李立恒 周軍 張敏 王芹 安峰 張麗娟 汪佳 張凡

(1河北北方學院附屬第一醫(yī)院口腔科，河北 張家口 075000；2張家口市第一醫(yī)院口腔科；3張家口學院臨床學院；河北北方學院附屬第一醫(yī)院 4小兒外科；5病理科)

人涎腺腺樣囊性癌是最常見的涎腺惡性腫瘤之一，占涎腺上皮性腫瘤的8%～10%，可發(fā)生于任何年齡，易發(fā)生于腮腺、頜下腺、舌下腺等，具有神經周圍浸潤特征，容易侵入神經而發(fā)生遠處轉移〔1～4〕。目前，人涎腺腺樣囊性癌的治療方式主要是手術，但療效不太理想且復發(fā)率及患者不良預后率較高。微小RNA(miRNA)可作為癌基因或抑癌基因發(fā)揮功能、調控細胞增殖和凋亡等生物學行為，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關〔5〕。研究發(fā)現(xiàn)，miR-455在胃癌〔6〕、宮頸癌〔7〕、結腸癌〔8〕等腫瘤細胞中異常降低。線粒體促凋亡分子絲氨酸蛋白酶(Omi/HtrA2)是新發(fā)現(xiàn)的線粒體促凋亡因子，在調節(jié)細胞凋亡中發(fā)揮重要作用〔9,10〕。高鳳蘭等〔11〕研究發(fā)現(xiàn)，Omi/HtrA2基因過表達對食管癌細胞有明顯抑制作用，且可明顯提高癌細胞凋亡率。以往關于miR-455、Omi/HtrA2單獨在宮頸癌、胃癌、食管癌等腫瘤中研究較多，而在人涎腺腺樣囊性癌中鮮有報道，因此，本研究以人涎腺腺樣囊性癌高轉移細胞株(ACC-M)為研究對象，分析miR-455對Omi/HtrA2介導的人涎腺腺樣囊性癌細胞株線粒體凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1材料 收集2017年8月至2019年3月在河北北方學院附屬第一醫(yī)院70例因原發(fā)病手術切除并經病理診斷為人涎腺腺樣囊性癌患者的癌組織(其中腮腺39例，頜下腺20例，舌下腺11例)為人涎腺腺樣囊性癌組，男33例，女37例，年齡23～75歲，平均年齡(52.19±12.36)歲；選取正常涎腺組織65例(來源于同期醫(yī)院頜面部骨折手術患者)為對照組，男29例，女36例，年齡25～73歲，平均年齡(50.68±10.59)歲。兩組性別、年齡差異無統(tǒng)計學意義(P=0.449),具有可比性。無菌操作下取得的新鮮組織放入無菌凍存管后迅速投入液氮中快速冷凍，再轉至-80℃冰箱長期保存。人涎腺腺樣囊性癌高轉移細胞株(ACC-M)購自中國科學院上海生物科學研究所。

1.2主要試劑與儀器 RPMI1640培養(yǎng)基(批號NBG1236)購自美國Hyclone公司；胎牛血清(批號36G5782)購自美國Gibco公司；鏈霉素(批號NBG-236)、青霉素(批號FH6-73J)、二甲基亞砜(DMSO，批號17003-032)購自美國sigma公司；蛋白提取試劑盒(批號ME861R)、BCA試劑盒(批號2763DB)、胰蛋白酶(批號BD735N)、瓊脂糖、溴化乙錠、LipofectamineTM3000、膜聯(lián)蛋白(Annexin)V-異硫氰酸熒光素(FITC)/碘化丙啶(PI)細胞凋亡雙染試劑盒(貨號HUDY03)均購自上海碧云天公司；羊抗人ki67抗體(批號JD-2847)、Omi/HtrA2(批號YB-S903)抗體、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)-3抗體(批號XIN-56)、caspase-6抗體(批號XMN-68)、辣根過氧化物酶(HRP)標記山羊抗兔二抗(批號674GN6)購自美國Proteintech公司；反轉錄試劑盒(批號7856GU)購自美國Sigma公司)；Trizol Reagent核酸分離試劑(批號83H296)購自日本TaKaRa公司；AceQqPCR SYBR Green Mix(批號NC9343)購自南京vazyme生物公司；4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI，批號MC34063)、Al-exa Fluor594(批號ab150169)、Alexa Fluor 488(批號SY0602)購于Invitrogen公司；細胞色素C(批號140670)、線粒體抗體(NM8493)購于英國Abcam公司；CO2培養(yǎng)箱(型號NHD DYE1738)購自日本sanyo公司；倒置熒光顯微鏡(型號BNJD7836)購自美國Olympus公司；Elx800 酶標儀(型號HSG9832)購自美國Thermo公司)；熒光定量PCR儀(型號HDBC0291)購自Bio-Rad公司。

1.3方法

1.3.1細胞復蘇 實驗室常規(guī)消毒，紫外照射30 min，從液氮罐中取出無菌凍存管迅速轉到40℃水浴中，輕輕振蕩至凍存液完全融化，將細胞懸液移入離心管中，加入含15%滅活胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 mg/ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基，離心(3 000 r/min、5 min)，沉淀細胞，調整細胞濃度于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.2細胞傳代培養(yǎng) 將復蘇后的ACC-M細胞株在37℃，5%CO2、飽和濕度為95%的培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，培養(yǎng)液為含15%滅活胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 mg/ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基，每3 d換液1次，待細胞生長密度達80%時，0.25%胰蛋白酶消化，根據(jù)實驗需要進行傳代培養(yǎng)，收集對數(shù)生長期細胞用于后續(xù)研究。

1.3.3細胞轉染及分組 收集1.3.2中對數(shù)生長期的ACC-M細胞接種于6孔細胞板上(5.0×104個/孔)，采用LipofectamineTM3000法進行轉染，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。轉染后用RPMI1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。實驗分為3組：稀釋miR-455 mimics：250 μl無血清培養(yǎng)基RPMI1640稀釋10 μl的20 μmol/L的miR-455 mimics、miR-455-NC儲存液室溫孵育5 min。稀釋LipofectamineTM3000：50 μl無血清培養(yǎng)基RPMI1640稀釋5 μl LipofectamineTM3000，混勻室溫孵育5 min。將LipofectamineTM3000分別與miR-455 mimics(miR-455 mimics組)、miR-455-NC(陰性對照組)混合，靜置20 min，加入培養(yǎng)孔，輕輕混勻。以未經處理只加入500 μl RPMI1640培養(yǎng)基的細胞為空白對照組。將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，轉染48 h，收集細胞上清液待測。

1.3.4實時定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)檢測miR-455水平 取出超低溫冰箱內保存的人涎腺腺樣囊性癌組織、正常涎腺組織及1.3.3中穩(wěn)定轉染的空白對照組、陰性對照組、miR-455 mimics組細胞采用Trizol試劑提取各組細胞中總RNA，按照試劑盒說明書進行操作，使用分光光度計測定RNA濃度和純度，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。以RNA為模板，按照試劑盒說明書進行逆轉錄反應，所得cDNA進行qRT-PCR。反應體系20 μl：2×UltraSYBR mixture 10.0 μl，cDNA模板(25 ng/μl)2.0 μl，上下游引物各2.0 μl，ddH2O 4.0 μl；反應條件：預變性95℃ 30 s，變性95℃ 5 s，退火60℃ 30 s，延伸72℃ 20 s，共40個循環(huán)。引物由大連寶生生物工程有限公司設計并合成，miR-455以U6作為內參基因。采用2-ΔΔCt方法計算人涎腺腺樣囊性癌組織、正常涎腺組織miR-455 mRNA及各組細胞中miR-455 mRNA相對表達量。引物：反向引物5′-3′U6正向引物：5′-AAGGTGAAGGTCGGAGTCAAC-3′，反向：5′-GGGGTCATTGATGGCAACAATA-3′；miR-455正向引物：5′-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3′，反向：5′-GGAACGCTTCACGAATTTG-3′。

1.3.5MTT法檢測ACC-M細胞增殖能力 取1.3.3各組穩(wěn)定表達miR-455的ACC-M細胞，將細胞接種于96孔板進行培養(yǎng)，每個孔細胞密度為5×104個，分別培養(yǎng)24、48、72 h后向各孔加入MTT 20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，棄去上清，加入150 μl DMSO，振蕩10 min，使藍紫色結晶充分溶解。在酶標儀中570 nm處測定各孔細胞光密度(OD)，重復3次，取平均值。

1.3.6流式細胞儀PI染色法檢測miR-455對細胞凋亡的影響 收集1.3.3穩(wěn)定轉染48 h后的各組ACC-M細胞，使用AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡雙染試劑盒及流式細胞儀檢測細胞凋亡情況，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次，棄上清，并調節(jié)濃度至1×106個/ml的細胞懸液，取100 μl細胞懸液加入5 μl的AnnexinV/FITC及10 μl濃度為20 μg/ml的PI混勻，室溫避光孵育30 min，流式細胞儀檢測凋亡率。細胞凋亡率=(凋亡細胞數(shù)/總細胞數(shù))×100%。每組均設6個重復。

1.3.7免疫熒光檢測細胞色素C釋放及光密度情況 將爬片放入24孔板中接種細胞，12 h后轉染，用含200 μg/ml氟尿嘧啶(5-Fu)的培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，48 h后收集爬片，PBS洗3次(5 min/次)，用4%的多聚甲醛固定細胞20 min，PBS洗3次(5 min/次)，0.1%聚乙二醇辛基苯基醚(Tri-tonX-100)室溫通透10 min，PBS洗3次(5 min/次)，胎牛血清封閉30 min，加一抗細胞色素C(鼠抗1∶1 000)、線粒體(兔抗1∶800)室溫避光孵育3 h，PBST洗3次(5 min/次)，避光孵育二抗琥珀酰亞胺酯(AlexaFluor594，抗兔1∶1 500)、Alexa Fluor488(抗鼠1∶2 000)30 min，PBST洗3次(5 min/次)，DAPI封片、避光4℃保存，鏡下觀察并拍照。用Image J軟件半定量分析熒光強度。

1.3.8Western印跡檢測線粒體凋亡途徑相關蛋白Omi/HtrA2、caspase3、caspase6蛋白表達變化 收集1.3.3穩(wěn)定轉染48 h后的ACC-M細胞，PBS洗滌2次后，加入1%Triton裂解液，于冰上裂解30 min，在離心機上15 000 r/min離心20 min，取上清，通過蛋白提取試劑盒提取細胞總蛋白，根據(jù)BCA蛋白試劑盒測定細胞中總蛋白含量，蛋白樣品10～20 μl，經十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)分離后，電轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，在加入含5%脫脂奶粉的吐溫-20-三羥甲基氨基甲烷鹽緩沖液(TBST)溶液室溫下封閉1 h后；加入羊抗人ki67抗體(1∶1 000)、Omi/HtrA2抗體(1∶1 000)、caspase3抗體(1∶1 000)、caspase6抗體(1∶1 000)、β-actin作為一抗，4℃孵育過夜，TBST清洗，加入HRP標記山羊抗兔(1∶5 000)作為二抗，室溫下震蕩1 h后，用TBST洗1遍，電化學發(fā)光(ECL)顯色后曝光顯影，Tanon 600圖像分析系統(tǒng)拍照并進行定量分析。實驗重復3次，取平均值，以β-actin為內參分析ki67、Omi/HtrA2、caspase3、caspase6蛋白相對表達水平。

1.4統(tǒng)計學方法 采用SPSS17.0軟件進行方差分析、SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1對照組及人涎腺腺樣囊性癌組中miR-455表達水平比較 與對照組(1.07±0.20)相比，人涎腺腺樣囊性癌組miR-455表達顯著降低(0.50±0.11；t=20.299，P=0.000)。

2.2空白對照組、陰性對照組及miR-455 mimics組轉染效果檢測 miR-455 mimics組ACC-M細胞中miR-455表達水平顯著高于空白對照組、陰性對照組(1.42±0.23、0.87±0.19、0.88±0.19，P<0.05)，而空白對照組、陰性對照組無顯著性差異(P>0.05)。

2.3過表達miR-455對ACC-M細胞增殖的影響 CCK-8實驗顯示，與空白對照組相比，陰性對照組各時間點OD值差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，miR-455 mimics組轉染后48 h、72 h后OD值顯著降低(P<0.05)；與陰性對照組相比，miR-455 mimics組轉染后48 h、72 h OD值顯著降低(P<0.05)。見表1。

表1 3組不同時間細胞增殖情況

2.4miR-455過表達對ACC-M細胞凋亡的影響 與空白對照組相比，陰性對照組細胞凋亡率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，miR-455 mimics組細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)；與陰性對照組相比，miR-455 mimics組細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)。見表2、圖1。

表2 3組細胞凋亡情況

圖1 3組細胞凋亡情況

2.5免疫熒光檢測細胞色素C釋放情況 熒光免疫結果顯示，與空白對照組、陰性對照組比較，miR-455 mimics組細胞色素C呈彌散性分布于細胞質中，圍繞在細胞核周圍，見圖2；細胞色素C、線粒體平均光密度顯著升高(P<0.05)，見表3。

圖2 熒光免疫檢測熒光色素釋放情況(×100)

2.6miR-455過表達對增殖蛋白ki67、線粒體凋亡途徑相關蛋白Omi/HtrA2、caspase3、caspase6表達的影響 與空白對照組比較，陰性對照組ACC-M細胞中ki67、Omi/HtrA2、caspase3、caspase6蛋白差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，miR-455 mimics組ACC-M細胞中ki67蛋白相對表達量顯著降低(P<0.05)，Omi/HtrA2、caspase3、caspase6蛋白相對表達量顯著升高(P<0.05)；與陰性對照組比較，miR-455 mimics組ACC-M細胞中ki67蛋白相對表達量顯著降低(P<0.05)，Omi/HtrA2、caspase3、caspase6蛋白相對表達量顯著升高(P<0.05)。見表3、圖3。

表3 3組細胞色素C、線粒體平均光密度及ki67、Omi/HtrA2、caspase3、caspase6蛋白相對表達量比較

1～3:空白對照組、陰性對照組、miR-455 mimics組

3 討 論

成熟miRNA是長度為20～23個核苷酸(nt)的單鏈RNA分子，是基因表達的重要調節(jié)劑，通常會降低mRNA穩(wěn)定性，包括介導腫瘤發(fā)生過程基因的mRNA，可作為癌基因或抑癌基因發(fā)揮功能、調控細胞增殖和凋亡等生物學行為〔12,13〕。李平等〔14〕研究顯示，與慢性宮頸炎組比較，宮頸癌組組織miR-455表達水平顯著降低，提示miR-455可能在宮頸癌中發(fā)揮抑癌基因作用。本研究結果提示miR-455可能與人涎腺腺樣囊性癌的發(fā)病有關，其有可能同樣在人涎腺腺樣囊性癌中發(fā)揮抑癌基因作用；提示細胞轉染成功，可供后續(xù)試驗。癌細胞除增殖迅速外，凋亡能力減弱也是癌細胞發(fā)展迅速的重要原因。本研究流式細胞儀檢測結果提示miR-455過表達可能促進ACC-M細胞凋亡。

線粒體是細胞凋亡調控的活動中心，在凋亡因子的刺激下，線粒體釋放出不同促凋亡因子，激活細胞內凋亡蛋白酶〔15〕。Omi/HtrA2是由一種絲氨酸蛋白酶，在內質網合成后由線粒體定向序列/線粒體定位信號(MTS/MLS)引導轉運至線粒體，通過自身蛋白酶解或被線粒體加工肽酶降解形成成熟Omi分子〔16，17〕。當細胞受到凋亡刺激反應時，線粒體膜通透性增加，進一步使Omi/HtrA2分子從線粒體釋放入細胞質而發(fā)揮促凋亡作用〔18〕。caspase3是線粒體凋亡途徑關鍵執(zhí)行者，當線粒體釋放凋亡蛋白(如細胞色素C、Omi/HtrA2)時，引起caspase6活化，進一步發(fā)生級聯(lián)反應，引起caspase3活化，導致DNA斷裂發(fā)生凋亡〔19〕。本研究免疫熒光檢測細胞色素C釋放情況，提示miR-455過表達可促進線粒體凋亡，過表達miR-455可能通過激活Omi/HtrA2介導的線粒體凋亡途徑促進人涎腺腺樣囊性癌ACC-M細胞發(fā)生凋亡。

綜上，miR-455可能通過Omi/HtrA2介導的線粒體凋亡途徑促進人涎腺腺樣囊性癌ACC-M細胞發(fā)生凋亡。但是本研究未能明確miR-455在人涎腺腺樣囊性癌發(fā)生發(fā)展過程中的具體作用機制，后期仍需進一步研究。