的主要活性成分茯苓多聚糖通過調(diào)節(jié)細胞免疫反應(yīng)，激活T淋巴細胞等免疫細胞對腫瘤細胞的免疫監(jiān)督[6]，從而抑制胃癌細胞的侵襲、轉(zhuǎn)移[7]。白術(shù)味甘、苦，性溫，具有健脾益氣、燥濕利水、止汗、安胎功效?，F(xiàn)代藥理學研究發(fā)現(xiàn)，白術(shù)中主要成分白術(shù)內(nèi)酯成分具有抗腫瘤、鎮(zhèn)痛等藥理學效應(yīng)[8]。李小芳等[9]研究發(fā)現(xiàn)白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ對胃癌細胞有促凋亡作用。

茯苓-白術(shù)藥對配伍始見于張機《傷寒論》和《金匱要略》[10]。喬陽等[11]通過構(gòu)建中醫(yī)方劑治療胃癌復雜網(wǎng)絡(luò)發(fā)現(xiàn)茯苓、白術(shù)是胃癌治療方劑配伍網(wǎng)絡(luò)的核心藥物。盡管已有諸多案例證實了茯苓-白術(shù)藥對抗胃癌效果，但其具體機制尚未明確。

網(wǎng)絡(luò)藥理學的發(fā)展為研究中藥配伍治療疾病提供了新的途徑。因此，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學方法闡述了茯苓-白術(shù)藥對化合物的靶標及與胃癌相關(guān)的通路，系統(tǒng)分析了預期的靶標和分子機制，為新藥開發(fā)及臨床應(yīng)用提供新的策略。

1 資料與方法

1.1 有效活性成分的獲取 在中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP)(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)分別搜索“茯苓”“白術(shù)”，口服生物利用度(Oral Bioavailability，OB)和類藥性(Drug Likeness，DL)是藥物吸收、分布、代謝、排泄(Absorption，Distribution，Excretion，Metabolism，ADME)性質(zhì)的關(guān)鍵指標[12]，本研究以O(shè)B≥30%和DL≥0.05進行篩選，獲取茯苓-白術(shù)藥對有效活性成分信息。

1.2 藥物預測靶點篩選及網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 使用Swiss Target Prediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)網(wǎng)站，獲取茯苓-白術(shù)藥對Probability TOP50的預測靶點。通過Cytoscape構(gòu)建“成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖。

1.3 疾病靶點獲取 利用疾病相關(guān)基因數(shù)據(jù)庫(DisGeNET，https://www.disgenet.org/home/)數(shù)據(jù)庫獲取胃癌相關(guān)靶點。

1.4 核心靶點集篩選 將茯苓-白術(shù)藥對化合物預測靶點與胃癌疾病靶點導入Cytoscape做交集，以Degree值、介度中心性(Betweeness Centrality，BC)、接近中心性(Closeness Centrality，CC)為標準篩選核心靶點，獲得茯苓-白術(shù)藥對治療胃癌的核心靶點集。

1.5 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(Protein-protein Interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將核心靶點上傳到String數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/cgi/input.pl)構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，然后將TSV文件導入Cytoscape進行可視化，按Degree值進行排序。

1.6 基因本體(Gene Ontology，GO)和京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)富集分析 將藥物治療疾病的核心靶點集導入DAVID數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/)，使用R軟包進行GO富集分析和KEGG富集分析，獲取茯苓-白術(shù)藥對治療胃癌的相關(guān)生物學過程及代謝通路信息。

1.7 結(jié)果驗證實驗

1.7.1 材料

1.7.1.1 細胞 人胃癌AGS細胞(南京凱基生物公司，貨號：KG187)，使用1640完全培養(yǎng)基(含有10%FBS和1%雙抗)置于細胞培養(yǎng)箱(恒溫37 ℃，含5% CO2)中常規(guī)培養(yǎng)。

1.7.1.2 藥物 中藥飲片茯苓、白術(shù)由江蘇省中醫(yī)院提供。批號分別為C0311104110、C2542032003。

1.7.1.3 試劑與儀器 磷脂酰肌醇3激酶(Phosphoinositide 3-kinase，PI3K)、蛋白激酶B(AKT)、促分裂原活化的蛋白激酶3(Mitogenactivated Protein Kinase 3，MAPK3)引物(上海生工生物工程有限公司，貨號：250162676)、總RNA提取試劑盒(江蘇凱基生物有限公司，貨號：KGA1206)、HiscriptⅢ qRT SuperMix for qPCR(南京諾唯贊生物科技有限公司，貨號：R122-01)、ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix(南京諾唯贊生物科技有限公司，貨號：Q411-02/03)；PCR儀(Thermo Fisher公司，美國，型號：ABI2720)，低溫高速離心機(Eppendorf公司，德國，型號：5810R)。

1.7.2 方法

1.7.2.1 分組 使用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)AGS細胞，待細胞量長至70%～80%時，將細胞分為空白組和中藥組。

1.7.2.2 給藥方法 空白組繼續(xù)原方法培養(yǎng)，中藥組中加入茯苓-白術(shù)藥物(終濃度為4.6 mg/mL)繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.7.2.3 檢測指標與方法 使用實時熒光定量PCR檢測AGS細胞中PI3K、AKT、MAPK3相關(guān)基因表達。

1.7.3 統(tǒng)計學方法 實驗結(jié)果通過GraphPad Prism軟件進行數(shù)據(jù)分析。組間顯著性檢驗采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 藥物篩選結(jié)果 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫篩選，最終獲取36個茯苓-白術(shù)藥對滿足OB和DL要求，其中茯苓16個、白術(shù)20個。見表1。

2.2 藥物疾病靶點篩選及網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 經(jīng)過數(shù)據(jù)庫預測與篩選，共得到藥物活性化合物預測靶點1 554個，構(gòu)建成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖。DisGeNET數(shù)據(jù)庫獲取胃癌靶點3 168個。見圖1。

2.3 茯苓-白術(shù)藥對治療胃癌核心靶點篩選 選擇“Degree≥58(2倍中位數(shù)值)”的節(jié)點作為候選靶點，對候選靶點網(wǎng)絡(luò)進行提取分析，以“BC≥0.000 066 05、CC≥0.511 9”為標準篩選出核心靶點418個。見圖2。

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 其中MAPK3、PTGS2、EGFR、MAPK8、MAPK14、PPARG、ESR1在網(wǎng)絡(luò)中處于核心位置。見圖3。

2.5 GO與KEGG富集分析 GO富集分析顯示，茯苓-白術(shù)藥對活性成分預測的作用靶基因富集主要涉及RNA Positive regulation of RNA polymerase Ⅱ promoter transcription、DNA transcription等生物學過程，nucleus、cell membrane等細胞組分以及Protein binding、DNA binding等分子功能。KEGG富集分析選出89條顯著富集通路。按照Count值進行排序，前15個結(jié)果被可視化。見圖4。

2.6 驗證實驗結(jié)果 通過PCR驗證了空白組和中藥組AGS細胞中PI3K、AKT、MAPK3的mRNA表達水平差異。發(fā)現(xiàn)中藥組可降低PI3K、AKT、MAPK3的 mRNA表達水平。見圖5。實驗結(jié)果證明，茯苓-白術(shù)藥對可能通過抑制PI3K-AKT通路表達進而抑制MAPK3的表達從而抑制胃癌的發(fā)生發(fā)展。

3 討論

胃癌可歸屬于中醫(yī)學“胃脘痛”“積聚”“癥瘕”等范疇。胃癌的病機多由痰瘀毒等病理因素等積聚于胃，相互作用形成癌腫。本研究結(jié)果顯示，茯苓-白術(shù)藥對活性成分“一對多”發(fā)揮多靶點調(diào)控胃癌作用。MAPK3、PTGS2、EGFR、MAPK8、MAPK14、PPARG、ESR1在PPI網(wǎng)絡(luò)中處于核心位置，是茯苓-白術(shù)藥對治療胃癌的重要靶點。MAPK3、MAPK8、MAPK14是MAPK家族成員，MAPK通路是參與細胞增殖、凋亡、侵襲關(guān)鍵信號通路之一，故當MAPK通路受到破壞時，可出現(xiàn)自身免疫性疾病、癌癥等[13]，MAPK通路可調(diào)控胃癌細胞的轉(zhuǎn)移侵襲[14]。Lin等[15]研究發(fā)現(xiàn)前列腺素內(nèi)過氧化物合酶(Prostaglandin Endoperoxide Synthase 2，PTGS2)在胃癌中表達豐富且與患者生存不良有關(guān)，PTGS2通過介導順鉑對B細胞淋巴瘤2表達的抑制作用，參與了順鉑耐藥性的發(fā)展過程。此外，PTGS2通過PGE2/前列腺素E受體亞型4(Prostaglandin E Receptor Subtype 4,EP4)/MAPKs[胞外信號調(diào)節(jié)激酶(Extracellular Signal-regulated Kinase，ERK)1/2，P38]軸介導順鉑誘導的B細胞淋巴瘤2表達和隨后的對細胞凋亡的抗性。研究表明表皮生長因子受體(Epidermal Growth Factor Receptor，EFGR)在胃癌組織中高表達[16]。Cheng等[17]發(fā)現(xiàn)在胃癌患者組織中觀察到趨化因子CXC亞家族受體(CXC Subfamily Receptor，CXCR)4和EGFR表達之間顯著正相關(guān)，趨化因子12/CXCR4和EGFR軸可以通過核因子κB通路相互調(diào)節(jié)表達，促進轉(zhuǎn)移。因此EGFR和CXCR4的同時抑制可能是胃癌的潛在治療策略。過氧化物酶體增殖物激活受體(Peroxisome Proliferator-activated Receptor，PPARγ)與炎癥有關(guān)，并且在癌癥的發(fā)展中起重要作用[18]。Liu等[19]研究發(fā)現(xiàn)通過激活人胃癌細胞PPARγ信號，可以誘導胃癌BGC-823細胞凋亡。此外，胃癌的發(fā)病與雌激素水平有關(guān)[20]，二者負相關(guān)[21]，雌激素與雌激素受體1(Estrogen Receptor，ER)1結(jié)合，通過Src等信號通路刺激胃癌細胞的生長[22]。

KEGG富集分析排除與胃癌無關(guān)的“Hepatitis B”“Alcoholism”等通路，得出胃癌的發(fā)病機制與“Viral Carcinogenesis”“PI3K-AKT Signaling Pathway”“Proteoglycans In Cancer”等信號通路相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，部分胃癌的發(fā)病與病毒感染有關(guān)，Tokunaga等[23]將存在EB病毒(Epstein-Barr Virus，EBV)感染的胃癌定義為EBV相關(guān)胃癌，其余為EBV非相關(guān)胃癌，EB病毒編碼小RNAs(EBV-encoded small RNAs,EBERs)是潛伏性EBV感染細胞中表達數(shù)量最多的病毒轉(zhuǎn)錄物，EBERs通過上調(diào)白細胞介素-6的表達并激活其下游調(diào)節(jié)因子信號轉(zhuǎn)導及轉(zhuǎn)錄激活因子(Signal Transduction and Activator of Transcription，STAT)3[24]，使細胞周期抑制劑P21和P27在胃癌細胞中的表達下調(diào)，促進胃癌的發(fā)生[25]。在腫瘤細胞中，PI3K-AKT信號通路是調(diào)節(jié)腫瘤細胞增殖、轉(zhuǎn)移的主要信號通路之一[26]，當該通路激活后，可以抑制胃癌細胞凋亡，促進血管形成，參與胃癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[27]。蛋白聚糖通路參與了腫瘤細胞的遷移、增殖等過程[28]，核心蛋白聚糖具有抑制腫瘤細胞生長作用，未來將成為腫瘤治療的一個新靶點[29]。Jiang等[30]發(fā)現(xiàn)多功能蛋白聚糖在胃癌組織中高表達，可能是胃癌患者預后指標[31]。轉(zhuǎn)錄失調(diào)參與人的生長發(fā)育、細胞分化、癌癥等多種生物學過程，已證實長鏈非編碼RNA失調(diào)與胃癌發(fā)生有關(guān)[32]。

4 小結(jié)

本研究將網(wǎng)絡(luò)藥理學結(jié)果與已知實驗結(jié)果對比，預測茯苓-白術(shù)藥對可通過靶向于PI3K-AKT信號通路及MAPK3蛋白表達調(diào)控胃癌細胞的增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移、血管再生等生物學過程。但僅僅是初步的預測，結(jié)果尚未在動物實驗及臨床得到證實，因此后期還需要更多的實驗去驗證，從而為進一步闡明其作用機制奠定堅實基礎(chǔ)。