韋 偉，劉付祥，王文濤

(清鎮(zhèn)市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量檢測(cè)站/清鎮(zhèn)市農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)服務(wù)中心/清鎮(zhèn)市農(nóng)業(yè)廣播電視學(xué)校，貴州 清鎮(zhèn) 551400)

氟喹諾酮類藥物(FQS)是第3代哇諾酮藥物，主要包括恩諾沙星(ENR)、達(dá)氟沙星(DAN)、環(huán)丙沙星(CIP)、沙拉沙星(SFX)等。由于養(yǎng)殖行業(yè)對(duì)農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全的責(zé)任意識(shí)不強(qiáng)，存在部分違規(guī)使用獸藥、抗生素及違禁藥品和不嚴(yán)格執(zhí)行休藥期規(guī)定等諸多問(wèn)題，使得動(dòng)物性產(chǎn)品中獸藥殘留超標(biāo)[1-2]。生活中，當(dāng)過(guò)多食用含有藥物殘留的動(dòng)物性食品后，通常不表現(xiàn)為急性毒性，而是藥物在人體不斷蓄積，對(duì)人體神經(jīng)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)等多個(gè)系統(tǒng)造成損害[3]，更容易誘導(dǎo)人類致病菌對(duì)其耐藥性的增強(qiáng)，不利于該類藥物對(duì)人類疾病的治療[4]。農(nóng)業(yè)部于2002年已發(fā)布第235號(hào)公告《動(dòng)物性食品中獸藥最高殘留限量》中規(guī)定環(huán)丙沙星、達(dá)氟沙星、恩諾沙星、沙拉沙星在雞蛋中不得檢出。因此，不斷提高食品安全監(jiān)管能力和水平，利用有效檢測(cè)技術(shù)測(cè)定動(dòng)物性食品中獸藥殘留，對(duì)堅(jiān)決捍衛(wèi)人民群眾舌尖上的安全尤為重要。

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外已有諸多有關(guān)FQS殘留在動(dòng)物組織中的測(cè)定方法的報(bào)道[5-8]。主要有高效液相色譜法(HPLC)、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)及酶聯(lián)免疫分析法(ELISA)等。其中，HPLC法具有應(yīng)用范圍廣、分離能力強(qiáng)、檢測(cè)工作成本低、樣品易回收等特點(diǎn)，在實(shí)際工作中更具推廣性和實(shí)用性，但因儀器設(shè)備、環(huán)境條件等不同導(dǎo)致相關(guān)測(cè)定方法與行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)偏離較大，且回收率不穩(wěn)定。因此，本試驗(yàn)針對(duì)縣級(jí)檢驗(yàn)檢測(cè)機(jī)構(gòu)常用的《農(nóng)業(yè)部781號(hào)公告-6-2006 雞蛋中氟喹諾酮類藥物殘留量的測(cè)定 高效液相色譜法》檢測(cè)過(guò)程進(jìn)行優(yōu)化，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線、回收率試驗(yàn)、檢出限試驗(yàn)和精密度試驗(yàn)等，以期為雞蛋中氟喹諾酮類藥物殘留量的測(cè)定提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器設(shè)備

試驗(yàn)主要儀器設(shè)備：高效液相色譜儀(UiMate3000-FLD，Thermo Scientific，美國(guó))、酸度計(jì)(PHS-3C，上海)、高速離心機(jī)(Thermo Scientific,美國(guó))、組織勻漿器(Equl-kinematica，瑞士)、固相萃取柱(300 mg/mL)、有機(jī)濾膜(0.22 μm)及電子天平(0.01 g)等。

1.2 試劑材料

環(huán)丙沙星(C17H18FN3O3)、達(dá)氟沙星(CI9H20FN3O3)、恩諾沙星(C18R20FN3O3)、沙拉沙星(C20R17F2N3O3)標(biāo)準(zhǔn)樣品，標(biāo)準(zhǔn)值均為100 μg/mL(農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所)；乙腈(色譜純，美國(guó)BCR色譜試劑)、三乙胺(純度≥99.0%，廣東)、磷酸二氫鉀(分析純，純度≥85.0%，北京)。

1.3 色譜條件

色譜柱：Thermo C18柱，參數(shù)4.6×250 mm。檢測(cè)波長(zhǎng)：激發(fā)波長(zhǎng)280 nm；發(fā)射波長(zhǎng)450 nm。流速：1.0 mL/min。柱溫：35 ℃。進(jìn)樣量：20 μm。流動(dòng)相：0.05 mol/L磷酸/三乙胺溶液-乙腈(81+19),使用前過(guò)0.22 μm濾膜。

1.4 樣品制備

按標(biāo)準(zhǔn)稱取樣品(2±0.05)g，置于勻漿杯中，加提取液磷酸2.0 mL，攪勻振蕩10 min，5000 r/min 離心10 min。取上清液立即轉(zhuǎn)入另一離心管中。再用提取液磷酸鹽2.0 mL重復(fù)提取一次，洗殘?jiān)?，攪勻，振蕩和離心。然后，合并兩次提取的上層清液于同一離心管中，加入水飽和的正己烷10 mL，振蕩5 min，5000 r/min離心10 min，用吸管將上層正己烷絮凝狀固體仔細(xì)吸凈棄去，在下層溶液中再次加入水飽和正己烷10 mL，振蕩，離心。同樣，再棄去上層正己烷，下層為備用液。然后，將C18固相萃取柱(300 mg/mL)安裝于固相萃取裝置，并依次用乙腈5 mL,乙腈(30%)-緩沖液5 mL和磷酸鹽提取液5 mL潤(rùn)洗過(guò)柱，取備用液全部過(guò)柱，再用水5 mL過(guò)柱沖洗。加1 mL流動(dòng)相洗脫過(guò)柱，收集洗脫液作為試樣溶液，溶液過(guò)濾膜(0.25 μm)后供高效液相色譜分析。試驗(yàn)中，對(duì)《農(nóng)業(yè)部781號(hào)公告-6-2006雞蛋中氟喹諾酮類藥物殘留量的測(cè)定 高效液相色譜法》檢測(cè)過(guò)程進(jìn)行優(yōu)化，磷酸取液體積調(diào)整為20 mL,分兩次提??；備用液過(guò)柱分取5 mL；流動(dòng)相洗脫過(guò)柱的流動(dòng)相中乙腈比例調(diào)整為35%。

1.5 結(jié)果計(jì)算

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品提取與凈化

本試驗(yàn)結(jié)合農(nóng)業(yè)部781號(hào)公告-6-2006雞蛋中氟喹諾酮類藥物殘留量的測(cè)定方法，并在前期的"雞蛋中氟喹諾酮類藥物殘留量檢測(cè)方法"相關(guān)研究報(bào)道基礎(chǔ)上[9-12]，進(jìn)一步提高環(huán)丙沙星、達(dá)氟沙星、恩諾沙星、沙拉沙星的檢測(cè)靈敏度繼續(xù)進(jìn)行方法確認(rèn)和驗(yàn)證。研究表明，多數(shù)喹諾酮類在C-3含有酸性的羧基，C-7位連接有含氮堿性的哌嗪基等，屬酸堿兩性化合物，易溶于酸性或堿性溶劑，通過(guò)實(shí)驗(yàn)對(duì)比甲醇、乙腈和磷酸鹽三種提取液，磷酸鹽提取液雜質(zhì)少、回收率高，效果最佳[10]。此次試驗(yàn)，結(jié)合相關(guān)研究成果以及實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)研究，對(duì)農(nóng)業(yè)部781號(hào)公告-6-2006雞蛋中氟喹諾酮類藥物殘留量的測(cè)定方法前處理中提取液體積、備用液分取體積和洗脫液中乙腈的比例進(jìn)行了研究試驗(yàn)。樣品前處理中，提取液體積分別量取2 mL和10 mL磷酸鹽提取液重復(fù)2次提?。粋溆靡悍秩◇w積分別為全部和分取5 mL過(guò)柱；洗脫液體積分別量取1 mL的乙腈(19%)-緩沖液和1 mL的乙腈(35%)-緩沖液洗脫開(kāi)展對(duì)比試驗(yàn)。結(jié)果表明，按照農(nóng)業(yè)部781號(hào)公告-6-2006檢測(cè)方法磷酸提取液4 mL、備用液全部過(guò)柱和乙腈(19%)-緩沖液洗脫的處理方法添加回收率只能達(dá)到25.12%～36.20%；優(yōu)化后的20 mL磷酸提取液，備用液分取5 mL過(guò)柱和乙腈(35%)-緩沖液洗脫的處理方法添加回收率提高50%以上，達(dá)到90.40%～96.15%，氟喹諾酮類藥物殘留量的測(cè)定回收率得到大幅度提升。

2.2 校準(zhǔn)曲線與線性范圍

校準(zhǔn)曲線的數(shù)學(xué)方程式以及校準(zhǔn)曲線的工作范圍，濃度范圍盡可能覆蓋一個(gè)數(shù)量級(jí)，至少作5個(gè)檢測(cè)點(diǎn)(不包括空白)。此次試驗(yàn)，結(jié)合實(shí)驗(yàn)室經(jīng)驗(yàn)積累以及操作便利性對(duì)農(nóng)業(yè)部781號(hào)公告-6-2006檢測(cè)方法中校準(zhǔn)曲線梯度做了優(yōu)化。精確量取適量100 μg/mL環(huán)丙沙星、恩諾沙星和沙拉沙星標(biāo)準(zhǔn)工作液，用流動(dòng)相稀釋成濃度為5、10、 20、100、500 ng/mL的環(huán)丙沙星、恩諾沙星和沙拉沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液，精確量取適量達(dá)氟沙星標(biāo)準(zhǔn)工作液，用流動(dòng)相稀釋成濃度為1、2、4、20、100 ng/mL達(dá)氟沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液。供高效液相色譜分析(強(qiáng)制過(guò)原點(diǎn))。由表1可知，4種喹諾酮類藥物的回歸方程(強(qiáng)制過(guò)原點(diǎn))及相關(guān)系數(shù)，在5～500 ng/g 范圍內(nèi)線性良好，其中達(dá)氟沙星為1～100 ng/g,相關(guān)系數(shù)R2均達(dá)到0.9999以上。

表1 喹諾酮類藥物的回歸方程、相關(guān)系數(shù)Tab.1 Regression equation and correlation coefficient of quinolones

2.3 方法準(zhǔn)確度、回收率和檢出限

此次試驗(yàn)，取適量試樣添加溶液和相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，作多點(diǎn)校準(zhǔn)，以色譜峰面積積分值定量。標(biāo)準(zhǔn)工作液及試樣溶液中的環(huán)丙沙星、達(dá)氟沙星、恩諾沙星和沙拉沙星響應(yīng)值均應(yīng)在儀器檢測(cè)的線性范圍之內(nèi)。采用標(biāo)準(zhǔn)添加法，在空白雞蛋樣品中添加10 ng/mL的環(huán)丙沙星、達(dá)氟沙星、恩諾沙星、沙拉沙星進(jìn)行回收率試驗(yàn)，平行試驗(yàn)2個(gè)。在上述色譜條件下，藥物的出峰先后順序依次為環(huán)丙沙星、達(dá)氟沙星、恩諾沙星和沙拉沙星，空白溶液、標(biāo)準(zhǔn)溶液和試樣添加溶液的液相色譜圖見(jiàn)圖1、圖2和圖3。由此可見(jiàn)，4種氟喹諾酮類藥物分離效果好，基線平滑，峰形尖銳，對(duì)稱性好，且經(jīng)計(jì)算回收率均達(dá)到了90%以上(表2)，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于等于10%。通過(guò)優(yōu)化后的前處理方法，在標(biāo)準(zhǔn)色譜條件下，藥物不同濃度樣品試驗(yàn)，以信噪比S/N=3確定檢出限。結(jié)果表明，環(huán)丙沙星、恩諾沙星和沙拉沙星檢出限為5 ng/mL，達(dá)氟沙星檢出限為1 ng/mL。

圖1 雞蛋試樣中空白樣品色譜圖Fig.1 Liquid chromatogram of blank sample in eggs

圖2 氟喹諾酮類藥物混合標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖(20 ng/mL,4 ng/mL)Fig.2 Liquid chromatogram of Fluoroquinolones mixed standard substances

圖3 雞蛋中空白添加樣品色譜圖(10 ng/mL,2 ng/mL)Fig.3 Liquid chromatogram of blank addition sample eggs

表2 雞蛋中4種氟喹諾酮類藥物添加回收率(補(bǔ)充每個(gè)重復(fù)的回收率)Tab.2 Additive recovery of 4 fluoroquinolones in eggs

3 結(jié)論與討論

此研究針對(duì)縣(市)級(jí)農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢驗(yàn)檢測(cè)機(jī)構(gòu)常用的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)《農(nóng)業(yè)部781號(hào)公告-6-2006 雞蛋中氟喹諾酮類藥物殘留量的測(cè)定—高效液相色譜法》[16]進(jìn)行方法優(yōu)化，在最大限度遵循該參考標(biāo)準(zhǔn)基礎(chǔ)上進(jìn)行了研究試驗(yàn)，并參考了近年來(lái)國(guó)內(nèi)外諸多有關(guān)氟喹諾酮類藥物殘留在動(dòng)物組織中的測(cè)定方法的報(bào)道[13-16]。經(jīng)試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，標(biāo)準(zhǔn)中提取條件、色譜條件等影響因子不變，僅需對(duì)標(biāo)準(zhǔn)中關(guān)鍵部分優(yōu)化，即校準(zhǔn)曲線濃度梯度、磷酸鹽提取液體積調(diào)整為20 mL，洗脫液調(diào)整為乙腈(35%)-緩沖液，在UiMate3000-FLD高效液相色譜儀分析下雞蛋中氟喹諾酮類藥物殘留量的添加回收率達(dá)到90%以上，符合縣(市)級(jí)檢驗(yàn)檢測(cè)機(jī)構(gòu)對(duì)動(dòng)物性食品(雞蛋)中氟喹諾酮類藥物殘留量的測(cè)定要求。