曹廣文

0 引言

目前我國人口平均壽命約為76歲，在此之前的死亡稱為“非成熟死亡”。降低非成熟死亡是醫(yī)學(xué)工作的重中之重。原發(fā)性肝癌（primary liver cancer,PLC）居我國惡性腫瘤所致非成熟死亡原因的第一位[1-2]。我國人口占全球人口的1/5，乙肝病毒（hepatitis B virus,HBV）慢性感染占全球的1/3，PLC發(fā)病和死亡均占全球的1/2。我國大陸地區(qū)PLC中肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）占93.0%、肝內(nèi)膽管癌（intrahepatic cholangiocarcinoma,ICC）占4.3%，肝細(xì)胞癌-膽管癌混合型（combined hepatocellular-cholangiocarcinoma,CHC）占1.6%[3]。HCC只發(fā)生在有慢性損傷的肝臟中，能夠?qū)е侣愿螕p傷和慢性炎性反應(yīng)的疾病和行為，均可增加HCC風(fēng)險。目前HCC主要危險因素有HBV慢性感染、黃曲霉素暴露、丙型肝炎病毒慢性感染、慢性脂肪性肝炎、非酒精脂肪肝、酒精性肝病、糖尿病、肝吸蟲感染和馬兜鈴酸暴露等。HBV慢性感染是我國HCC的主要病因。HBV-HCC比其他原因引起HCC早發(fā)病10～12年，并具有更高比例的微血管侵襲（microvascular invasion,MVI）、更多子灶。HBV復(fù)制促進(jìn)HCC不良預(yù)后，說明HBV除了通過引發(fā)慢性炎性反應(yīng)和肝硬化以促進(jìn)HCC發(fā)生外，還有直接促HCC轉(zhuǎn)移的作用。其他致癌因素如黃曲霉素暴露、肝吸蟲等只有在HBV慢性感染基礎(chǔ)之上才能加快HCC發(fā)生。我國HBV慢性感染也是其他組織類型PLC的主要病因。在我國大陸地區(qū)，HCC、ICC和CHC中HBV陽性率分別是84.4%、38.6%和77.1%[3]。PLC惡性程度高，目前手術(shù)切除和肝移植是主要治療手段。但是術(shù)后復(fù)發(fā)率高，即使是單個直徑小于2 cm的HCC，術(shù)后5年復(fù)發(fā)率也達(dá)到68%，早期復(fù)發(fā)患者的預(yù)后較遠(yuǎn)期復(fù)發(fā)患者差[4]。轉(zhuǎn)移是HCC預(yù)后最重要的影響因素，門靜脈癌栓（portal vein tumor thrombosis,PVTT）和MVI是HCC肝內(nèi)轉(zhuǎn)移最主要的方式，是HCC不良預(yù)后預(yù)測的最主要指標(biāo)[3-5]。細(xì)胞癌變到復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移依賴于細(xì)胞不斷的進(jìn)化過程。癌細(xì)胞本身所經(jīng)歷的“變異-選擇-適應(yīng)”的進(jìn)化過程依賴于腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment,TME）對體細(xì)胞變異的促進(jìn)、選擇和適應(yīng)。闡明HBV致HCC的主要機(jī)制，探索有效的靶向驅(qū)動通路的新免疫-靶向聯(lián)合治療技術(shù)，對提高HCC患者生存、降低HCC非成熟死亡具有重要意義。

1 不同病因的HCC遺傳特征及其與轉(zhuǎn)移的關(guān)系

1.1 HBV-HCC及其他原因相關(guān)HCC基因組變異特點(diǎn)

和正常細(xì)胞相比，癌細(xì)胞基因組發(fā)生了系列改變，包括染色體擴(kuò)增、重排和基因變異。這些改變賦予腫瘤細(xì)胞掠奪營養(yǎng)、無序生長特性。癌細(xì)胞的惡性程度取決于其本身特性和致癌因素。HBV不但促進(jìn)HCC的發(fā)生，而且促進(jìn)HCC轉(zhuǎn)移和術(shù)后復(fù)發(fā)。HBV致癌機(jī)制有三要素：HBV變異賦予更高的致癌能力；HBV復(fù)制致更持久的炎性反應(yīng)；HBV基因整合失活腫瘤抑制基因，激活癌癥促進(jìn)基因表達(dá)，尤其是C末端截斷型HBx（C-terminal truncated HBx,Ct-HBx）基因整合到端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（telomerase reverse transcriptase,TERT）、甲基轉(zhuǎn)移酶（MLLs）等[3,6-7]。不同病因?qū)е碌腍CC體細(xì)胞變異譜有一定區(qū)別。中國人HCC常見體細(xì)胞單個堿基替換變異中，受炎性反應(yīng)因子誘導(dǎo)的胞苷脫氨酶AID/APOBEC3s和老年相關(guān)的C＞T/G＞A轉(zhuǎn)換頻率最高，達(dá)23.1%。涉及基因主要有TP53（突變率達(dá)56.5%）、TERT（編碼端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶，突變率45.2%）、CTNNB1（編碼β-catenin，突變率22.6%）和ARID1A（突變率9.5%），TP53和TERT聯(lián)合變異率最高，突變率達(dá)32.1%[8]。TP53（R249S、V157F、Y220S和P250R）和CTNNB1基因變異頻率最高，SWI/SNF染色質(zhì)重塑復(fù)合體重要組成亞單位（ARID1A、ARID1B和ARID2）、組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶（MLL4和MLL3）在50%的HCC中出現(xiàn)變異，HBV在TERT位點(diǎn)發(fā)生整合率最高，CTNNB1變異與HBV關(guān)系不明顯[9]。SWI/SNF染色體重塑復(fù)合體中ARID1A最常發(fā)生突變，在HCC中是常見的腫瘤抑制基因。外顯子測序分析發(fā)現(xiàn)，ARID1A編碼區(qū)變異（Q1212L和Y1211）可以在13%的HBV-HCC樣本中被檢出；敲低ARID1A促進(jìn)HCC細(xì)胞遷移和侵襲。在HCC發(fā)生發(fā)展過程中，促進(jìn)HCC進(jìn)展的mTOR通過失活A(yù)RID1A-SWI/SNF復(fù)合體功能而發(fā)揮作用[10]。HBV整合不但可以使TP53基因失活，而且HBV增強(qiáng)子整合到癌基因附近能夠大幅度提高M(jìn)YC等癌基因的表達(dá)水平，增強(qiáng)TERT的活性，促進(jìn)HCC端粒延長，加深HCC惡性程度，使HCC好發(fā)于年輕患者，且預(yù)后不良[11]。在41.7%的ICC患者中存在HBV整合，最常見的整合位點(diǎn)仍然是TERT啟動子，常導(dǎo)致TERT啟動子活性大幅度提高；第二個常見的HBV整合位點(diǎn)是FAT2基因，該整合位點(diǎn)常與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelialto-mesenchymal transition，EMT）有關(guān)；整合在DMRTA1和LINC01239之間的HBV基因組可以通過激活mTOR/4EBP/S6K信號通路促進(jìn)ICC的惡性表型[12]。癌細(xì)胞進(jìn)一步變異，伴隨EMT和獲得干性特征，促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)和耐藥。這個過程代表了癌細(xì)胞去分化和逆向發(fā)育的過程。發(fā)生EMT和獲得干性特征是腫瘤轉(zhuǎn)移和術(shù)后復(fù)發(fā)的關(guān)鍵步驟，主要是增加了腫瘤細(xì)胞遷移、對抗腫瘤藥物耐藥和復(fù)發(fā)的能力。癌癥干細(xì)胞（cancer stem cells,CSCs）是腫瘤組織中獲得干性特征的亞克隆，具有自我更新、維持腫瘤形成能力，也可以分化成多種腫瘤細(xì)胞以支持腫瘤的生長。EMT和CSC并非完全一致。間質(zhì)狀態(tài)是腫瘤侵襲和擴(kuò)散期必需的，但不足以誘導(dǎo)腫瘤轉(zhuǎn)移，而后期具有干性的上皮狀態(tài)是保證轉(zhuǎn)移的必要因素。國內(nèi)學(xué)者關(guān)于CSCs研究較多，這里不贅述[13]。就HCC來說，TP53、TERT、ARID1A和MLL4突變在HCC發(fā)生和轉(zhuǎn)移中起重要作用；EMT是促進(jìn)HCC細(xì)胞侵襲、遷移、腫瘤干性、發(fā)生門靜脈侵襲和藥物抵抗的關(guān)鍵。

1.2 HCC體細(xì)胞變異與腫瘤抗原性的關(guān)系

HCC發(fā)生過程中的體細(xì)胞基因突變，導(dǎo)致氨基酸改變，形成腫瘤新抗原。腫瘤特異性抗原和相關(guān)性抗原是腫瘤免疫治療的關(guān)鍵，因?yàn)槟[瘤特異性T細(xì)胞免疫反應(yīng)依賴于腫瘤抗原的產(chǎn)生和提呈。新一代測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)了包括HCC在內(nèi)的多種腫瘤變異譜。腫瘤突變負(fù)荷（tumor mutational burden,TMB）常被用來衡量腫瘤新抗原數(shù)量。每兆堿基超過20個體細(xì)胞變異的腫瘤被稱為高TMB腫瘤，高TMB腫瘤的腫瘤免疫原性高[14]。HCC基因組每兆堿基只有5個可以改變抗原性的非同義體細(xì)胞變異，提示HCC免疫原性中等偏下，免疫治療效果面臨挑戰(zhàn)。

1.3 基因組外DNA在HBV-HCC進(jìn)化發(fā)育中的作用

癌基因往往在基因組外DNA（extrachromosomal DNA particles,ecDNA）中大量擴(kuò)增。通過整合RNA-seq和全基因組測序數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)ecDNA中編碼的癌基因大都是在癌癥中高表達(dá)的基因。這種攜帶癌基因的ecDNA在惡性腫瘤中常以環(huán)狀形式存在。環(huán)形ecDNA比線性ecDNA拷貝數(shù)高很多。在環(huán)形ecDNA中擴(kuò)增的癌基因轉(zhuǎn)錄水平遠(yuǎn)高于非環(huán)狀基因組，顯著促進(jìn)癌癥的惡性表型。DNA模板拷貝數(shù)并非決定基因表達(dá)的唯一決定因素，染色體結(jié)構(gòu)也影響轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制的可及性。應(yīng)用轉(zhuǎn)座酶可及性染色質(zhì)測序分析（assay for transposase accessible chromatin using sequencing,ATAC-seq）等可以確定染色質(zhì)可及性，定位核小體位置。ATAC-seq聯(lián)合全基因組測序可確定ecDNA中癌基因[15]。目前抗HBV治療不能根除HBV，主要原因是肝細(xì)胞核中HBV共價閉合環(huán)形DNA（covalently closed circular DNA,cccDNA）的存在。干擾素（IFN）對cccDNA有降解作用，主要是通過誘導(dǎo)APOBEC3s表達(dá)，但是這個過程不但慢，而且促進(jìn)APOBEC3s-誘導(dǎo)的HBV變異。在癌旁肝組織中，HBV cccDNA水平與HBeAg和HBV DNA載量呈正相關(guān)關(guān)系，cccDNA載量與HCC不良預(yù)后呈正相關(guān)，癌旁肝組織高載量HBV cccDNA都是HCC生存的獨(dú)立危險因素[16]。

1.4 染色體不穩(wěn)定性在HBV-HCC進(jìn)化發(fā)育中可能的作用

染色體不穩(wěn)定性（chromosomal instability,CIN）是人類腫瘤的標(biāo)志。CIN主要源于染色體有絲分裂過程中的錯誤，導(dǎo)致染色體結(jié)構(gòu)和數(shù)量的改變。CIN與染色體非整數(shù)倍性不同：染色體非整數(shù)倍性主要指染色體數(shù)目異常，CIN是指染色體分裂錯誤，兩者在癌癥中都常見，常常同時存在。CIN與包括肝膽腫瘤在內(nèi)的惡性腫瘤分期呈正相關(guān)，在復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移腫瘤中富集。數(shù)量和結(jié)構(gòu)性CIN常形成微核，后者以雙鏈DNA（dsDNA）形式存在于細(xì)胞質(zhì)中，激活細(xì)胞的炎性反應(yīng)信號。在細(xì)胞分裂的S期，微核被穿破，dsDNA暴露于細(xì)胞質(zhì)，激活機(jī)體一種稱為環(huán)鳥苷一磷酸-腺苷一磷酸合成酶干擾素基因刺激分子（cyclic GMP-AMP synthase-stimulator of interferon genes,cGAS-STING）抗病毒通路。在正常細(xì)胞中，急性cGAS-STING促進(jìn)Ⅰ型IFN產(chǎn)生，促進(jìn)衰老和免疫功能，產(chǎn)生抗病毒作用；但在癌癥細(xì)胞中，細(xì)胞質(zhì)dsDNA往往抑制Ⅰ型IFN信號，替代了另外的STING依賴性炎性反應(yīng)信號通路——非經(jīng)典型NF-κB信號。非經(jīng)典型NF-κB信號激活可介導(dǎo)衰老相關(guān)分泌表型（senescence-associated secretory phenotype,SASP）。CIN通過促進(jìn)SASP相關(guān)細(xì)胞因子的產(chǎn)生，招募免疫細(xì)胞到TME，促進(jìn)腫瘤發(fā)生，繞過衰老，促進(jìn)癌癥轉(zhuǎn)移和治療抵抗；染色體非整數(shù)倍也與TME中巨噬細(xì)胞的密度顯著相關(guān)，通過激活轉(zhuǎn)化生長因子（TGF-β）體現(xiàn)了免疫抑制性表型[17]。因此，TME中炎性反應(yīng)細(xì)胞有可能對dsDNA誘發(fā)的cGAS-STING有重要影響。

2 TME中免疫相關(guān)細(xì)胞及分子對HCC轉(zhuǎn)移的調(diào)控作用

2022年瑞典著名腫瘤學(xué)者Douglas Hanahan在第三次發(fā)表“癌癥標(biāo)志性特征”時，提出將“解鎖表型可塑性”、“非突變的表觀遺傳重編程”和“細(xì)胞老化”作為新標(biāo)志加入癌癥特征序列中[18]?！敖怄i表型可塑性”主要指“去分化或逆向分化”，“非突變的表觀遺傳重編程”主要指“在TME中進(jìn)行表觀遺傳重塑”。這與“癌癥進(jìn)化發(fā)育學(xué)”理論體系中“逆向發(fā)育”非常相似[19]。腫瘤細(xì)胞的進(jìn)化和逆向發(fā)育，離不開TME對變異細(xì)胞的選擇以及變異細(xì)胞對TME的適應(yīng)過程。HCC是典型的炎性反應(yīng)相關(guān)惡性腫瘤。TME是一個由非特異和特異性免疫細(xì)胞組成的復(fù)雜生態(tài)系統(tǒng)，在HCC發(fā)生和進(jìn)展中起決定性作用。

肝臟是人體最大的免疫抑制器官。肝臟巨噬細(xì)胞（Kupffer細(xì)胞）、肝星形細(xì)胞（hepatic stellate cells,HSCs）和肝竇狀內(nèi)皮細(xì)胞協(xié)同維護(hù)了致耐受性的微環(huán)境。Kupffer細(xì)胞不但提呈抗原，還分泌抑制性分子如IL-10、前列腺素E2和吲哚胺2-3二氧酶-1（indoleamine 2,3-dioxygenase-1,IDO1），促進(jìn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）活化；肝竇狀內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)高水平PD-L1，促進(jìn)TGF-β對Treg的誘導(dǎo)；HSC釋放肝細(xì)胞生長因子（hepatocyte growth factor,HGF），促進(jìn)骨髓來源的抑制細(xì)胞（myeloidderived suppressor cell,MDSC）和Treg細(xì)胞聚集于肝臟，并通過PD-L1誘導(dǎo)效應(yīng)T細(xì)胞凋亡。

2.1 TME中主要免疫細(xì)胞和炎性反應(yīng)分子

TME主要由細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix,ECM）、輔助細(xì)胞、免疫細(xì)胞、細(xì)胞因子、趨化因子和生長因子等組成[14]。TME中輔助細(xì)胞主要有腫瘤相關(guān)纖維細(xì)胞（cancer-associated fibroblast,CAF）、HSC和血管內(nèi)皮細(xì)胞；免疫細(xì)胞主要有腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（tumor-associated microphage,TAM）、腫瘤相關(guān)中性粒細(xì)胞（tumor-associated neutrophil,TAN）、Treg、抑制性B細(xì)胞、MDSCs、樹突細(xì)胞（dendritic cells,DCs）、細(xì)胞毒性CD8+T細(xì)胞（cytotoxic CD8+T lymphocyte,CTL）和NK細(xì)胞。這些TME內(nèi)細(xì)胞群的主要功能可分為三大類：免疫抑制、免疫調(diào)節(jié)和免疫增強(qiáng)。TME中，CD8+T細(xì)胞、NK、DCs以及Th1細(xì)胞因子（IL-2、IFN-γ、IL-12等）參與抗腫瘤、抗病毒免疫，抑制腫瘤轉(zhuǎn)移；TAN、Treg、Th17、M2 TAMs、CAFs以及Th2細(xì)胞因子促進(jìn)免疫逃逸，促進(jìn)HCC轉(zhuǎn)移；Treg/CD8+T、Th17/Th1比例高與TME中“陰性炎性反應(yīng)”水平相關(guān)并促進(jìn)HCC轉(zhuǎn)移[20]。TME中腫瘤細(xì)胞與免疫相關(guān)細(xì)胞通過表達(dá)共抑制受體，包括細(xì)胞毒性T細(xì)胞相關(guān)抗原4（cytotoxic T lymphocyte associated antigen 4,CTLA4）、PD-1、TIM3和淋巴細(xì)胞活化基因3（lymphocyte-activation gene 3,LAG3）、分泌相關(guān)免疫因子或通過其他未知途徑，相互交流信息，共同維持了TME穩(wěn)定性。HCC的TME中免疫抑制力量要超過抗腫瘤免疫力量，整體有免疫抑制特性。

2.2 TME中主要發(fā)揮免疫抑制的細(xì)胞種類和作用機(jī)制

HCC轉(zhuǎn)移主要以PVTT形式進(jìn)行。在PVTT發(fā)生過程中，TME中重要調(diào)控輔助細(xì)胞-CAFs通過下調(diào)細(xì)胞外基質(zhì)信號通路—核心蛋白多糖-β1整合素信號通路，促進(jìn)HCC的血管侵襲。β1整合素促進(jìn)HCC侵襲，而核心蛋白多糖通過降低β1整合素抑制HCC體外侵襲和遷移[21]。腫瘤來源的溶血磷脂酸可激活CAFs，CAFs產(chǎn)生的HGF可以調(diào)節(jié)HCC干細(xì)胞的可塑性，促進(jìn)TME中的中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等的集聚，激活如MDSCs和Treg等免疫抑制細(xì)胞，促進(jìn)HCC組織中的缺氧和纖維化。CAFs產(chǎn)生的內(nèi)皮唾液酸蛋白誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的極化，促進(jìn)HCC進(jìn)展。CAFs通過IL-6/STAT3信號通路激活PD-L1+TANs和受損T細(xì)胞，促進(jìn)腫瘤免疫逃逸[22]。

TAMs在HCC生長中起關(guān)鍵作用。巨噬細(xì)胞是HCC組織中密度最高的免疫細(xì)胞，其中M1型巨噬細(xì)胞通過刺激淋巴細(xì)胞發(fā)揮抗腫瘤作用；M2型巨噬細(xì)胞通過抑制淋巴細(xì)胞功能、誘導(dǎo)新血管生成，發(fā)揮促癌作用。IFN-γ和脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）促進(jìn)單核細(xì)胞向M1型巨噬細(xì)胞極化；HCC產(chǎn)生的細(xì)胞因子IL-4、IL-13、克隆刺激因子（colony stimulating factor,CSF-1）、CCL2、CXCL12和結(jié)締組織生長因子（connective tissue growth factor,CTGF）促進(jìn)單核細(xì)胞向M2型分化。在炎性反應(yīng)性TME中，M2-TAMs促進(jìn)HCC發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移[14,20]。HCC產(chǎn)生的骨橋蛋白促進(jìn)TAMs趨化活性；HCC產(chǎn)生的缺氧誘導(dǎo)因子1α（hypoxiainducible factor 1α,HIF-1α）促進(jìn)TAMs釋放IL-1β，IL-1β反向誘導(dǎo)HCC發(fā)生EMT。CD68+巨噬細(xì)胞在腫瘤組織中的數(shù)量顯著高于癌旁肝組織，而且TAMs多數(shù)為IL-10陽性，IL-10促進(jìn)腫瘤組織中CD4+CD25+Foxp3+Treg的數(shù)量，后者抑制CD8+T細(xì)胞和NK細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的毒性。IL-6主要由巨噬細(xì)胞等細(xì)胞產(chǎn)生，促使巨噬細(xì)胞向M2型轉(zhuǎn)換，變成TAMs，通過活化STAT3信號通路促進(jìn)HCC發(fā)生。TAM增加Th17數(shù)量，后者抑制免疫檢查點(diǎn)治療產(chǎn)生的抗腫瘤免疫。

中性粒細(xì)胞大體上可分為N1型和N2型。促進(jìn)炎性反應(yīng)的N1型具有抗腫瘤作用，抵抗炎性反應(yīng)的N2型具有促腫瘤作用。這種差異性取決于中性粒細(xì)胞的極化方式：LPS、IFN-γ和Ⅰ類IFNs促進(jìn)向N1方向分化，IL-4促進(jìn)向N2方向分化。TANs在HCC生長中也起關(guān)鍵作用。缺氧誘導(dǎo)HIF-1α表達(dá)異常活躍，導(dǎo)致HIF-1α依賴性趨化因子上調(diào)，促進(jìn)TANs在腫瘤組織中的浸潤。TANs浸潤和中性粒/淋巴細(xì)胞百分比代表了全身性“陰性”炎性反應(yīng)，促進(jìn)腫瘤進(jìn)展及HCC不良預(yù)后[20]。N2-TANs對抗腫瘤免疫的特別抑制作用主要是通過抑制CD8+T細(xì)胞功能并誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞凋亡。

MDSCs是分布于TME中不成熟的骨髓細(xì)胞，表現(xiàn)出強(qiáng)烈的免疫抑制特性。MDSCs主要通過精氨酸酶、可誘導(dǎo)性一氧化氮合成酶（inducible nitric oxide synthase,iNOS）、致免疫耐受性的酶如IDO1、活性氧簇（reactive oxygen species,ROS）、TGF-β和IL-10抑制CTLs和NK活性。M D S C 主要有兩個亞群：單核細(xì)胞的MDSC（M-MDSC）和多形核的MDSC（PMNMDSC）。在TME中，M-MDSC比PMN-MDSC具有更高的免疫抑制活性。一些來自癌細(xì)胞的細(xì)胞因子G-CSF、GM-CSF、VEGF、MCP-1和IL-1促進(jìn)MDSCs在HCC組織中浸潤。局部慢性缺氧可以通過趨化因子CCL26/CX3CR1通路誘導(dǎo)MDSCs集聚于HCC組織中，損傷CD8+效應(yīng)T細(xì)胞的功能，降低NK細(xì)胞毒性和細(xì)胞因子分泌，誘導(dǎo)Treg，顯著抑制免疫并對HCC進(jìn)展起關(guān)鍵促進(jìn)作用。外周血中MDSCs預(yù)示HCC的預(yù)后不良[14]。在HCC細(xì)胞轉(zhuǎn)移定殖到目標(biāo)組織前，腫瘤細(xì)胞還分泌某些可溶性因子包括CXCL17、G-CSF、骨橋蛋白、CXCL12、TNF-α、TGF-β、VEGF-A和PIGF。這些因子通過影響CD11b+/Gr-1+MDSC介導(dǎo)的新血管生成、誘導(dǎo)炎性反應(yīng)、重塑ECM以及募集免疫細(xì)胞，營造免疫抑制但營養(yǎng)豐富的TME。這些抑制性免疫細(xì)胞密度高，促進(jìn)HCC復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，與HCC不良預(yù)后有關(guān)，符合“冷腫瘤”特點(diǎn)，免疫治療難以奏效。

2.3 TME中抗腫瘤免疫細(xì)胞的種類和作用機(jī)制

腫瘤相關(guān)免疫細(xì)胞的功能取決于免疫誘導(dǎo)的方向。CD4+T輔助細(xì)胞（Th）的分化取決于炎性反應(yīng)細(xì)胞因子的誘導(dǎo)，既可以分化成Th1，促進(jìn)CD8+T細(xì)胞形成和成熟，參與抗病毒、抗腫瘤免疫；也可以分化成Treg和Th17，具有免疫抑制作用，促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移。這種差異取決于Th1細(xì)胞因子（IL-12、IL-2、IFN-γ）和Th2細(xì)胞因子（IL-4、IL-10、IL-13、TGFβ、IL-17）的平衡。Th1細(xì)胞因子促進(jìn)Th0向Th1分化；Th2細(xì)胞因子促進(jìn)Th0向Th2、Treg和Th17分化。Treg雖然在免疫穩(wěn)態(tài)中起關(guān)鍵作用，但是在腫瘤免疫中主要起抑制作用。

HCC組織中的樹突細(xì)胞（dendritic cells,DCs）是主要的腫瘤抗原提呈細(xì)胞，主要分DCc1-CD1C、DC-c3-CLEC9A和DC-c4-LAMP3三類，DC-c1-CD1C高表達(dá)CD1C、FCER1A和CLEC10A，相當(dāng)于常規(guī)DC2（cDC2）；DC-c3-CLEC9A高表達(dá)CLEC9A、XCR1和CADM1相當(dāng)于常規(guī)DC1（cDC1）；DC-c4-LAMP3表達(dá)成熟標(biāo)志物L(fēng)AMP3、CD80和CD83、遷移標(biāo)志物CCR7和淋巴細(xì)胞再循環(huán)趨化因子CCL19和CCL21。血中幼稚型cDC1、cDC2和類漿細(xì)胞DCs（pDCs）并不表達(dá)LAMP3，但是體外經(jīng)過LPS聯(lián)合IFN-γ或poly I:C刺激后成熟，表達(dá)LAMP3。LAMP3+DCs在腫瘤組織中表達(dá)高于癌旁肝組織，具有高度吞噬活性，在腫瘤引流淋巴結(jié)中通過受體和配體結(jié)合方式刺激CD8+T、CD4+T細(xì)胞和NK細(xì)胞的免疫反應(yīng)[23]。CD8+T細(xì)胞和NK細(xì)胞具有直接細(xì)胞毒活性和明確的抗腫瘤作用，在TME中密度高則與HCC預(yù)后良好密切相關(guān)。CD8+T細(xì)胞和NK細(xì)胞在腫瘤組織中的存在代表了“熱腫瘤”特征，免疫治療會有抗癌效果。

3 TME免疫細(xì)胞的代謝重編程對HCC轉(zhuǎn)移的潛在作用

3.1 TME中缺氧通過代謝重編程影響免疫平衡

線粒體功能是CD8+T細(xì)胞擴(kuò)增、產(chǎn)生細(xì)胞因子和有效免疫記憶不可或缺的。NKT細(xì)胞發(fā)揮功能嚴(yán)重依賴線粒體的氧化磷酸化。因此，抗腫瘤免疫需要在有氧環(huán)境中發(fā)揮作用。相反，在HCC這種高糖酵解的腫瘤中，Treg通過單羧酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)因子1積極利用糖酵解產(chǎn)生的乳酸，促進(jìn)活化T細(xì)胞核因子1轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，增強(qiáng)Treg的PD-1表達(dá)，進(jìn)一步加強(qiáng)免疫抑制[24-25]。腫瘤迅速生長與氧供應(yīng)渠道缺乏導(dǎo)致缺氧在TME普遍存在。缺氧導(dǎo)致乳酸增加造成的酸性環(huán)境促進(jìn)Treg富集、分化和發(fā)揮功能，起到免疫抑制作用。TME富含乳酸，而且乳酸可提升腫瘤浸潤性Treg的復(fù)制能力和免疫抑制功能，導(dǎo)致免疫抑制；葡萄糖對TME中Treg的功能和擴(kuò)增的作用與乳酸相反[26]。因此，調(diào)節(jié)TME中Treg能量代謝有助于了解能量代謝在HCC轉(zhuǎn)移中的作用，有利于發(fā)現(xiàn)控制HCC轉(zhuǎn)移的新途徑。

3.2 TME中缺氧通過ECM重編程對HCC進(jìn)展的影響

缺氧環(huán)境可降低甲基胞嘧啶過氧化酶的活性，導(dǎo)致某些超甲基化的產(chǎn)生；慢性缺氧可導(dǎo)致HIF-1α表達(dá)，促進(jìn)TME新血管生成，缺氧還可以通過上調(diào)EMT主要調(diào)控分子ZEB1以誘導(dǎo)組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶SETD1B表達(dá)，后者又以正反饋方式維持ZEB1表達(dá)，促進(jìn)HCC細(xì)胞進(jìn)入侵襲性EMT狀態(tài)；TME中缺氧和基質(zhì)細(xì)胞炎性反應(yīng)因子還可以通過上調(diào)EMT核心調(diào)控分子SNAIL1表達(dá)，引起染色質(zhì)重塑，誘導(dǎo)EMT、提升HCC細(xì)胞的侵襲能力[14]。缺氧能誘導(dǎo)一些分子表達(dá)，如賴氨酰氧化酶（lysyl oxidase,LOX），能促進(jìn)膠原蛋白和彈性蛋白的共價交聯(lián)和纖連蛋白（fibronectin,FN1）的表達(dá)，促進(jìn)HCC復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，預(yù)測不良預(yù)后[27]。FN1不但在ECM和血清中高表達(dá)促進(jìn)HCC轉(zhuǎn)移，也可以在有血管侵襲的Ⅵ期轉(zhuǎn)移性或晚期HCC細(xì)胞中高表達(dá)。其表達(dá)水平不但可以診斷HCC，且具有良好的敏感度和特異性（在cut off值為100 μg/ml時，F(xiàn)N1診斷HCC的敏感度達(dá)92%，特異性達(dá)88%），還可以準(zhǔn)確預(yù)測HCC不良預(yù)后。不過FN1和HCC轉(zhuǎn)移的相關(guān)性與HCC病因無關(guān)[28]。適度的持續(xù)性缺氧對HCC的進(jìn)化發(fā)育有一定促進(jìn)作用。

3.3 犬尿氨酸代謝通路對TME免疫抑制的影響

色氨酸是人體只能從食物中獲取的8種必需氨基酸之一，在細(xì)胞生長和功能維持中起重要作用。90%的色氨酸是通過犬尿氨酸通路（kynurenine pathway,KP）代謝，生成調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝過程的關(guān)鍵輔酶：尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）。在正常條件下，KP受到嚴(yán)格調(diào)控，但在炎性反應(yīng)TME中，KP通路高度激活，迅速降解色氨酸。色氨酸是Th和CD8+CTL生存和擴(kuò)增的必需氨基酸。色氨酸缺乏導(dǎo)致CTL擴(kuò)增受阻，免疫前體細(xì)胞向Treg方向分化，導(dǎo)致TME免疫抑制。KP通路始于3個限速酶：IDO1、IDO2和色氨酸2,3-二氧酶（tryptophan 2,3-dioxygenase,TDO2），能催化色氨酸轉(zhuǎn)化為犬尿氨酸，后者在犬尿氨酸3加單氧酶（kynurenine 3-monooxygenase,KMO）等一系列酶作用下最終生成NAD+。在生理?xiàng)l件下，IDO1的表達(dá)局限于肺和胎盤的內(nèi)皮細(xì)胞；IDO2主要在肝細(xì)胞、膽管細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞和腎臟中表達(dá)；TDO2主要在肝臟中表達(dá)。犬尿氨酸是KP通路的第一個代謝物，作為內(nèi)源性配體，以自分泌和旁分泌形式激活芳香烴受體（aryl hydrocarbon receptor,AhR）。AhR是配體激活的PAS家族基礎(chǔ)螺旋-環(huán)-螺旋的轉(zhuǎn)錄因子，在多種免疫細(xì)胞中表達(dá)，發(fā)揮重要免疫調(diào)節(jié)作用。在惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，炎性反應(yīng)因子如IL-6可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞表達(dá)IDO1，IDO1可通過激活炎性反應(yīng)因子正反饋環(huán)“IDO-AhR-IL-6-STAT3”信號通路促進(jìn)腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。在IDO1/IDO2高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞中，TME中的色氨酸被剝奪，免疫監(jiān)督功能被強(qiáng)烈抑制。IDO2在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、乳腺癌、結(jié)直腸癌和肝癌中表達(dá)，顯著促進(jìn)免疫逃逸、促進(jìn)癌細(xì)胞擴(kuò)增和轉(zhuǎn)移。激活A(yù)hR促進(jìn)癌細(xì)胞擴(kuò)增、組織浸潤和轉(zhuǎn)移。犬尿氨酸-AhR信號通路抑制免疫細(xì)胞的分化和活性，促進(jìn)腫瘤免疫耐受。色氨酸的二級代謝物犬尿喹啉酸也可以作為AHR內(nèi)源性配體，在IL-1β存在的情況下誘導(dǎo)IL-6的產(chǎn)生，促進(jìn)炎性反應(yīng)正反饋環(huán)的形成。KP通路的代謝產(chǎn)物包括犬尿氨酸本身均可抑制T細(xì)胞擴(kuò)增和活化，擾亂Th和Treg之間的平衡，使其向Treg方向發(fā)展，導(dǎo)致CTL耗竭，促進(jìn)腫瘤免疫逃逸。TME中某些“毒性”代謝產(chǎn)物，包括乳酸、犬尿氨酸和腺苷等在塑造免疫抑制特性和腫瘤免疫逃逸方面起重要作用。但是，KP通路在HCC研究中有相互矛盾之處：IDO1只在IFNγ刺激的HCC中高表達(dá)，HCC中IDO1高表達(dá)與CD8+T細(xì)胞密度呈正相關(guān)；而TDO2在HCC中高表達(dá)與HCC生長、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[29]。AhR的高表達(dá)與HCC擴(kuò)增和侵襲有關(guān)，促進(jìn)EMT進(jìn)程，參與HCC的進(jìn)化發(fā)育。

4 HBV在致癌過程中與免疫抑制性TME的關(guān)系

前文提到，與HCV慢性感染等其他原因相關(guān)的HCC相比，HBV-HCC早發(fā)病10～12年，而且預(yù)后更差[3]，說明HBV除了導(dǎo)致炎性反應(yīng)之外，還有直接促HCC作用。HBV致癌主要依賴HBV進(jìn)化、整合和復(fù)制（包括cccDNA載量）。我們研究發(fā)現(xiàn)HBV變異是在炎性反應(yīng)基礎(chǔ)上，IL-6反式激活促變異分子APOBEC3B的表達(dá)、抑制變異修復(fù)分子UNG的表達(dá)，使APOBEC3B-UNG之間的平衡向促突變方向傾斜，導(dǎo)致HBV變異和體細(xì)胞變異增加[30]。APOBEC3B-UNG之間的平衡在膽囊癌、膽管癌和腎細(xì)胞癌進(jìn)化發(fā)育中均起重要作用，但是組織特異性反式因子和炎性反應(yīng)因子在調(diào)控該平衡中起重要調(diào)控作用[31-32]。HBV變異在癌組織、癌旁肝組織和外周血中進(jìn)化不同步，在癌組織中因?yàn)槊庖吖δ茏钊?，進(jìn)化最慢，在外周血中進(jìn)化最強(qiáng)，免疫選擇的變異傾向于促進(jìn)癌癥發(fā)生。HBV進(jìn)化不但在促進(jìn)HCC中發(fā)揮重要作用，也顯著促進(jìn)HCC的不良預(yù)后[6,33]。變異型HBV致癌能力增強(qiáng)，主要是通過增強(qiáng)促癌炎性反應(yīng)所致，IL-5和IL-6在變異型HBx基因轉(zhuǎn)入“睡美人轉(zhuǎn)座子”動物模型中表達(dá)水平顯著高于野生型；而且HBx基因變異型主要通過激活血漿酶原激活物抑制因子1（plasminogen activator inhibitor-1，PAI1）和細(xì)胞分裂周期20（CDC20）促進(jìn)HCC發(fā)生和進(jìn)展[34]。PAI1，又稱SERPINE1，能誘導(dǎo)腫瘤新血管生成，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移，是多種惡性腫瘤重要治療靶標(biāo)。PAI1在腫瘤組織中高表達(dá)是HCC惡性程度和不良預(yù)后的主要標(biāo)志。CAFs誘導(dǎo)M2-TAMs并促進(jìn)HCC的作用是通過PAI1促進(jìn)HCC的EMT而實(shí)現(xiàn)[35]。我們還發(fā)現(xiàn)，HBV前S區(qū)變異通過激活STAT3/IL-6傳統(tǒng)炎性反應(yīng)通路，促進(jìn)HCC發(fā)生和轉(zhuǎn)移。因此，HBV進(jìn)化可通過PAI1和STAT3/IL-6等，以“正反饋”方式放大炎性反應(yīng)促癌的效能，以改造HCC的TME，促進(jìn)HCC的進(jìn)化發(fā)育。HBV整合是隨機(jī)的，但是整合到能促進(jìn)HCC發(fā)生發(fā)展的位點(diǎn)才有機(jī)會在HCC中被發(fā)現(xiàn)。HBV整合促進(jìn)HCC的位點(diǎn)主要是滅活TP53基因、激活TERT啟動子、激活MLL4甲基化轉(zhuǎn)移酶，促進(jìn)HCC進(jìn)化發(fā)育。

5 癌癥進(jìn)化發(fā)育學(xué)在PLC特異性預(yù)防和靶向聯(lián)合免疫治療中的應(yīng)用

HBV致癌的研究揭示了“癌癥進(jìn)化發(fā)育學(xué)”基本規(guī)律：HLA-II類抗原遺傳多態(tài)性決定了CD4+T細(xì)胞免疫走向，促進(jìn)了HBV慢性炎性反應(yīng)化，“非可控性炎性反應(yīng)”因子如IL-6反式作用導(dǎo)致促進(jìn)變異的APOBEC3s與變異修復(fù)的UNG之間平衡的失調(diào)，使平衡向APOBEC3s方向傾斜；AID/APOBEC3s胞苷脫氨酶家族，尤其是APOBEC3B促進(jìn)體細(xì)胞和病毒變異；由于遺傳和環(huán)境因素導(dǎo)致CD8+T細(xì)胞清除HBV能力較弱，選擇了促癌HBV變異。攜帶關(guān)鍵體細(xì)胞變異的肝細(xì)胞經(jīng)過“炎性反應(yīng)-壞死-增生”在受損肝臟中積累突變、促進(jìn)染色體重塑和表觀遺傳改變、轉(zhuǎn)化為初始HCC細(xì)胞。非可控性炎性反應(yīng)參與決定了HBV變異的免疫選擇方向；作為HBV復(fù)制模板，HBV cccDNA應(yīng)攜帶HBV變異，后者在細(xì)胞質(zhì)中形成dsDNA或與人基因組DNA片段組成環(huán)ecDNA，在肝細(xì)胞中激活cGAS-STING信號，誘導(dǎo)Ⅰ型IFN抗病毒作用；在癌變后，dsDNA促進(jìn)慢性cGAS-STING下游非經(jīng)典NF-κB激活，產(chǎn)生TGF-β1、PAI1、Th2等細(xì)胞因子，召集和武裝MDSC、TAM、Treg和中性粒細(xì)胞等免疫抑制性炎性反應(yīng)細(xì)胞，形成促進(jìn)HCC進(jìn)化發(fā)育的TME；而這些抑制性免疫細(xì)胞通過分泌IL-10、TGF-β1和產(chǎn)生ROS等抑制CD8+T細(xì)胞、NK細(xì)胞和DC等抗病毒、抗腫瘤免疫活性，還通過分泌IL-1β和IL-6等促進(jìn)肝癌細(xì)胞逆向分化；與相應(yīng)野生型HBV相比，促癌HBV變異在體內(nèi)能誘導(dǎo)更加嚴(yán)重的促癌炎性反應(yīng)，放大了“炎-癌”轉(zhuǎn)化效應(yīng)。HBV-HCC進(jìn)展離不開病毒整合變異，兩者協(xié)同促進(jìn)變異細(xì)胞逆向發(fā)育。HCC起始細(xì)胞在炎性反應(yīng)TME中獲得生長優(yōu)勢，造成缺氧，誘導(dǎo)HIF-1α和VEGF等表達(dá)，促進(jìn)新血管生成。同時癌細(xì)胞改變了自身代謝模式，以糖酵解方式為主要供能模式的同時，產(chǎn)生戊糖直接用于核酸合成；缺氧和乳酸堆積促進(jìn)Treg擴(kuò)增、抑制NK和CTL，營造免疫抑制TME。這些抑制性免疫細(xì)胞進(jìn)一步促進(jìn)早期HCC發(fā)生EMT并向干細(xì)胞方向進(jìn)化，促進(jìn)轉(zhuǎn)移和術(shù)后復(fù)發(fā)[19]。雖然我們是基于HBV致癌研究提出了“癌癥進(jìn)化發(fā)育學(xué)”基本理論框架，但該理論中的主要步驟如APOBEC3B-UNG平衡、免疫平衡等在幾乎所有腫瘤類型中均存在，反映了癌癥發(fā)生和轉(zhuǎn)移的基本規(guī)律[36]。

6 免疫抑制性TME與HCC免疫檢查點(diǎn)治療和靶向治療的相互作用

6.1 免疫抑制性TME對HCC免疫檢查點(diǎn)治療和靶向治療的影響

HCC的TME基本是免疫抑制性的，主要包括負(fù)向免疫調(diào)控的Treg、抑制性B細(xì)胞、MDSCs、M2-TAMs等免疫抑制細(xì)胞，共刺激淋巴細(xì)胞信號包括免疫檢查點(diǎn)配體和受體，IDO或精氨酸酶等致耐受性的酶類[14,37]。這些免疫抑制因素與促進(jìn)腫瘤免疫的CTL、NK細(xì)胞和DCs之間的平衡決定了腫瘤免疫治療的效果，誘導(dǎo)有效抗腫瘤免疫必須突破免疫抑制屏障。免疫檢測點(diǎn)包括表達(dá)在效應(yīng)淋巴細(xì)胞上的共抑制分子，包括CTLA4、PD-1、TIM3和LAG3等[38]。CTLA4（又稱CD152）表達(dá)在激活T細(xì)胞，尤其是Treg表面，和CD28共享配體，其激活預(yù)防自身免疫。PD-1（又稱CD279）表達(dá)在激活的受損T細(xì)胞的細(xì)胞膜，與表達(dá)在基質(zhì)細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞和某些髓樣細(xì)胞表面的配體PD-L1特異性結(jié)合，特異性抑制效應(yīng)T細(xì)胞功能，導(dǎo)致效應(yīng)T細(xì)胞耗竭或失能。免疫檢查點(diǎn)抑制劑（immune checkpoint inhibitors,ICIs）是能夠阻斷這些受體與其配體結(jié)合的單克隆抗體，阻止T細(xì)胞失活。

目前免疫檢測點(diǎn)阻斷治療在晚期HCC治療中有一定的客觀療效。單獨(dú)使用對晚期HCC有7%～20%的總有效率，中位生存時間12.9～15.1月[14]。HCC免疫抑制性TME和抗原識別受損的腫瘤-免疫相互作用可促進(jìn)腫瘤免疫逃逸。在TME中，Treg和CTL之間的平衡以及Treg和NK細(xì)胞之間的平衡是腫瘤進(jìn)展和腫瘤免疫的關(guān)鍵。T細(xì)胞的數(shù)量和活化狀態(tài)無疑對腫瘤進(jìn)展和ICIs的療效有重要影響。β-catenin變異的HCC往往淋巴細(xì)胞浸潤較少，ICIs治療難以奏效。腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的某些分子如TGF-β1、IL-10、IDO、AFP等通過刺激MDSCs和Treg細(xì)胞，促進(jìn)TME的免疫抑制功能，顯著限制了ICIs的療效。M2-TAM直接或間接通過抑制細(xì)胞毒性免疫細(xì)胞如CD8+T細(xì)胞和NK細(xì)胞，促進(jìn)HCC進(jìn)展，顯著限制了免疫治療的療效。對抗HCC中TGF-β1、IDO或VEGF的免疫抑制活性有助于提高ICIs療效。

6.2 靶向治療對TME免疫抑制性的影響

靶向治療一線藥物是在Sorafenib的基礎(chǔ)上，應(yīng)用一種靶向血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體VEGFR1-3、纖維母細(xì)胞生長因子受體FGFR1-4以及PDGFR2的小分子多激酶抑制劑Lenvatinib，可以使晚期HCC的中位生存時間達(dá)到13.6個月。動物模型研究發(fā)現(xiàn)，Lenvatinib單藥治療可顯著提升NK細(xì)胞比例，降低CD4+T細(xì)胞比例；Lenvatinib和EGFR抑制劑Gefitinb聯(lián)合使用可顯著增加NK細(xì)胞和CD8+T進(jìn)入腫瘤體內(nèi)的數(shù)量，降低TAMs的比例[39]。可見靶向治療可增強(qiáng)免疫治療效果，兩種治療策略有一定的互補(bǔ)作用。目前最有效的HCC治療方式是免疫與靶向聯(lián)合治療，如晚期HCC最有效的一線治療是應(yīng)用單抗atezolizumab阻斷PD-1聯(lián)合單抗bevacizumab阻斷VEGF，整體有效率可達(dá)36%，中位生存時間達(dá)17個月[14]。雖然靶向和免疫治療在晚期HCC中取得了令人矚目的療效，但是大部分患者并沒有生存獲益，而且生存獲益患者也存在快速復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移問題。因此，需要進(jìn)一步闡明TME中免疫微環(huán)境對HCC轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的作用機(jī)制，豐富和發(fā)展“癌癥進(jìn)化發(fā)育學(xué)”理論體系，從而使HCC這種惡性程度很高的腫瘤得以變成可控制的慢性病，達(dá)到大幅度降低HCC非成熟死亡率。

綜上，我們基于HBV致癌研究提出的“癌癥進(jìn)化發(fā)育學(xué)”理論體系，不但揭示了炎性反應(yīng)或病毒致癌的部分重要機(jī)制，為晚期肝癌的靶向和免疫治療奠定了理論基礎(chǔ)、提供了技術(shù)方法，同時有希望為其他惡性腫瘤的防治提供參考。