李 娜 張 穎 李芳園 焦培英 張 義 王文娟

(1 哈勵(lì)遜國際和平醫(yī)院，衡水，053000； 2 河北工程大學(xué)，邯鄲，056038)

喉癌是發(fā)生在聲門部位及其周圍的組織，多數(shù)為原發(fā)性的頭頸部惡性癌癥，由于生活習(xí)慣的改變、工作環(huán)境、空氣污染等因素導(dǎo)致喉癌的發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升的態(tài)勢[1]。喉癌患者中男性所占比重較大，研究證明喉癌患者體內(nèi)的睪酮含量較健康人體高[2]，喉癌細(xì)胞能夠通過對(duì)附近組織的浸潤和轉(zhuǎn)移，現(xiàn)有的喉癌治療方法有手術(shù)、放療、化療和生物治療等多種方式[3]。雖然喉癌治療方案已逐步改良，但是這些治療方法存在一定的缺點(diǎn)，例如：口干、味覺與嗅覺靈敏度下降等不良反應(yīng)，因此，需要尋找一種不良反應(yīng)較小的藥物進(jìn)行治療至關(guān)重要。近幾年，中藥逐漸應(yīng)用于腫瘤的治療，因其有害成分比較少、對(duì)聲門部位損害小、疾病藥效穩(wěn)定等多種原因被廣泛應(yīng)用。小檗堿是在中藥黃連中提煉出的一種味極苦的黃色針狀結(jié)晶性的季銨生物堿粉末[4]。它能夠有效地治療多種疾病，如胃腸炎、化膿性中耳炎及惡性癌癥等。近年來臨床研究實(shí)驗(yàn)證明小檗堿能夠增強(qiáng)白血球吞噬作用，能夠有效抑制細(xì)菌的大量繁殖[5]。但關(guān)于小檗堿對(duì)喉癌細(xì)胞的進(jìn)行研究的相關(guān)文獻(xiàn)較少，在此基礎(chǔ)上本研究采用不同濃度的小檗堿對(duì)喉癌細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，分析其對(duì)喉癌細(xì)胞克隆、轉(zhuǎn)移及Toll樣受體4蛋白的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞培養(yǎng)、分組及處理 將小牛血清在57 ℃的環(huán)境下滅活30 min，在RPMI1640培養(yǎng)基中接種含10%小牛血清的喉癌細(xì)胞，在37 ℃，5% CO2培養(yǎng)，細(xì)胞聚合90%時(shí)，按照1∶3傳代，研究選取指數(shù)增長期的癌細(xì)胞。在25 mL的培養(yǎng)瓶中加入不同劑量的小檗堿分為4組，空白對(duì)照組(喉癌細(xì)胞正常培養(yǎng))，5 μmol/L小檗堿干預(yù)組(喉癌細(xì)胞培養(yǎng)基中加入5 μmol/L小檗堿)，10 μmol/L小檗堿干預(yù)組(喉癌細(xì)胞培養(yǎng)基中加入10 μmol/L小檗堿)，20 μmol/L小檗堿干預(yù)組(喉癌細(xì)胞培養(yǎng)基中加入20 μmol/L小檗堿)。

1.1.2 藥品與試劑 喉癌細(xì)胞株(Hep2)(上海撫生實(shí)業(yè)有限公司，貨號(hào)：FS-0255)；小檗堿(上?；菡\生物科技有限公司，貨號(hào)：025-17181)；細(xì)胞培養(yǎng)基[賽百慷(上海)生物技術(shù)股份有限公司]；Toll樣受體4抗體、Toll樣受體2抗體(深圳市豪地華拓生物科技有限公司，貨號(hào)：PL0305463、OL0305461)；胎牛血清(內(nèi)蒙古奧普賽生物科技有限公司，貨號(hào)：BS-1107-500 mL)；磷酸鹽緩沖液(Phosphate Buffered Saline，PBS)(廣州環(huán)凱生物科技有限公司，貨號(hào)：022117)；結(jié)晶紫染色液(背景索萊寶科技有限公司，貨號(hào)：G1061-500)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn) 選取對(duì)數(shù)生長期的喉癌細(xì)胞，將其消化為單細(xì)胞，進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)。將其密度調(diào)整為1×106細(xì)胞/L，加入5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L的小檗堿。進(jìn)行高溫殺菌后，為使其保持液體狀態(tài)將溫度保持在36 ℃左右，模擬生理環(huán)境，在5%CO2中培養(yǎng)14 d，克隆喉癌細(xì)胞，甲醛固定15 min，用結(jié)晶紫染色液，在37 ℃的CO2溫箱中培養(yǎng)24 h、48 h、72 h。把培養(yǎng)皿用儀器觀察，利用公式測算細(xì)胞克隆情況。克隆形成率=克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%。

1.2.2 蛋白質(zhì)印跡法(Western Blotting)檢測Toll樣受體4、Toll樣受體2蛋白水平 將5×103細(xì)胞/mL各組喉癌細(xì)胞0.125%胰蛋白酶消化，4 ℃ 12 000 r/min離心15 min，300×g，取上清液，檢測蛋白濃度，每孔加樣20 μg蛋白，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)面膜后取上清液以BAC法檢測蛋白濃度，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(每孔加樣20 μg蛋白)，轉(zhuǎn)膜后在含50 g/L脫脂奶粉的0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(Phosphate Buffered Saline，PBS)，室溫封閉1 h后，洗滌緩沖液(Tris Buffered Saline Tween,TBST)洗膜，轉(zhuǎn)膜后加入脫脂奶粉(50 g/L)、緩沖液，室溫封閉1 h，再次洗膜，加入一抗(1∶1 000)，4 ℃過夜，洗膜后加入二抗(1∶1 000)，37 ℃孵育1 h，ECL發(fā)光，Image J軟件對(duì)蛋白灰度值進(jìn)行計(jì)算。

1.2.3 MTT(噻唑藍(lán))法檢測細(xì)胞增殖 取對(duì)數(shù)生長期的喉癌細(xì)胞，加入蛋白酶消化，按照細(xì)胞數(shù)量5×104接種到96孔板，放置于37.4 ℃、5%CO2培養(yǎng)，每組設(shè)置6孔，培養(yǎng)0 h，24 h，48 h及72 h后，加入100 μL 10%的CCK-8培養(yǎng)基，按照常規(guī)進(jìn)行噻唑藍(lán)(3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2，5 diphenyhetrazolium bromide，MTT)實(shí)驗(yàn)，繼續(xù)培養(yǎng)3.5 h后，利用酶標(biāo)儀480 nm下計(jì)算細(xì)胞活力，細(xì)胞存活率=小檗堿組D值/空白對(duì)照組D值×100%。各設(shè)3個(gè)復(fù)孔進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移情況 將對(duì)數(shù)生長期的喉癌細(xì)胞取出，進(jìn)行消化收集，接種在96孔板中，4組細(xì)胞鋪設(shè)范圍達(dá)到90%時(shí)，用10 μL無菌槍尖劃痕，用PBS清洗細(xì)胞3次，清除破損細(xì)胞；記錄0 h和24 h時(shí)劃痕的大小，進(jìn)行拍照。劃痕閉合率(%)=(24 h劃痕寬度-0 h劃痕寬度)×100%。

1.2.5 流式法檢測細(xì)胞凋亡 將4組的細(xì)胞培養(yǎng)72 h后，進(jìn)行收集，PBS清洗2次，再用75%預(yù)冷乙醇40 ℃固定過夜，隨后用PBS洗滌，并重懸于含0.1 mg/mL的碘化丙啶中，室溫避光孵育30 min，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。

2 結(jié)果

2.1 小檗堿對(duì)喉癌細(xì)胞克隆形成率的影響 4組喉癌細(xì)胞在24 h、48 h及72 h時(shí)克隆形成率比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F24 h=3.469，F(xiàn)48 h=20.590，F(xiàn)72 h=30.691，均P<0.05)。在24 h時(shí)，空白對(duì)照組的細(xì)胞克隆形成能力與5 μmol/L小檗堿干預(yù)組相似(P>0.05)，空白對(duì)照組的細(xì)胞克隆能力較10 μmol/L小檗堿干預(yù)組、20 μmol/L小檗堿干預(yù)組高(P<0.05)；在48 h和72 h時(shí)，與空白對(duì)照組比較，其他加入小檗堿進(jìn)行干預(yù)的3組細(xì)胞克隆形成率均有明顯下降(P<0.05)。且20 μmol/L小檗堿干預(yù)組的克隆形成率明顯低于10 μmol/L小檗堿干預(yù)組、5 μmol/L小檗堿干預(yù)組(P<0.05)，隨著小檗堿作用時(shí)間延長、濃度升高，喉癌細(xì)胞克隆形成率逐漸減弱。見表1，圖1。

表1 各組喉癌細(xì)胞不同時(shí)間段克隆形成率比較

2.2 小檗堿對(duì)喉癌細(xì)胞中Toll樣受體2、Toll樣受體4表達(dá)的影響 與空白對(duì)照組細(xì)胞中Toll樣受體2及Toll樣受體4表達(dá)比較，5 μmol/L小檗堿干預(yù)組、10 μmol/L小檗堿干預(yù)組、20 μmol/L小檗堿干預(yù)組均有所降低(P<0.05)，與5 μmol/L小檗堿干預(yù)組、10 μmol/L小檗堿干預(yù)組比較，20 μmol/L小檗堿干預(yù)組細(xì)胞中Toll樣受體2及Toll樣受體4蛋白表達(dá)均下降(P<0.05)，隨著小檗堿濃度的升高，Toll樣受體2與Toll樣受體4蛋白表達(dá)降低，小檗堿可抑制Toll樣受體2與Toll樣受體4蛋白活性。見表2，圖2。

表2 各組喉癌細(xì)胞中Toll樣受體2和Toll樣受體4蛋白表達(dá)比較

2.3 小檗堿對(duì)喉癌細(xì)胞增殖的影響 給藥24 h、48 h、72 h后，與空白對(duì)照組比較，5 μmol/L小檗堿干預(yù)組、10 μmol/L小檗堿干預(yù)組、20 μmol/L小檗堿干預(yù)組細(xì)胞增殖率均有所降低(P<0.01)；與5 μmol/L小檗堿干預(yù)組、10 μmol/L小檗堿干預(yù)組比較，20 μmol/L小檗堿干預(yù)組細(xì)胞的增殖率有明顯的下降趨勢(P<0.05)，且給予小檗堿干預(yù)3組喉癌細(xì)胞增殖率依次遞減，隨著小檗堿作用時(shí)間延長，喉癌細(xì)胞增殖率逐漸降低，小檗堿可抑制喉癌細(xì)胞增殖。見表3，圖3。

表3 各組喉癌細(xì)胞增殖率情況

2.4 小檗堿對(duì)喉癌細(xì)胞劃痕距離的影響 24 h空白對(duì)照組、5 μmol/L小檗堿干預(yù)組、10 μmol/L小檗堿干預(yù)組、20 μmol/L小檗堿干預(yù)組喉癌細(xì)胞劃痕距離分別為(21.32±4.37)μm、(17.87±3.43)μm、(14.65±3.26)μm、(9.84±2.13)μm，與空白對(duì)照組比較，5 μmol/L小檗堿干預(yù)組、10 μmol/L小檗堿干預(yù)組、20 μmol/L小檗堿干預(yù)組在24 h時(shí)喉癌細(xì)胞劃痕距離均有所下降(P<0.05)。與5 μmol/L小檗堿干預(yù)組、10 μmol/L小檗堿干預(yù)組比較，20 μmol/L小檗堿干預(yù)組喉癌細(xì)胞劃痕距離縮短(P<0.05)，隨著小檗堿作用時(shí)間延長，喉癌細(xì)胞劃痕距離逐漸縮短。見圖2。

2.5 小檗堿對(duì)喉癌細(xì)胞凋亡的影響 48 h后空白對(duì)照組、5 μmol/L小檗堿干預(yù)組、10 μmol/L小檗堿干預(yù)組、20 μmol/L小檗堿干預(yù)組喉癌細(xì)胞凋亡率分別為(3.97±0.52)%、(7.36±0.63)%、(11.49±1.04)%、(19.83±2.38)%，與空白對(duì)照組比較，其余3組的喉癌細(xì)胞凋亡率逐漸升高(P<0.05)，與5 μmol/L小檗堿干預(yù)組、10 μmol/L小檗堿干預(yù)組比較，20 μmol/L小檗堿干預(yù)組喉癌細(xì)胞凋亡率均有所升高(P<0.05)，隨著小檗堿作用時(shí)間延長，喉癌細(xì)胞凋亡率逐漸升高，說明小檗堿可促進(jìn)喉癌細(xì)胞凋亡。見圖5。

3 討論

喉癌是喉黏膜上皮組織病變所造成鱗狀細(xì)胞癌，多發(fā)生在中國北部[6]。主要的誘發(fā)因素是煙酒刺激、飲食等，嚴(yán)重情況下喉部表面會(huì)出現(xiàn)惡臭氣味，以現(xiàn)有的醫(yī)學(xué)水平尚缺乏治療喉癌的靶向藥物，因此尋找不良反應(yīng)較小且療效較好的中藥是關(guān)鍵的一步。在現(xiàn)代醫(yī)療中研究表明中藥具有抗癌作用，利用其有效成分抑制癌細(xì)胞的生物活性可達(dá)到改善癌癥之功效[7]。小檗堿是一種從黃連中提煉而成的能夠治療心律失常及細(xì)菌性胃腸炎的藥物，有關(guān)報(bào)道提出小檗堿能夠阻礙癌細(xì)胞的迅速增殖，但是關(guān)于不同濃度小檗堿對(duì)喉癌細(xì)胞克隆、轉(zhuǎn)移與Toll樣受體4蛋白表達(dá)的研究較少[8]。

本研究發(fā)現(xiàn)空白對(duì)照組喉癌細(xì)胞增殖、克隆能力高于其他3組，細(xì)胞凋亡率低于其他3組，與5 μmol/L小檗堿干預(yù)組、10 μmol/L小檗堿干預(yù)組比較，20 μmol/L小檗堿干預(yù)組喉癌細(xì)胞克隆能力及增殖均減低，細(xì)胞凋亡率升高，且隨著小檗堿作用時(shí)間越長，效果更佳，說明小檗堿可抑制喉癌細(xì)胞增殖、克隆，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。當(dāng)聲門部位血管發(fā)生損傷或者發(fā)生其他病理疾病，小檗堿能夠有效改善其炎癥的發(fā)生[9]。閆波等[10]指出形成克隆的細(xì)胞具有增殖活性，小檗堿能夠有效抑制克隆細(xì)胞的形成，從根本上降低癌細(xì)胞活性。這一結(jié)論與本研究結(jié)果相似。喉癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移是由多因素多路徑共同作用的結(jié)果，Ren等[11]研究發(fā)現(xiàn)，小檗堿能夠有效減弱黑色素癌細(xì)胞中神經(jīng)鈣黏素的表達(dá),從而達(dá)到癌細(xì)胞的遷移速率降低的目的。謝天飛等[12]學(xué)者通過離體實(shí)驗(yàn)對(duì)Hep2細(xì)胞增進(jìn)行研究，結(jié)果表明與空白空白對(duì)照組比較，小檗堿組Hep2細(xì)胞生活活性降低，侵襲數(shù)量減少，其作用機(jī)制與調(diào)控P磷脂酰肌醇-3-激酶(Phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K)、p-蛋白激酶B表達(dá)水平有關(guān)，抑制細(xì)胞中血管內(nèi)皮生長因子、基質(zhì)金屬蛋白酶-2、基質(zhì)金屬蛋白酶-9活性，從而促進(jìn)Hep2細(xì)胞凋亡。小檗堿是小檗科植物中提取的一種含有氮雜環(huán)的季銨型生物堿，能發(fā)揮較好的抗炎、抗炎效果，可通過抑制蛋白、DNA的合成來抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展[13]。研究發(fā)現(xiàn)小檗堿抑癌作用在于阻滯細(xì)胞生長周期，使癌細(xì)胞停滯在G0/G1期[14]。有學(xué)者通過巨噬細(xì)胞與癌細(xì)胞共培養(yǎng)給予小檗堿干預(yù)，結(jié)果表明小檗堿可通過降低巨噬細(xì)胞來抑制癌細(xì)胞的活性[15]。邢天嬌等[7]學(xué)者通過建立皮膚鱗狀細(xì)胞癌大鼠模型給予小檗堿腹腔注射，結(jié)果表明，與空白對(duì)照組比較，小檗堿干預(yù)組裸鼠移植瘤細(xì)胞凋亡數(shù)量增加，凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)水平降低，其作用機(jī)制與上調(diào)Bax、胱天蛋白酶-3水平有關(guān)[7]。多項(xiàng)研究表明小檗堿具有抗癌機(jī)制，可抑制腫瘤相關(guān)蛋白和酶的活性、阻斷鉀離子通道、降低炎癥反應(yīng)，抑制腫瘤細(xì)胞的活性，同時(shí)小檗堿還可以提高腫瘤細(xì)胞對(duì)順鉑敏感性，達(dá)到抗腫瘤的結(jié)果[4,8,10]。

本研究表明，與空白對(duì)照組細(xì)胞中Toll樣受體2及Toll樣受體4蛋白表達(dá)比較，5 μmol/L小檗堿干預(yù)組、10 μmol/L小檗堿干預(yù)組、20 μmol/L小檗堿干預(yù)組均有所降低，與5 μmol/L小檗堿干預(yù)組、10 μmol/L小檗堿干預(yù)組比較，20 μmol/L小檗堿干預(yù)組細(xì)胞中Toll樣受體2及Toll樣受體4蛋白表達(dá)均下降，隨著小檗堿濃度的升高，Toll樣受體2與Toll樣受體4蛋白表達(dá)降低，說明小檗堿可抑制Toll樣受體2與Toll樣受體4蛋白活性。Toll樣受體是一類參與天然免疫的跨膜蛋白，通過樹突狀細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等進(jìn)行表達(dá)，當(dāng)出現(xiàn)損傷肌體時(shí)，它激活免疫細(xì)胞應(yīng)答，在免疫中發(fā)揮主要作用[16]。Toll樣受體2、Toll樣受體4是Toll樣受體中受體之一，Toll樣受體4與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有密切的關(guān)系，在多種腫瘤中如非小細(xì)胞性肺癌、甲狀腺癌、口腔癌等均異常表達(dá)[17-18]。王志平等[19]研究表明，發(fā)現(xiàn)爪蟾驅(qū)動(dòng)蛋白樣蛋白的靶向蛋白(Targeting Protein for Xenopus Kinesin-like Protein 2，TPX2)、Toll樣受體4在癌組織中的表達(dá)高于癌旁組織，TPX2在癌細(xì)胞中的過表達(dá)，可控制細(xì)胞的有絲分裂，下調(diào)TPX2可調(diào)控紡錘體微管相關(guān)蛋白進(jìn)而導(dǎo)致癌細(xì)胞的周期紊亂，使其增殖能力下降。Toll樣受體4可由局部內(nèi)源性酶激活，可調(diào)控炎癥及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞死亡，Toll樣受體4轉(zhuǎn)導(dǎo)免疫反應(yīng)是炎癥疾病的起點(diǎn)，會(huì)引起病毒性炎癥病變。有研究表明炎癥介質(zhì)最先轉(zhuǎn)入細(xì)胞膜中，與細(xì)胞膜受體(如Toll樣受體4等)結(jié)合，誘發(fā)炎癥反應(yīng)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞免疫逃逸，促進(jìn)腫瘤發(fā)展[19-20]。蔡靜等[21]通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)沉默Toll樣受體4信號(hào)可抑制宮頸癌增殖，穿膜細(xì)胞數(shù)明顯減少，降低Myd88,胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2及核因子κB蛋白的活性，從而抑制宮頸癌細(xì)胞的遷移及侵襲。熊鶯等通過對(duì)膀胱癌細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Toll樣受體2信號(hào)通路參與膀胱癌細(xì)胞免疫逃逸，其作用機(jī)制與上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子和TGF-β1信號(hào)通路有關(guān)[22]。有學(xué)者通過對(duì)Hela細(xì)胞進(jìn)行體外研究發(fā)現(xiàn)，不同劑量小檗堿干預(yù)的HeLa細(xì)胞，其增殖、遷移數(shù)量均降低，其作用機(jī)制與通過抑制p65、Bcl-2和Toll樣受體4表達(dá)水平來實(shí)現(xiàn)[23]。這與本研究結(jié)果相似，小檗堿通過調(diào)控TPX2、Toll樣受體4信號(hào)通路從而抑制喉癌細(xì)胞生物活性。

綜上所述，不同濃度小檗堿均可降低喉癌細(xì)胞克隆、增殖及遷移能力，其作用機(jī)制可能通過抑制Toll樣受體2、Toll樣受體4蛋白活性從而促進(jìn)喉癌細(xì)胞凋亡。