【作 者】 婁海芳，章鴻濤，喻梓瑄，王巨鋒，劉偉

1 浙江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院（浙江省中醫(yī)院），杭州市，310006

2 中翰盛泰生物技術(shù)股份有限公司，杭州市，311188

0 引言

隨著后基因組時代的到來，人類對生命現(xiàn)象的認識進入全新的發(fā)展階段，對疾病的檢測也不再僅僅依賴于單一指標進行診斷，而是將人體作為一個完整的系統(tǒng)，利用多種指標的組合對疾病的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后進行更加精準的檢測、判斷以及治療指導[1]。因此，多指標同時檢測的方法，特別是面向免疫分析、核酸檢測、酶學分析、受體和配體識別分析的高通量、高速度以及多功能的平臺技術(shù)對臨床檢測越來越重要[2]。

在這種情況下，懸浮芯片應(yīng)運而生。懸浮芯片多指標檢測技術(shù)是集微球編碼技術(shù)、液流控制技術(shù)、激光技術(shù)、生物技術(shù)及數(shù)字信號處理技術(shù)為一體的新型生物分子檢測技術(shù)，也稱為液相芯片技術(shù)。相比固相生物芯片，懸浮芯片將平板載體替換為編碼微球，每個微球都攜帶一種可識別的編碼信息，以便鑒別固定在其表面的探針。一旦微球表面探針種類被識別，探針捕獲的靶分子就能夠被定性、定量分析[3-5]。

以微球為載體的最大優(yōu)勢源自微球可以在三維空間內(nèi)快速運動，微球上的生物配體與靶分子之間的雜交、結(jié)合近似于液相反應(yīng)機制，因此反應(yīng)動力學較固相芯片大為提高[6]。同時，懸浮芯片在熒光編碼方式、檢測目標分子種類等方面具有良好的靈活性，可根據(jù)具體需求更改表面固定有不同探針的編碼微球的種類，從而實現(xiàn)個性化檢測[7]。

盡管國內(nèi)目前在懸浮芯片領(lǐng)域已經(jīng)取得一定發(fā)展，但其多指標檢測試劑大都基于美國Luminex公司的編碼微球發(fā)展而來[8-9]。在懸浮芯片檢測解碼裝備方面，目前國內(nèi)尚未有完整的、專門針對懸浮芯片臨床使用的高通量懸浮芯片檢測儀器，而Luminex公司提供的設(shè)備，其光學系統(tǒng)的性能存在較大缺陷，主要表現(xiàn)為光學系統(tǒng)的抗震性、穩(wěn)定性較差，熒光收集靈敏度需要進一步提升。根據(jù)未來市場應(yīng)用需求，我們設(shè)計了一種應(yīng)用于高通量懸浮芯片檢測儀器的光學模塊，配合編碼微球可完成對懸浮芯片的自動解碼和分析，為懸浮芯片技術(shù)在臨床的應(yīng)用提供了完整的解決方案。

1 磁球編碼工作原理

為實現(xiàn)對編碼微球的解碼和對目標待測物濃度的探測，須明確編碼微球的編碼原理及編碼微球工作原理。一般地，編碼微球由粒徑為微米級的磁性納米微球內(nèi)部裝載2種熒光素組成，通過人為精準調(diào)控熒光素的裝載量，形成結(jié)構(gòu)、性狀完全一致，僅熒光強度存在差異的編碼磁球[10-11]。

圖1展示了二維熒光編碼的30種編碼微球。在1種編碼微球表面偶聯(lián)特定的生物探針，即可捕獲1種特定目標待測物。將標記有生物探針的多種編碼微球混合并分散于特定溶液，即形成懸浮芯片，可用于捕獲多種不同的目標分析物。多指標檢測原理如圖2所示。

圖1 編碼磁球陣列Fig.1 Coded magnetic ball array

圖2中的過程D展示了懸浮芯片的最終上樣檢測過程。完成目標待測物捕獲后的編碼微球懸液將在鞘流池內(nèi)被鞘液聚焦，以單個編碼微球的形式逐個通過激光激發(fā)區(qū)域，編碼微球上的熒光將被激發(fā)并為對應(yīng)的探測器所探測。

圖2 多指標檢測原理Fig.2 Multi-index detection principle

分析編碼微球工作原理可知，完成生物的每一個編碼微球都包含3種熒光素，其中兩種為編碼微球自身攜帶的用于識別編碼微球種類的FL1和FL2熒光素，另一種為前兩種通過捕獲目標待測物后結(jié)合的用于表征目標待測物濃度的FL3熒光素。

編碼微球解碼示意及E1門內(nèi)目標待測物熒光強度如圖3所示。

圖3 編碼微球解碼示意及E1門內(nèi)目標待測物熒光強度Fig.3 Coding decoding diagram and fluorescence intensity of tested target in gate E1

由圖3可知，不同種類的編碼微球解碼后呈現(xiàn)聚類效果，每一個群落為一種編碼微球，即一個特定的檢測指標。一般地，每次測試完成后，一個群落內(nèi)包含數(shù)百到上千個編碼微球。對每一個群落內(nèi)編碼微球的FL3熒光素進行單獨分析，即可得到不同目標待測物的熒光強度。圖3同時展示了群落在E1門內(nèi)目標待測物熒光強度分布直方圖。

2 光路設(shè)計

2.1 光學模塊設(shè)計要求

根據(jù)編碼微球工作原理確定儀器光路設(shè)計需求。懸浮芯片檢測儀器的光學模塊須配備光源和探測器，其中光源要能夠激發(fā)3種熒光素的熒光信號，其中兩種為編碼微球本身具備的用于識別編碼微球種類的編碼熒光素，另一種為前兩種生物反應(yīng)過程中結(jié)合的用于表征目標待測物濃度的熒光標記抗體。

在光學模塊中采用488 nm藍光和638 nm紅光激光器作為激發(fā)光源，所選擇的兩個激光器均具有良好的單色性和功率穩(wěn)定性。其中488 nm激光器用于激發(fā)FITC和QD605兩種編碼熒光素，分別對應(yīng)FL1和FL2，638 nm用于激發(fā)熒光二抗標記的熒光素APC，對應(yīng)FL3。

488 nm波長和638 nm波長激光從激光器出射后，分別經(jīng)透鏡組1和透鏡組2對光斑進行首次調(diào)整，紅光經(jīng)反射鏡反射穿過二向色分鏡傳輸至聚焦透鏡，藍光經(jīng)二向色分鏡反射傳輸至聚焦透鏡。兩束激光共同經(jīng)過聚焦透鏡的第二次聚焦，傳輸至鞘流池。通過對透鏡組1和透鏡組2的優(yōu)化設(shè)計，在鞘流池的中心的激發(fā)位置488 nm和638 nm具有完全一致的光斑尺寸。光學模塊的設(shè)計原理如圖4所示。

圖4 光學模塊設(shè)計原理Fig.4 Design principle of optical module

采用3個光電倍增管（photomultiplier tube,PMT）對3種不同的熒光信號強度進行探測。此外，光學模塊還配備了兩個散射光探測器，分別為前向散射光和側(cè)向散射光探測通道，由于散射光信號相對于熒光信號屬于強信號，采用硅光電二極管即可完成探測。對散射光進行分析可有效識別編碼微球是否發(fā)生粘連。

當單個編碼微球通過激發(fā)區(qū)域時，各個探測器捕獲的光信號經(jīng)光電轉(zhuǎn)換后均呈現(xiàn)為一個電脈沖信號。單個探測器內(nèi)脈沖信號的特征值包括信號高度、脈寬、面積等，對每個編碼微球的脈沖信號進行分析并提取信號特征值，即可實現(xiàn)編碼微球的解碼和目標待測物濃度檢測。

2.2 激光光斑空間分離設(shè)計

當紅、藍兩束激光的激發(fā)點處于同一位置時，會造成激發(fā)的熒光信號形成疊加，如熒光素APC既可被488 nm激發(fā)，也可被638 nm激發(fā)，此時光電倍增管3（對應(yīng)FL3）接收到的信號將是兩個熒光信號的疊加。這種熒光信號的疊加會導致目標待測物的濃度測值不準確。采用熒光補償?shù)姆绞讲⒉荒苡行@種串擾，因此，避免報告通道FL3熒光信號被串擾是極其必要的。

為避免熒光串擾現(xiàn)象，在空間上對紅、藍2個光斑進行分離。在豎直方向上，將紅、藍光斑中心分離數(shù)十微米，在鞘流池中心位置的光斑正視和側(cè)視如圖5所示。

圖5 激光光斑正視及側(cè)視Fig.5 Front and side view of laser spot

當編碼微球從下往上通過激光激發(fā)區(qū)域時將率先被紅光激發(fā)，APC熒光FL3單獨被638 nm激光激發(fā)并被探測器探測到，488 nm激光無法激發(fā)FL3熒光信號，因此不對信號產(chǎn)生干擾。

當編碼微球通過紅光激發(fā)區(qū)域后，進入藍光激發(fā)區(qū)域，488 nm信號將對編碼信號FL1和FL2同時進行激發(fā)。

2.3 高效非球面熒光收集透鏡與鞘流池一體化設(shè)計

當熒光信號被激發(fā)時，向空間的各個方向發(fā)散。為對熒光信號進行收集和探測，一般采用一個聚焦透鏡對一側(cè)的熒光進行收集。其熒光收集光路示意如圖6(a)所示。

由圖6(a)可知，鞘流池的中心為激光激發(fā)區(qū)域，當熒光被激發(fā)后，熒光向四周空間發(fā)射，部分光線從鞘流池中射出，部分光線從鞘流池光密介質(zhì)傳輸?shù)娇諝夤馐杞橘|(zhì)過程中發(fā)生全反射。

當透鏡對一側(cè)熒光進行收集時，理論上，最高的熒光收集效率可達25%，但由于光路的損耗和光線全反射的存在，其收集效率必然低于25%。為實現(xiàn)熒光信號的高效收集，對熒光收集光路進行優(yōu)化設(shè)計。根據(jù)設(shè)計結(jié)果計算，采用以上熒光收集光路，在傳輸距離達150 mm時，光線仍能保持良好的平行度，其發(fā)散角小于0.5°，滿足實際使用要求。

在光線傳輸150 mm位置設(shè)置探測面，對此處的熒光光強分布進行分析，其結(jié)果如圖6(b)所示。由探測面的光強分析可知，采用該熒光收集光路，其熒光接收效率高達19.57%。

圖6 熒光收集光路示意及探測面熒光光強分布Fig.6 Schematic diagram of collection light path and intensity distribution of detection surface

3 光學系統(tǒng)性能測試

3.1 光斑性能測試

光斑的性能分析采用間接激發(fā)進行測試。已知鞘流池內(nèi)流體的平均流速為V1，根據(jù)層流原理，則編碼微球通過激光光斑時的速度為2V1。

在測試過程中，設(shè)定V1為3 m/s，則編碼微球通過激發(fā)區(qū)域的速度為6 m/s。已知激光光斑的縱向尺寸為15 μm，而編碼微球的直徑為3 μm，則理論上，脈沖信號的寬度應(yīng)為3.5 μs。

采用標記熒光素APC的編碼微球進行測試，并采用示波器對FL3熒光通道進行觀測。根據(jù)理論計算預(yù)測，示波器中應(yīng)觀測到2個脈沖信號，其中第一個信號為編碼微球通過638 nm激光光斑時被激發(fā)形成，第二個信號為編碼微球通過488 nm激光光斑時被激發(fā)形成。兩個信號的寬度應(yīng)該保持一致，均為3.5 μs。同時，2個信號之間應(yīng)存在一定的間隔，間隔時間為光斑間隔距離除以編碼微球流動速度，約為10 μs。

示波器探測得到的脈沖信號形態(tài)如圖7所示。

圖7 示波器中FL3熒光通道信號形態(tài)Fig.7 Signal form of FL3 fluorescent channel in oscilloscope

由圖7可知，示波器中信號形態(tài)與理論預(yù)測保持一致。示波器中橫坐標單格為2 μs，兩個脈沖信號的寬度均為3.5 μs。同時，2個光斑之間存在一定時間間隔，其間隔時間約為10 μs。

以上結(jié)果說明光學系統(tǒng)的光斑尺寸與空間分離距離與理論設(shè)計值保持一致，表明光學系統(tǒng)的光斑性能滿足設(shè)計要求。

3.2 綜合性能評估

采用6Peaks標準微球?qū)鈱W系統(tǒng)的綜合性能進行評估。6Peaks標準微球常被用于評估流式細胞儀的各項性能，包括熒光靈敏度、熒光線性等。光學系統(tǒng)綜合性能評估結(jié)果如圖8所示。

圖8 光學系統(tǒng)綜合性能評估結(jié)果Fig.8 Integrated performance evaluation results of optical system

根據(jù)測試結(jié)果對3個熒光通道的熒光靈敏度進行計算，得到FL1、FL2、FL3的熒光靈敏度分別為40 MESF、28 MESF、13 MESF，熒光線性相關(guān)性R2分別為熒光線性0.999 9、0.998 2、1.000 0。以上性能可滿足液相芯片解碼和目標待測物濃度探測的需求。

4 結(jié)論

在基于流式熒光分析儀器的基礎(chǔ)上，筆者提出了創(chuàng)新的光學系統(tǒng)設(shè)計，結(jié)構(gòu)上采用了激光光斑整形模塊、散射光探測模塊、熒光探測模塊設(shè)計。在獲得各編碼微球的各熒光波長的熒光強度后，高速信號處理模塊將對熒光信號進行數(shù)字化處理，轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號后輸送給流式點陣發(fā)光分析儀，應(yīng)用軟件進行分析處理。筆者提出的流式點陣儀采用創(chuàng)新性光學系統(tǒng)設(shè)計，包括在激光光斑整形光路中，采用二次整形透鏡復用設(shè)計，保證2個激光光斑在水平方向和豎直方向上的尺寸和能量分布完全一致，確保不同波長激發(fā)出的熒光信號形態(tài)、寬度完全一致。相比于采用完全獨立透鏡進行光斑整形的光路，減少了透鏡的使用個數(shù)，光路結(jié)構(gòu)更為緊湊；整個光學系統(tǒng)的功能區(qū)塊采用一體化設(shè)計，各模塊安裝可以一次性完成，安裝或更換更為便利；光學模塊整體集成度高、結(jié)構(gòu)精簡，通過光路精確計算和機械加工來確保安裝位置的準確性，安裝完成后，無須調(diào)整任何光學器件，生產(chǎn)安裝和使用更為便捷。本研究可為流式熒光分析技術(shù)的應(yīng)用和推廣提供良好的基礎(chǔ)。