張國(guó)明 丁立成 孫廣峰 留志賢 王斌 孫媛媛

（廈門大學(xué)附屬心血管病醫(yī)院 福建 廈門 361009）

隨著急診冠脈介入治療的發(fā)展，缺血再灌注損傷已經(jīng)成為急性心肌梗死治療最后的堡壘，細(xì)胞凋亡是引起心肌組織缺血再灌注損傷的主要因素[1]，因此，抑制再灌注時(shí)細(xì)胞凋亡能夠有效防治心肌缺血再灌注損傷。多項(xiàng)研究已經(jīng)證實(shí)缺血后適應(yīng)可有效降低心肌細(xì)胞凋亡，但鑒于臨床使用的局限性，有很多學(xué)者提出了遠(yuǎn)隔器官適應(yīng)，即肢體遠(yuǎn)隔缺血適應(yīng)[2]，能夠有效減少實(shí)驗(yàn)大鼠心肌梗死面積，以減輕再灌注使對(duì)心肌組織的損害。但是目前臨床或動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中，尚無(wú)標(biāo)準(zhǔn)的遠(yuǎn)隔缺血時(shí)適應(yīng)方案，遠(yuǎn)隔缺血時(shí)適應(yīng)效果與心肌缺血發(fā)生后至適應(yīng)開始的時(shí)間、適應(yīng)處理過(guò)程中每次短暫缺血-灌注時(shí)間及其循環(huán)次數(shù)等因素密切相關(guān)[3]。鑒于損傷和治療中漸進(jìn)模式能減緩變化過(guò)程，從而給予此變化過(guò)程一個(gè)緩沖的理念，本研究提出了漸進(jìn)遠(yuǎn)隔時(shí)適應(yīng)的概念。本研究選取60 只實(shí)驗(yàn)大鼠開展分組研究，以探析遠(yuǎn)隔缺血時(shí)不同適應(yīng)漸進(jìn)模式對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷心肌的保護(hù)作用?，F(xiàn)報(bào)道如下：

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 60 只SD 雄性大鼠，體質(zhì)量200～250 g，自由飲食水，飼養(yǎng)室內(nèi)溫濕度適宜，12 h/12 h 明暗周期環(huán)境。TUNEL 細(xì)胞凋亡試劑盒（北京微旋基因技術(shù)有限公司）；線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔道（MPTP）檢測(cè)試劑盒（滬震生物）；VIS-721N 紫外可見(jiàn)光光度計(jì)（棱光）；單克隆抗體信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄活化因子（p-STAT3）、單克隆抗體JAK 激酶2（p-JAK2）、蛋白激酶B 單克隆抗體（p-AKT）、單克隆抗體信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2（p-ERK1/2）（艾美捷科技）。

1.2 試驗(yàn)分組 采用隨機(jī)數(shù)字表法，將60 只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、缺血/再灌注對(duì)照組、標(biāo)準(zhǔn)機(jī)械后適應(yīng)組、標(biāo)準(zhǔn)遠(yuǎn)隔時(shí)適應(yīng)組、正向漸進(jìn)模式遠(yuǎn)隔時(shí)適應(yīng)組、負(fù)向漸進(jìn)模式遠(yuǎn)隔時(shí)適應(yīng)組六組，每組10只。

1.3 心肌缺血-再灌注損傷模型建立 心肌缺血再灌注損傷大鼠模型：腹腔注射1%戊巴比妥鈉（70 mg/kg），頸部皮膚常規(guī)消毒，縱向切開暴露第2 和第3 個(gè)氣管環(huán)。行氣管切開術(shù)，氣管插管，連接呼吸機(jī)。機(jī)械通氣參數(shù)設(shè)置為，呼吸頻率65 次/min，潮氣量2.5 ml/100 g，呼吸比1:1。然后在大鼠右后肢和左前、后肢放置心電圖電極進(jìn)行心電圖監(jiān)測(cè)。同時(shí)充分暴露大鼠右側(cè)頸總動(dòng)脈，插入22G 套管針并連接動(dòng)脈壓儀，連續(xù)測(cè)量大鼠頸動(dòng)脈血壓。將大鼠左側(cè)胸壁消毒，從胸骨左緣沿胸骨方向切開皮膚至第5 肋間水平，鈍性分離并切至第4 肋間肌。撕開心包顯露心臟，5-0 縫線從左心耳中點(diǎn)下緣進(jìn)入左冠狀動(dòng)脈前降支左側(cè)，從右側(cè)出針，深度1 mm。然后在縫合線的兩端各穿一根1 cm 的縫合線，以防止縫合線脫落。在心肌表面與縫合線之間放置1 mm 棉包肝素鹽水，結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支。再向下推連接管，用棉絮壓左冠狀動(dòng)脈前降支，用血管鉗阻斷左冠狀動(dòng)脈前降支的血流，實(shí)現(xiàn)缺血。松開血管鉗可恢復(fù)冠狀動(dòng)脈左前降支再灌注。

1.4 干預(yù)方法

1.4.1 假手術(shù)組 假手術(shù)組大鼠建模，但常規(guī)開胸后分離左冠狀動(dòng)脈和左側(cè)股動(dòng)脈并穿線后不結(jié)扎，40 min 后關(guān)閉大鼠胸腔。

1.4.2 缺血/再灌注對(duì)照組 冠脈實(shí)施40 min 缺血后即完全松開阻塞球囊恢復(fù)完全再灌注，分離左側(cè)股動(dòng)脈并穿線后不結(jié)扎。

1.4.3 標(biāo)準(zhǔn)機(jī)械后適應(yīng)組 冠脈實(shí)施40 min 球囊阻塞缺血后，每隔30 s 松開阻塞球囊30 s，共3 次，至恢復(fù)完全再灌注；分離左側(cè)股動(dòng)脈并穿線后不結(jié)扎。

1.4.4 標(biāo)準(zhǔn)遠(yuǎn)隔時(shí)適應(yīng)組 冠脈實(shí)施40 min 球囊阻塞缺血后即完全松開阻塞球囊恢復(fù)完全再灌注，分離左側(cè)股動(dòng)脈并穿線，在冠脈結(jié)扎時(shí)結(jié)扎股動(dòng)脈5 min，而后再灌注5 min，反復(fù)進(jìn)行4 個(gè)循環(huán)。

1.4.5 正向漸進(jìn)模式遠(yuǎn)隔時(shí)適應(yīng)組 冠脈實(shí)施40 min 球囊阻塞缺血后即完全松開阻塞球囊恢復(fù)完全再灌注，分離左側(cè)股動(dòng)脈并穿線，在冠脈結(jié)扎時(shí)結(jié)扎股動(dòng)脈1 min，而后再灌注4 min。而后按照2/3 min、3/2 min、4/1 min、4/1 min、3/2 min、2/3 min、1/4 min反復(fù)進(jìn)行8 個(gè)循環(huán)。

1.4.6 負(fù)向漸進(jìn)模式遠(yuǎn)隔時(shí)適應(yīng)組 冠脈實(shí)施40 min 球囊阻塞缺血后即完全松開阻塞球囊恢復(fù)完全再灌注；分離左側(cè)股動(dòng)脈并穿線，在冠脈結(jié)扎時(shí)結(jié)扎股動(dòng)脈4 min，而后再灌注1 min。而后按照3/2 min、2/3 min、1/4 min、1/4 min、2/3 min、3/2 min、4/1 min反復(fù)進(jìn)行8 個(gè)循環(huán)。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 比較各組大鼠心肌梗死范圍 各組大鼠予以相應(yīng)干預(yù)后，在其左心室推注4 ml 伊文思藍(lán)以對(duì)心臟非缺血區(qū)（藍(lán)色）和缺血危險(xiǎn)區(qū)（無(wú)藍(lán)色）進(jìn)行鑒別。經(jīng)大鼠右頸總動(dòng)脈注射10%氯化鉀溶液2 ml 將大鼠處死，即刻取出心臟，沖洗干凈并剪除右心室、右心房，冰凍20 min，左心室從心尖到心底橫向切片。置于0.05%NET 磷酸鹽溶液中浸泡20 min，再用4%多聚甲醛固定。拍照計(jì)算梗死范圍，即梗死面積之和占總面積的比值。

1.5.2 比較各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率 采用TUNEL 法，用TUNEL 細(xì)胞凋亡試劑盒檢測(cè)各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡情況，嚴(yán)格根據(jù)說(shuō)明書進(jìn)行操作。凋亡率為每張切片中凋亡心肌細(xì)胞個(gè)數(shù)占所有心肌細(xì)胞個(gè)數(shù)的比值。

1.5.3 比較各組大鼠心肌組織MPTP 開放程度 先用差速離心法將心肌組織線粒體提取出來(lái)，再用紫外可見(jiàn)光光度計(jì)測(cè)量吸光度初值（△A1），予以MPTP 檢測(cè)試劑盒誘導(dǎo)MPTP 開放，再次測(cè)量吸光度值（△A2）。MPTP 開放程度由△A 表示，△A=△A1-△A2該值愈小，提示開放程度愈大[4]。

1.5.4 比較各組大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)p-STAT3、p-JAK2、p-AKT、p-ERK1/2 的蛋白表達(dá)水平 采用蛋白免疫印跡（Western blot）法測(cè)定。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0 軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以（±s）表示，兩組對(duì)比用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組比較采用單因素方差分析。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠心肌梗死范圍、 心肌細(xì)胞凋亡率及MPTP 開放程度比較 與缺血/再灌注對(duì)照組相比，標(biāo)準(zhǔn)機(jī)械后適應(yīng)組、標(biāo)準(zhǔn)遠(yuǎn)隔時(shí)適應(yīng)組、正向漸進(jìn)模式遠(yuǎn)隔時(shí)適應(yīng)組、負(fù)向漸進(jìn)模式遠(yuǎn)隔時(shí)適應(yīng)組的心肌梗死范圍、心肌細(xì)胞凋亡率更低，△A 值顯著升高；且正向漸進(jìn)模式遠(yuǎn)隔時(shí)適應(yīng)組心肌梗死范圍、心肌細(xì)胞凋亡率低于其他組，△A 值顯著高于其他組（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠心肌梗死范圍、心肌細(xì)胞凋亡率及MPTP 開放程度比較（±s）

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與缺血/再灌注對(duì)照組比較，#P＜0.05；與標(biāo)準(zhǔn)機(jī)械后適應(yīng)組比較，△P＜0.05；與標(biāo)準(zhǔn)遠(yuǎn)隔時(shí)適應(yīng)組比較，▲P＜0.05；與負(fù)向漸進(jìn)模式遠(yuǎn)隔時(shí)適應(yīng)組比較，▽P＜0.05。

組別 n 心肌梗死范圍（%） 心肌細(xì)胞凋亡率（%） △A假手術(shù)組缺血/再灌注對(duì)照組標(biāo)準(zhǔn)機(jī)械后適應(yīng)組標(biāo)準(zhǔn)遠(yuǎn)隔時(shí)適應(yīng)組正向漸進(jìn)模式遠(yuǎn)隔時(shí)適應(yīng)組負(fù)向漸進(jìn)模式遠(yuǎn)隔時(shí)適應(yīng)組10 10 10 10 10 10 FP 6.78±0.63 29.08±2.73*17.08±1.80*#17.20±1.64*#15.14±1.25*#△▲▽18.39±0.87*#190.280 0.000 5.84±0.71 26.19±3.23*17.04±2.04*#16.65±2.32*#13.06±0.94*#△▲▽16.63±2.01*#102.631 0.000 0.37±0.02 0.13±0.02*0.21±0.03*#0.26±0.02*#△0.30±0.02*#△▲▽0.26±0.03*#△127.384 0.000

2.2 各組大鼠心肌組織p-STAT3、p-JAK2、p-AKT、 p-ERK1/2 蛋白表達(dá)水平比較 蛋白印跡檢測(cè)結(jié)果顯示，正向漸進(jìn)模式遠(yuǎn)隔時(shí)適應(yīng)組的p-STAT3、p-JAK2、p-AKT、p-ERK1/2 表達(dá)水平較假手術(shù)組外的其他組顯著提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠心肌組織p-STAT3、p-JAK2、p-AKT、p-ERK1/2 蛋白表達(dá)水平比較（±s）

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與缺血/再灌注對(duì)照組比較，#P＜0.05；與標(biāo)準(zhǔn)機(jī)械后適應(yīng)組比較，△P＜0.05；與標(biāo)準(zhǔn)遠(yuǎn)隔時(shí)適應(yīng)組比較，▲P＜0.05；與負(fù)向漸進(jìn)模式遠(yuǎn)隔時(shí)適應(yīng)組比較，▽P＜0.05。

組別 n p-STAT3 p-JAK2 p-AKT p-ERK1/2假手術(shù)組缺血/再灌注對(duì)照組標(biāo)準(zhǔn)機(jī)械后適應(yīng)組標(biāo)準(zhǔn)遠(yuǎn)隔時(shí)適應(yīng)組正向漸進(jìn)模式遠(yuǎn)隔時(shí)適應(yīng)組負(fù)向漸進(jìn)模式遠(yuǎn)隔時(shí)適應(yīng)組10 10 10 10 10 10 FP 1.22±0.09 0.29±0.04*0.61±0.07*#0.63±0.10*#0.82±0.07*#△▲▽0.63±0.06*#173.713 0.000 1.07±0.10 0.23±0.03*0.41±0.07*#0.38±0.06*#0.47±7805*#△▲▽0.41±0.05*#215.768 0.000 0.44±0.02 1.41±0.06*1.90±0.13*#1.86±0.09*#2.03±0.08*#△▲▽1.89±0.08*#508.525 0.000 0.64±0.08 1.79±0.12*2.29±0.12*#2.32±0.13*#2.48±0.11*#△▲▽2.34±0.14*#350.308 0.000

3 討論

急性心肌梗死后的缺血再灌注損傷是困擾臨床工作的重要難題之一，其機(jī)制主要是再灌注后心肌組織內(nèi)釋放大量氧自由基、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，致使心肌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)受到破壞，心肌組織受損[5]。2003 年Zhao 等[6]學(xué)者提出缺血后處理概念，即在冠脈再灌注治療開始時(shí)實(shí)施短暫性的、反復(fù)開通以及再關(guān)閉，逐漸恢復(fù)冠脈血流，這對(duì)于改善心肌組織再灌注損傷有顯著的效果。但缺血后適應(yīng)在臨床應(yīng)用過(guò)程中窗口期較短，且冠脈局部處理在手術(shù)過(guò)程中存在一定風(fēng)險(xiǎn)，因此有學(xué)者提出了在其他部位進(jìn)行后處理的方法，即遠(yuǎn)隔適應(yīng)。

有研究[7]發(fā)現(xiàn)，遠(yuǎn)隔缺血時(shí)適應(yīng)與遠(yuǎn)隔缺血后處理對(duì)心肌缺血再灌注損傷的心肌保護(hù)作用相似。遠(yuǎn)隔缺血時(shí)適應(yīng)主要是在心肌組織發(fā)生缺血后，且在心肌再灌注治療前實(shí)施干預(yù)措施，給臨床治療提供了足夠的操作時(shí)間，且具有良好的安全性。最新臨床薈萃分析[8]顯示，遠(yuǎn)隔缺血時(shí)適應(yīng)能夠降低急性心肌梗死病人心肌標(biāo)記物水平，從而改善預(yù)后。也有學(xué)者[9]發(fā)現(xiàn)，在遠(yuǎn)隔缺血時(shí)適應(yīng)處理過(guò)程中短暫性灌注、短暫性缺血的時(shí)間關(guān)系是可相互影響的。鑒于所有的病理?yè)p傷和治療過(guò)程如果給予漸進(jìn)處理，都會(huì)為變化過(guò)程帶來(lái)緩沖，從而可以減弱不良反應(yīng)的理念，本研究對(duì)不同遠(yuǎn)隔缺血時(shí)適應(yīng)漸進(jìn)模式進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，正向漸進(jìn)模式遠(yuǎn)隔時(shí)適應(yīng)組的心肌梗死范圍、心肌細(xì)胞凋亡率顯著低于假手術(shù)組外的其他組，因?yàn)檎驖u進(jìn)模式在缺血和再灌注兩個(gè)階段都提供了正向的漸進(jìn)過(guò)程，從宏觀上講更符合漸進(jìn)適應(yīng)的過(guò)程。

在具體機(jī)制方面，再灌注損傷補(bǔ)救激酶（RISK）、生存活化因子增強(qiáng)（SAFE）途徑和線粒體途徑是心肌缺血-再灌注損傷發(fā)生的主要信號(hào)通路[10～11]。其中，RISK 信號(hào)通路磷脂酰肌醇3 激酶/ 蛋白激酶B（PI3K/AKT）、信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2（ERK1/2）主要通過(guò)激活下游效應(yīng)器，以降低再灌注損傷引起細(xì)胞凋亡發(fā)生。SAFE 信號(hào)通路在心肌缺血再灌注損傷中也發(fā)揮著保護(hù)作用，主要通過(guò)介導(dǎo)JAK2/STAT3信號(hào)從細(xì)胞膜往細(xì)胞核中轉(zhuǎn)導(dǎo)，以調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)，減少炎癥介質(zhì)釋放[12]。本研究中，正向漸進(jìn)模式遠(yuǎn)隔時(shí)適應(yīng)組的p-STAT3、p-JAK2、p-AKT、p-ERK1/2 表達(dá)較假手術(shù)組外的其他組顯著提高，提示正向漸進(jìn)模式能夠通過(guò)RISK、SAFE 通路調(diào)節(jié)炎癥介質(zhì)釋放，從而使正向漸進(jìn)模式組的MPTP 開放程度低于其他組，從而減輕了心肌缺血再灌注。

綜上所述，正向漸進(jìn)遠(yuǎn)隔時(shí)適應(yīng)模式可以發(fā)揮較傳統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)模式更好的心肌保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與激活RISK 和SAFE 途徑，抑制MPTP 開放有關(guān)。