楊秋悅,徐立軍,楊 洋,羅影子,黃明進(jìn)

(1.西藏藏醫(yī)藥大學(xué),西藏 拉薩 850000；2.貴州大學(xué) 農(nóng)學(xué)院/石斛研究院/貴州省藥用植物繁育與種植重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,貴州 貴陽(yáng) 550025)

手掌參為蘭科植物手參(Gymnadeniaconopsea(L.)R.Br)的干燥根,因其地下根莖形似手掌而得名手掌參[1],又名藏三七、掌參、佛手參、手兒參或旺拉。在中國(guó)主要分布在四川、西藏、青海等地,除中國(guó)外,朝鮮半島、日本、俄羅斯、西伯利亞及歐洲一些國(guó)家均有分布[1]。手掌參具有補(bǔ)益氣血、生津止渴的功效,主治肺虛咳喘、虛勞消瘦和神經(jīng)衰弱等,中醫(yī)臨床用于補(bǔ)腎益精、生津止渴、消瘀和理氣止痛[2]。此外,手掌參具有抗過(guò)敏、抗氧化作用[3]以及促進(jìn)祖細(xì)胞增殖的作用[4]。固相微萃取擁有簡(jiǎn)單便捷、費(fèi)用較少、易于自動(dòng)化等特色,且在萃取過(guò)程中不需要有機(jī)溶劑,可以和氣相色譜—質(zhì)譜(GC-MS)直接聯(lián)用,具有集采樣、萃取、濃縮及進(jìn)樣于一體的優(yōu)點(diǎn),被廣泛應(yīng)用在農(nóng)業(yè)[5]、食品和環(huán)境[6-7]等領(lǐng)域中。前人對(duì)手掌參的研究主要集中在其營(yíng)養(yǎng)成分(糖、脂肪、蛋白質(zhì)、粗纖維等)與藥用活性(抗氧化活性、延緩衰老等),目前還未有人對(duì)其揮發(fā)性成分進(jìn)行研究,手掌參具有明顯的氣味,證明其揮發(fā)性成分含量較豐富,對(duì)此進(jìn)行研究能更好的開(kāi)發(fā)利用手掌參藥材,本試驗(yàn)對(duì)7個(gè)(批)手掌參進(jìn)行了揮發(fā)性成分的初步研究。采用頂空固相微萃取技術(shù)(HS-SPME)萃取手掌參藥材中的揮發(fā)性成分,利用氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)聯(lián)用技術(shù)對(duì)不同產(chǎn)地手掌參中的揮發(fā)性成分進(jìn)行快速的定性、定量分析,采用主成分分析和聚類分析方法對(duì)獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì),為了解手掌參藥材揮發(fā)性物質(zhì)組成、評(píng)價(jià)藥材質(zhì)量提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用手掌參樣品由西藏藏醫(yī)藥大學(xué)徐立軍教授采購(gòu)并鑒定為蘭科植物手掌參(G.conopsea)的干燥根。共7個(gè)(批)樣品,按地理位置,自西向東分別采自西藏朗縣(Z1：經(jīng)度93°40′,緯度29°30′)、西藏米林(Z2：經(jīng)度94°13′,緯度29°13′)、西藏波密(Z3：經(jīng)度95°45′,緯度29°52′)、西藏昌都(Z4：經(jīng)度97°10′,緯度31°90′)、四川巴塘(Z5：經(jīng)度99°60′,緯度30°00′)、四川理塘(Z6：經(jīng)度100°16′,緯度30°00′)、四川阿壩(Z7：經(jīng)度101°42′,緯度32°54′)。

1.2 試驗(yàn)儀器

手動(dòng)SPME進(jìn)樣手柄、50/30 μm DVB/CAR/PDMS StableFlex萃取頭(美國(guó) Supelco公司)、HP6890/5975C GC-MS聯(lián)用儀(美國(guó)安捷倫公司)、電子天平(JA2003N,上海菁海儀器有限公司)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1頂空固相微萃取(HS-SPME)

將不同產(chǎn)地手掌參粉碎后過(guò)40目篩,稱取混勻樣品4.4～6.6 g,置于10 mL固相微萃取儀采樣瓶中,插入裝有2 cm50/30 μm DVB/CAR/PDMS StableFlex纖維頭的手動(dòng)進(jìn)樣器,在65 ℃的平板加熱條件下頂空萃取60 min后,移出萃取頭并立即插入氣相色譜儀進(jìn)樣口(溫度250 ℃)中,熱解析進(jìn)樣。

1.3.2氣相色譜—質(zhì)譜(GC-MS)分析

GC條件：色譜柱為Agilent HP-5MS(60 m×0.25 mm×0.25 μm)彈性石英毛細(xì)管柱,初始溫度50 ℃(保留2 min),以3.5 ℃/min升溫至160 ℃,再以10 ℃/min升溫至310 ℃,運(yùn)行時(shí)間48.43 min；汽化室溫度250 ℃；載氣為高純He(99.999%)；柱前壓16.79 psi,載氣流量1.0 mL/min,不分流,溶劑延遲時(shí)間3 min。

MS條件：離子源為EI源；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；電子能量70 eV；發(fā)射電流34.6 μA；倍增器電壓1635 V；接口溫度280 ℃；質(zhì)量范圍29～500 amu。

1.4 揮發(fā)性化合物定性定量分析

對(duì)總離子流圖中的各峰經(jīng)質(zhì)譜計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)系統(tǒng)檢索及核對(duì)Nist17和Wiley275標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖,確定揮發(fā)性化學(xué)成分,用峰面積歸一化法計(jì)算了各化學(xué)成分的相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 21.0軟件對(duì)不同產(chǎn)地手掌參樣品揮發(fā)性成分進(jìn)行主成分分析[8-9]和聚類分析[10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 HS-SPME-GC-MS結(jié)果分析

按1.4操作,得到7個(gè)(批)手掌參藥材揮發(fā)性成分總離子流圖(圖1)。采用峰面積歸一化法對(duì)揮發(fā)性成分進(jìn)行分析,計(jì)算各揮發(fā)性成分在不同樣品揮發(fā)性成分中的相對(duì)百分含量,結(jié)果見(jiàn)表1。7個(gè)(批)手掌參藥材樣品共有成分為20種,其含量差異較大(表1)。不同樣品中檢測(cè)到的揮發(fā)性成分種類最少為28個(gè),最多為60個(gè)(其中有3個(gè)成分未鑒定出是何物質(zhì)),其成分類型主要為醛、醇、酮、酸、烷烴等。朗縣產(chǎn)地的手掌參樣品檢測(cè)出60種成分,其中1個(gè)成分未知；米林產(chǎn)地的手掌參樣品檢測(cè)出34種成分,其中1個(gè)成分未知；波密產(chǎn)地的手掌參樣品檢測(cè)出28種成分,其中1個(gè)成分未知；昌都產(chǎn)地的手掌參樣品中檢測(cè)鑒定出38種成分；巴塘產(chǎn)地的手掌參樣品檢測(cè)出37種成分,其中1個(gè)成分未知；理塘產(chǎn)地的手掌參樣品檢測(cè)出34種成分,其中1個(gè)成分未知；阿壩產(chǎn)地的手掌參樣品檢測(cè)出36種成分,其中1個(gè)成分未知。

注：a表示西藏朗縣；b表示西藏米林；c表示西藏波密；d表示西藏昌都；e表示四川巴塘；f表示四川理塘；g表示四川阿壩。圖1 不同產(chǎn)地手掌參揮發(fā)成分總離子流圖Fig.1 Total ion flow diagram of volatile components of G.conopsea from different producing areas

表1 不同產(chǎn)地手掌參樣品揮發(fā)性成分

續(xù)表1

2.2 對(duì)揮發(fā)性成分進(jìn)行主成分分析

將數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析(PCA),由于變量太多,樣本量太少,無(wú)法構(gòu)成正定矩陣,因此對(duì)其變量因子進(jìn)行篩選,最終用茴香醚、壬醛、1-甲氧基-4-甲基-苯、鄰苯二甲酸二丁酯、乙酸、己醛6個(gè)揮發(fā)性成分建立7×6矩陣。將數(shù)據(jù)導(dǎo)入SPSS 21.0軟件,經(jīng)降維因子分析后,提取特征值大于1的,只有2個(gè)主成分,且方差貢獻(xiàn)率小于80%,故手動(dòng)提取3個(gè)主成分,累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為89.94%(>85 %),可以反映不同產(chǎn)地手掌參樣品揮發(fā)性成分的大部分信息(表2)。通過(guò)因子載荷矩陣中主成分負(fù)荷向量計(jì)算因子得分系數(shù),因子得分系數(shù)=矩陣各主成分負(fù)荷向量/各主成分特征值的平方根,表示各項(xiàng)指標(biāo)變量與提取的公因子之間的關(guān)系(表3),在某一公因子上得分高,表明該指標(biāo)與該公因子之間關(guān)系越密切。

由表3可得到,3個(gè)主成分的因子評(píng)價(jià)線性關(guān)系：

F1= 0.231X1-0.147X2-0.257X3+0.263X4-0.173X5+0.211X6

F2= -0.504X1-0.574X2+0.177X3+0.125X4+0.336X5+0.486X6

F3= 0.078X1+0.628X2-0.192X3+0.326X4+0.724X5+0.308X6

由上述公式算出各成分的F1、F2、F3值,綜合得分F由每個(gè)主成分對(duì)應(yīng)的特征值占所提取主成分總特征值之和的比例作為權(quán)重計(jì)算主成分綜合模型：F=0.58565F1+0.17026F2+0.14344F3,見(jiàn)表4,計(jì)算因子得分可對(duì)樣本進(jìn)行比較。

表4 不同產(chǎn)地手掌參樣品的主成分因子得分Tab.4 Principal component factor scores of G.conopsea samples from different origins

從表4中F因子值可知,手掌參的藥材質(zhì)量為Z7>Z6>Z2>Z3>Z4>Z1>Z5,即四川阿壩>四川理塘>西藏米林>西藏波密>西藏昌都>西藏朗縣>四川巴塘,此結(jié)果基于提取茴香醚、壬醛、1-甲氧基-4-甲基-苯這3個(gè)成分代表手掌參揮發(fā)性總成分基礎(chǔ)上得出。

2.3對(duì)揮發(fā)性成分進(jìn)行聚類分析

運(yùn)用 SPSS 21.0 軟件,采用 Ward′s 聚類法,以Euclidean 距離為測(cè)度,以12個(gè)成分(乙醇、乙酸、己醛、2-戊基-呋喃、2-乙基己醇、對(duì)甲酚、3,4-二甲氧基甲苯、1-甲氧基-4-甲基-苯、茴香醚、鄰苯二甲酸二丁酯、E-2-辛烯醛、壬醛)為主要變量,對(duì)7個(gè)不同產(chǎn)地的手掌參樣品進(jìn)行了聚類分析,結(jié)果如圖2所示。當(dāng)歐氏距離為10時(shí),7個(gè)樣品被聚為2類,產(chǎn)地為西藏米林、西藏波密、西藏昌都、四川巴塘、四川理塘、四川阿壩的聚為1類,產(chǎn)地為西藏朗縣的單獨(dú)聚為1類；當(dāng)歐式距離為5時(shí),7個(gè)樣品被分為3類,產(chǎn)地為西藏昌都、西藏米林、西藏波密、四川巴塘的聚為1類,產(chǎn)地為四川阿壩和四川理塘的聚為1類,產(chǎn)地為西藏朗縣的單獨(dú)聚為1類。由此可看出西藏朗縣所產(chǎn)的手掌參與其他產(chǎn)地的有明顯差異,在揮發(fā)性成分測(cè)定中此樣品揮發(fā)性成分最多,且有多個(gè)其他產(chǎn)地沒(méi)有檢測(cè)出的成分。根據(jù)地理位置判定,7個(gè)產(chǎn)地中,朗縣最靠近西邊,與其他產(chǎn)地的手掌參有明顯的差異,故而根據(jù)經(jīng)度差異,可簡(jiǎn)單分為94°E以西為一類,94°E以東為一類。西藏昌都和四川阿壩分屬于不同兩個(gè)省級(jí)行政區(qū),但由于處在川藏交界,且經(jīng)度相近,故2個(gè)手掌參樣品有很大相似性,可知手掌參的揮發(fā)性成分受地域影響大。

圖2 7個(gè)不同產(chǎn)地手掌參樣品的聚類分析Fig.2 Cluster analysis of seven G.conopsea samples from different origins

3 結(jié)論與討論

采用HS-SPME-GC-MS法對(duì)來(lái)自川藏7個(gè)(批)不同產(chǎn)地手掌參樣品的揮發(fā)性成分測(cè)定分析,共測(cè)定出70個(gè)成分,其中3個(gè)成分未能確定其構(gòu)成,共有成分有20個(gè),其中含量最多的是對(duì)甲酚,含量在57%～81%之間,其次為茴香醚和己醛,兩者差異不大,無(wú)法作為分辨指標(biāo)。本試驗(yàn)對(duì)手掌參藥材評(píng)價(jià)根據(jù)主成分分析,提取茴香醚、壬醛、1-甲氧基-4-甲基-苯這3個(gè)成分進(jìn)行降維分析,得出四川阿壩>四川理塘>西藏米林>西藏波密>西藏昌都>西藏朗縣>四川巴塘這一結(jié)果,但由于樣品來(lái)源少且沒(méi)有同一產(chǎn)地不同批次的樣品,故此結(jié)果具局限性,只是對(duì)手掌參樣品揮發(fā)性成分的初步研究。日照是植物進(jìn)行光合作用的必要條件,日照時(shí)數(shù)可能通過(guò)影響揮發(fā)性成分前體物質(zhì)的供給而對(duì)揮發(fā)性成分的合成產(chǎn)生影響[11-12]。低溫或高溫會(huì)對(duì)植物細(xì)胞膜系統(tǒng)的穩(wěn)定性造成破壞并誘導(dǎo)活性氧積累,從而誘導(dǎo)萜類、酚類等具有清除自由基等功能的次生代謝物的合成[13]。前人研究證明揮發(fā)性成分受日照、氣候等環(huán)境因子影響大,故測(cè)定結(jié)果具不穩(wěn)定性。

與蘭科植物相比,手掌參與石斛花含有的相同揮發(fā)性成分有：己醛、苯甲醛、苯甲醇、壬醛、十四烷、十五烷、庚醛、2-庚酮、(Z)-2-庚烯醛、2-戊基呋喃、(E)-2-辛烯醛[14-16]；與天麻含有的相同揮發(fā)性成分：2-庚酮、苯甲醛、1-辛烯-3-醇、2-戊基呋喃、3-辛烯-2-酮、苯乙醛、庚醛、對(duì)甲酚、十五烷、十六烷、乙酸、己酸、戊醛[17-18]；與白芨花含有的相同揮發(fā)性成分：1-辛烯-3-醇、苯甲醇、戊醛、己醛、庚醛、壬醛、苯甲醛、十五烷、十六烷、對(duì)甲酚[19]?？梢?jiàn),在蘭科植物的揮發(fā)性成分中,有許多共有成分,且多數(shù)為醛、酮類物質(zhì)。

在這些揮發(fā)性成分中,對(duì)甲酚用于制染料、消毒藥、藥品、樹(shù)脂和增塑劑等[20]；茴香醚具有令人愉快的茴香樣香氣,用于有機(jī)合成,也用作溶劑、香料和驅(qū)蟲(chóng)劑[21]；壬醛為無(wú)色油狀液體,具有玫瑰、柑橘等香氣,有強(qiáng)的油脂氣味[22]；己醛可用于調(diào)配蘋(píng)果、橙子、漿果、西瓜等食用香精[22]；鄰苯二甲酸二丁酯為增塑劑,對(duì)多種樹(shù)脂具有很強(qiáng)溶解力[23],由于手掌參含有這些成分故而其具有很濃厚且混合的味道。

試驗(yàn)結(jié)果顯示川藏不同產(chǎn)地的手掌參有多種相同化學(xué)成分但含量差異大,由于揮發(fā)性成分受環(huán)境影響大,故在評(píng)價(jià)其品質(zhì)時(shí),應(yīng)全面考察其指標(biāo)成分,未來(lái)還可測(cè)定其他省份的手掌參樣品揮發(fā)性成分,以及不同收獲季節(jié)即不同批次的手掌參樣品進(jìn)行更加深入的研究。