張菁華 許可 劉勝賢 李鑫

(天津市北辰區(qū)中醫(yī)醫(yī)院腦病三科，天津 300400)

缺血性腦卒中屬于臨床常見腦損傷疾病，其發(fā)病率和死亡率逐年上升，且其致殘率較高，嚴(yán)重危害人們的生命健康，影響患者的生活質(zhì)量〔1〕。缺血性腦組織實(shí)現(xiàn)再灌注是治療缺血性腦卒中重要措施，但易產(chǎn)生繼發(fā)性腦缺血再灌注損傷〔2,3〕。腦缺血再灌注損傷導(dǎo)致機(jī)體神經(jīng)功能出現(xiàn)障礙，海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)完整性與腦缺血再灌注損傷導(dǎo)致的神經(jīng)功能障礙密切相關(guān)〔4〕。研究顯示，抑制N-甲基-D-天冬氨酸受體(NMDAR)/細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)信號(hào)通路可以對(duì)腦缺血再灌注損傷神經(jīng)起保護(hù)作用〔5〕。中藥治療缺血性腦卒中具有毒副作用小、靶點(diǎn)多、成本低等多種優(yōu)點(diǎn)，其中天麻鉤藤飲具有補(bǔ)腎益智、清熱活血等功效，其常用中藥治療腦缺血，可保護(hù)細(xì)胞免受缺血性損傷〔6〕。天麻鉤藤飲可以通過下調(diào)NMDAR的表達(dá)減少視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的損傷和凋亡，對(duì)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞起到一定保護(hù)作用〔7〕。然而在腦缺血再灌注損傷中麻鉤藤飲對(duì)NMDAR/ERK通路的作用機(jī)制尚不完全清楚，本研究通過構(gòu)建腦缺血再灌注損傷大鼠模型，觀察麻鉤藤飲對(duì)模型大鼠海馬鈣化及NMDAR/ERK通路的影響，以探究麻鉤藤飲的藥理機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF清潔級(jí)SD大鼠，8周齡，體重250 g左右，由北京生命科學(xué)研究所動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，合格證號(hào)為SYXK(京)2015-0002，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。本研究經(jīng)天津市北辰區(qū)中醫(yī)醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意。

1.2試劑及儀器 天麻鉤藤顆粒(國藥準(zhǔn)字Z51021084)購自成都九芝堂金鼎藥業(yè)有限公司；尼莫地平片(國藥準(zhǔn)字H14022821)購自亞寶藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司；蘇木素染液(貨號(hào)：G1080)、伊紅染液(貨號(hào)：G1100)購自北京索萊寶科技有限公司；Trizol提取試劑盒(貨號(hào)：RN0401)購自北京艾德萊生物科技公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號(hào)：K1622)購自美國Fermentas公司；AceQ qPCR SYBR Green Master Mix(貨號(hào)：Q111-02)購自南京諾唯贊生物科技有限公司；兔源多克隆NMDAR抗體(貨號(hào)：A-6473)、兔源單克隆ERK抗體(貨號(hào)：13-6200)、兔源單克隆磷酸化(p)-ERK抗體(貨號(hào)：MA5-15033)購自中國賽默飛世爾科技有限公司；兔源單克隆抗β-actin抗體(貨號(hào)： 3700S)購自美國CST公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗(貨號(hào)：YB-19442)購自美國R&D/Prosci/NovusBiologicals公司；顯微鏡(型號(hào)：XDS-10)購自上海炳宇光學(xué)儀器有限公司；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(型號(hào)：ChemiDocXRS)購自美國Bio-Rad公司；qRT-PCR所需引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1天麻鉤藤飲藥液的制備 根據(jù)人類每天口服15 g天麻鉤藤顆粒，人到大鼠轉(zhuǎn)換因子為6.25，大鼠每天用量為1.56 g/kg，將天麻鉤藤顆粒分別以0.156 g/ml、0.468 g/ml原液濃度溶于鹽水中，并保存于4℃。

1.3.2動(dòng)物分組與給藥 將75只SD大鼠隨機(jī)分為5組：假手術(shù)組、模型組、尼莫地平組、天麻鉤藤飲低劑量組、天麻鉤藤飲高劑量組，每組各15只。尼莫地平組：灌胃給予尼莫地平8.0 mg/(kg·d)；天麻鉤藤飲低劑量組：灌胃給予天麻鉤藤飲1.56 g/(kg·d)；天麻鉤藤飲高劑量組：灌胃給予天麻鉤藤飲4.68 g/(kg·d)；假手術(shù)組、模型組：灌胃給予等量生理鹽水，連續(xù)灌胃14 d。末次給藥2 h后，制備腦缺血再灌注損傷大鼠模型。

1.3.3腦缺血再灌注損傷大鼠模型制備 參照文獻(xiàn)〔8〕采用大腦中動(dòng)脈線栓法制備腦缺血再灌注損傷大鼠模型，術(shù)前禁食不禁水12 h，大鼠腹腔注射10%水合氯醛(3.5 mg/kg)麻醉，切開頸部皮膚，使左側(cè)頸動(dòng)脈三角暴露，在頸動(dòng)脈處進(jìn)行結(jié)扎，在頸總動(dòng)脈處剪開一小口，插入直徑為0.25 mm的魚線，穿過頸總動(dòng)脈進(jìn)入內(nèi)動(dòng)脈，進(jìn)而阻斷大腦中動(dòng)脈血流，缺血2 h后拔除魚線，再灌注24 h，假手術(shù)組大鼠僅暴露大鼠左側(cè)頸動(dòng)脈三角區(qū)，手術(shù)完成后，縫合切口，用碘酒進(jìn)行消毒。

1.3.4各組神經(jīng)功能缺損評(píng)分檢測 造模24 h后，根據(jù)Longa分級(jí)法〔9〕對(duì)各組神經(jīng)功能進(jìn)行檢測，大鼠行為無異常0分，出現(xiàn)不能完全伸展右前爪1分；行走出現(xiàn)右旋轉(zhuǎn)2分；行走出現(xiàn)右側(cè)傾倒3分；意識(shí)喪失，無行走能力4分。重復(fù)評(píng)定3次，取平均值作為最終評(píng)分，評(píng)分在1～3分說明模型制備成功。

1.3.5水迷宮法檢測各組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力 制作高水迷宮水池(直徑120 cm，高35 cm)，水池分為四個(gè)象限，在第一象限內(nèi)設(shè)置一個(gè)高15 cm的平臺(tái)并連接攝像機(jī)系統(tǒng)，將大鼠從第三象限放入水池中，記錄大鼠進(jìn)入水中穿過平臺(tái)的次數(shù)，每天訓(xùn)練1次，訓(xùn)練3 d，第4天測定大鼠在一定時(shí)間內(nèi)穿過平臺(tái)的次數(shù)。

1.3.6蘇木素-伊紅(HE)染色觀察各組海馬組織病理學(xué)變化 水迷宮實(shí)驗(yàn)后，每組取5只大鼠，用水合氯醛(1 g/kg)麻醉處死大鼠，分離腦組織，用4%多聚甲醛固定，做常規(guī)石蠟切片，海馬吻合位置連續(xù)冠狀切片(4 μm)。用蘇木素-伊紅染液染色，每張切片選取5個(gè)視野，光學(xué)顯微鏡下觀察腦組織海馬區(qū)病理學(xué)改變。

1.3.7透射電鏡觀察各組大鼠海馬鈣化情況 每組選取5只大鼠，同1.3.6方法分離腦組織，按照電鏡常規(guī)操作制備超薄切片，每張切片選取5個(gè)視野，用透射電子顯微鏡觀察并采集圖片。

1.3.8Western印跡法檢測各組海馬組織中NMDAR、ERK、p-ERK蛋白表達(dá) 提取海馬組織總蛋白，BCA法測其濃度，按蛋白30 μg/孔上樣進(jìn)行電泳分離、轉(zhuǎn)膜、封閉后分別加入一抗(抗NMDAR、ERK、p-ERK抗體，1∶1 000)，4℃下過夜培養(yǎng)，次日加二抗(1∶5 000)，溫室中培養(yǎng)1 h，洗膜，電化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行顯色，用β-actin作內(nèi)參，掃描膠片，Tanon 600圖像分析系統(tǒng)分析條帶灰度值。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組神經(jīng)功能缺損評(píng)分結(jié)果 與假手術(shù)組相比，模型組神經(jīng)功能缺損評(píng)分顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，尼莫地平組、天麻鉤藤飲低、高劑量組神經(jīng)功能缺損評(píng)分顯著降低(P<0.05)；與尼莫地平組相比，天麻鉤藤飲低劑量組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分顯著升高(P<0.05)；與天麻鉤藤飲低劑量組相比，天麻鉤藤飲高劑量組神經(jīng)功能缺損評(píng)分顯著降低(P<0.05)。見表1。

2.2各組學(xué)習(xí)記憶能力檢測結(jié)果 與假手術(shù)組相比，模型組穿越平臺(tái)次數(shù)顯著降低(P<0.05)；與模型組相比，尼莫地平組、天麻鉤藤飲低、高劑量組大鼠穿越平臺(tái)次數(shù)顯著升高(P<0.05)；與尼莫地平組相比，天麻鉤藤飲低劑量組穿越平臺(tái)次數(shù)顯著降低(P<0.05)；與天麻鉤藤飲低劑量組相比，天麻鉤藤飲高劑量組穿越平臺(tái)次數(shù)顯著升高(P<0.05)。見表1。

表1 各組神經(jīng)功能缺損評(píng)分、學(xué)習(xí)記憶能力及海馬組織中NMDAR、ERK、p-ERK蛋白表達(dá)比較

2.3各組海馬組織病理學(xué)變化 假手術(shù)組海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞排列整齊無明顯病理變化；模型組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞排列紊亂、細(xì)胞破裂、有空泡樣變，伴有炎性細(xì)胞浸潤；與模型組相比，尼莫地平組、天麻鉤藤飲低、高劑量組海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞病理癥狀明顯減輕。見圖1。

圖1 各組海馬組織HE染色圖(×400)

2.4各組海馬鈣化情況 與假手術(shù)組相比，模型組海馬區(qū)神經(jīng)纖維出現(xiàn)不規(guī)則形狀結(jié)構(gòu)，有密集堆積的針狀鈣化沉淀物形成；與模型組相比，尼莫地平組、天麻鉤藤飲低、高劑量組海馬區(qū)針狀鈣化沉淀物明顯減小。見圖2。

圖2 各組海馬CA1區(qū)透射電子顯微鏡圖(×12 000)

2.5各組海馬組織中NMDAR、ERK、p-ERK蛋白表達(dá) 與假手術(shù)組相比，模型組海馬組織中NMDAR、p-ERK/ERK蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，尼莫地平組、天麻鉤藤飲低、高劑量組海馬組織中NMDAR、p-ERK/ERK蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)；與尼莫地平組相比，天麻鉤藤飲低劑量組海馬組織中NMDAR、p-ERK/ERK蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)；與天麻鉤藤飲低劑量組相比，天麻鉤藤飲高劑量組海馬組織中NMDAR、p-ERK/ERK蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)。見表1、圖3。

1～5：假手術(shù)組，模型組，尼莫地平組，天麻鉤藤飲低劑量組，天麻鉤藤飲高劑量組

3 討 論

缺血性腦血管病是腦血管疾病中常見疾病之一，腦組織長時(shí)間缺血恢復(fù)血流再灌注后會(huì)引起腦組織進(jìn)一步損傷，但腦缺血再灌注損傷的致病機(jī)制較為復(fù)雜，與細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)、炎癥因子、自由基活性等多種環(huán)節(jié)密切相關(guān)〔10〕。腦缺血再灌注損傷會(huì)引起嚴(yán)重的神經(jīng)功能障礙，本研究大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分與張吉芳等〔11〕研究結(jié)果一致，提示缺血再灌注損傷大鼠模型構(gòu)建成功。天麻鉤藤飲由天麻、鉤藤、石決明、山梔、黃芩等多種中藥組成，有平肝息風(fēng)、清降肝熱、補(bǔ)益肝腎、安神定志之功效〔12〕。天麻鉤藤飲在腦出血、腦梗死等腦血管疾病治療中發(fā)揮重要作用〔13〕。本研究結(jié)果提示天麻鉤藤飲可以緩解缺血再灌注損傷大鼠神經(jīng)功能缺損，提高大鼠學(xué)習(xí)記憶力，且高劑量天麻鉤藤飲治療效果與尼莫地平相似〔14〕。

海馬是位于大腦皮層內(nèi)褶區(qū)，是腦組織中重要的結(jié)構(gòu)之一，主要負(fù)責(zé)機(jī)體的記憶和學(xué)習(xí)，腦缺血再灌注損傷造成海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞損傷，鈣穩(wěn)態(tài)失調(diào)〔15,16〕。本研究大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)比較結(jié)果與袁宇紅等〔17〕研究結(jié)果一致，提示缺血再灌注損傷會(huì)引起海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞鈣化等病變，推測缺血再灌注損傷大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞損傷引起神經(jīng)功能缺損。天麻鉤藤飲可以減緩缺血再灌注損傷大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞病理癥狀及鈣化情況。

NMDAR是一種谷氨酸離子型受體，NR2A和NR2B是NMDAR重要的亞基。研究顯示，缺血再灌注損傷引起機(jī)體谷氨酸異常增多，谷氨酸與其受體NMDAR結(jié)合啟動(dòng)細(xì)胞鈣離子通道，使細(xì)胞內(nèi)鈣離子增多造成鈣離子超載〔18,19〕。ERK屬于絲裂原活化蛋白激酶家族，參與調(diào)控細(xì)胞生長、分化、死亡等多種生理過程，Bruna等〔20〕研究顯示，ERK參與NMDAR介導(dǎo)的鈣離子釋放過程。本研究結(jié)果提示NMDAR蛋白表達(dá)及ERK磷酸化蛋白表達(dá)與缺血再灌注損傷發(fā)生密切相關(guān)。Zhao等〔21〕研究顯示，可以通過調(diào)節(jié)NR2B-ERK/CREB信號(hào)通路，改善腦缺血再灌注損傷組織病理學(xué)病變，對(duì)其神經(jīng)起保護(hù)作用。本研究發(fā)現(xiàn)，天麻鉤藤飲可以調(diào)控NMDAR、ERK磷酸化蛋白表達(dá)，抑制NMDAR/ERK信號(hào)通路激活，推測天麻鉤藤飲可能通過抑制NMDAR/ERK信號(hào)通路激活，改善腦缺血再灌注損傷組織病理學(xué)病變，減輕神經(jīng)損傷。

綜上，天麻鉤藤飲可能通過抑制NMDAR/ERK信號(hào)通路激活，減輕海馬區(qū)鈣化，緩解腦損傷病理癥狀，提高腦缺血再灌注損傷大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，但缺血再灌注損傷的致病機(jī)制較為復(fù)雜，天麻鉤藤飲對(duì)其治療作用及具體作用機(jī)制需進(jìn)一步驗(yàn)證。