李福志 張紅 王亞帝

(1錦州醫(yī)科大學(xué)，遼寧 錦州 121000；2錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院腫瘤外科)

乳腺癌位居全球女性癌癥的首位，也是中國(guó)女性第一高發(fā)的惡性腫瘤，其發(fā)病率逐年升高，嚴(yán)重威脅女性的生命健康〔1,2〕。近年來，雖然隨著檢測(cè)技術(shù)和治療手段的不斷提高，乳腺癌患者5年生存率已近90%〔3〕，但由于很多乳腺癌患者早期即出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，除手術(shù)剔除癌變的淋巴結(jié)外，目前尚無特殊的治療方法，故導(dǎo)致許多患者預(yù)后不良。因此，盡早發(fā)現(xiàn)乳腺癌、阻止乳腺癌早期淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，對(duì)乳腺癌患者的預(yù)后具有重要的臨床意義。

凝溶膠蛋白(GSN)是GSNs超家族中一個(gè)重要的肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白(ABP)，是細(xì)胞結(jié)構(gòu)和代謝的多功能調(diào)節(jié)劑，其參與腫瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵襲等多個(gè)步驟〔4〕。有研究顯示，GSN可通過抑制細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)的活化和上調(diào)金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMPs)-3的表達(dá)，抑制乳腺癌細(xì)胞 MCF7/Her2 增殖、遷移及侵襲〔5〕；通過抑制PKR-p38信號(hào)通路，抑制胃癌細(xì)胞的遷移〔6〕。

為進(jìn)一步闡明GSN在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展中的作用及可能的作用機(jī)制，從而為臨床上早期發(fā)現(xiàn)乳腺癌、阻止其淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移提供參考，本文觀察GSN在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織的表達(dá)情況并探討其過表達(dá)對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖和侵襲影響及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1標(biāo)本來源 收集2018年1～12月錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院和錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院經(jīng)臨床病理確診的40例女性乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌患者的癌組織標(biāo)本，TNM 分期〔7〕：T1N1-3期20例、T2-3N0期20例；平均年齡(54.73±8.63)歲。同時(shí)收集20例乳腺腺瘤患者瘤旁正常組織標(biāo)本作為對(duì)照。所有患者：①為原發(fā)乳腺癌，且未合并其他腫瘤；②術(shù)前未行放療、化療和免疫治療；③無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。

1.2細(xì)胞、質(zhì)粒 MCF-7細(xì)胞(BNCC315787)購(gòu)自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院，GSN過表達(dá)載體GSN-pcDNA3.1由江西中洪博元生物技術(shù)有限公司合成和提供。

1.3主要試劑和儀器 兔抗人GSN 單克隆抗體(貨號(hào)：11644-2-AP,稀釋比：1/1 000) 購(gòu)自美國(guó)Proteintech Group公司，兔抗人磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K，ab151549,1/1 000)、兔抗人蛋白激酶B(AKT，ab8805,1/500)均購(gòu)自沃卡威(北京)生物技術(shù)公司，兔抗人p-AKT(AF0016,1/1 000) 購(gòu)自美國(guó)Affinity Biosciences公司，轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine3000購(gòu)自美國(guó)英杰生命技術(shù)有限公司，無血清培養(yǎng)基(Opti-MEM)、CCK8試劑盒均購(gòu)自江蘇凱基生物技術(shù)股份公司，免疫組化檢測(cè)試劑盒、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，Transwell小室購(gòu)自美國(guó)康寧公司，超純RNA提取試劑盒(CW0581M)、BCA試劑盒均購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有好公司,HiFiScript cDNA 第一鏈合成試劑盒購(gòu)自賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)(CFX ConnectTM實(shí)時(shí))、超高靈敏度化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(Chemi DocTMXRS+)均購(gòu)自伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司。

1.4GSN表達(dá)水平的檢測(cè) 采用免疫組化法。按照免疫組化試劑盒說明書進(jìn)行操作：常規(guī)石蠟包埋收集的T1N1-3期T2-3N0期乳腺癌組織和正常組織標(biāo)本，按厚約3 μm連續(xù)切片，脫蠟、脫水后，用pH 6.0的檸檬酸鈉作為抗原修復(fù)液，置120℃高壓中修復(fù)3 min,加入新配制的3%過氧化氫(H2O2)水封閉孵育30 min；磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次，每次3～5 min,加入兔抗人GSN單克隆抗體 (1∶200稀釋)，4℃孵育過夜；取出切片室溫靜置45 min，PBS浸洗后，加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶100稀釋)，37℃孵育30 min，PBS充分洗滌；常規(guī)二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色、蘇木素復(fù)染、脫水、透明、封片、鏡檢。

1.5GSN過表達(dá)對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖和侵襲影響的檢測(cè)

1.5.1細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 將濃度為5 000個(gè)細(xì)胞/ml的MCF-7細(xì)胞接種至100 μl含10%胎牛血清(FBS)和1% 青霉素鏈霉素混合液的MEM完全培養(yǎng)基的96孔培養(yǎng)版中，置37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)；當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)90%以上時(shí)，棄去培養(yǎng)液，PBS清洗，加入0.25%胰蛋白酶消化3 min后，加入100 μl含10% FBS的MEM完全培養(yǎng)基進(jìn)行充分吹打，將吹打下來的細(xì)胞用吸管吸取至10 ml離心管中，離心、棄去上清，加入MEM完全培養(yǎng)基，吸出細(xì)胞液、接種至100 ml培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)70%時(shí)，將細(xì)胞培養(yǎng)基更換為不含血清的培養(yǎng)基，并按lipofectamine P3000說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染：取2支滅菌EP管，每管加入上述培養(yǎng)的MCF-7細(xì)胞和125 μl Opti-MEM后，其中一管加入5 μl轉(zhuǎn)染試劑 lipofectamine3000(空載組)、另一管加入2.5 μg GSN-pcDNA3.1和5 μl lipofectamine P3000(GSN過表達(dá)組)，同時(shí)設(shè)細(xì)胞對(duì)照(空白組)，混勻后置室溫孵育15 min；用移液管將EP管中液體滴加至6孔培養(yǎng)板中的對(duì)應(yīng)孔內(nèi)，置37℃、5%CO2孵箱中轉(zhuǎn)染4 h后，向6孔板中加入1 ml血清含量為20%的完全培養(yǎng)基，置37℃、5%CO2孵箱中繼續(xù)轉(zhuǎn)染48 h，采用RT-qPCR和Western印跡檢測(cè)MCF-7細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率。

1.5.2MCF-7細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率的檢測(cè)

1.5.2.1實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測(cè) 收集轉(zhuǎn)染48 h后細(xì)胞，加入Trizon 裂解液，用移液槍吹打，使貼壁細(xì)胞懸浮、并與裂解液充分接觸；收集細(xì)胞懸液，按照超純RNA提取試劑盒說明書提取細(xì)胞總RNA，采用紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定RNA的濃度和純度(A260/A280)。按照HiFiScript cDNA 第一鏈合成試劑盒說明書將提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以合成的cDNA為模板，采用熒光PCR儀進(jìn)行熒光定量PCR，擴(kuò)增體系：RNase Free ddH2O 9.5 μl、cDNA 1 μl、上游引物1μl、下游引物1 μl、2×SYBR Green PCR Master Mix 12.5 μl，總體系為25 μl；擴(kuò)增條件：預(yù)變性 95℃預(yù)變性10 min，95℃變性10 s，58℃退火30 s，延伸72℃延伸30 s,共40個(gè)循環(huán)。GSN上游引物：5′-GATTGGACGTTTTGTGA-TCGAAG-3′，下游5′-TCCGTCTCGATGTACCGCTT-3′；以GAPDH作為內(nèi)參：GAPDH上游引物5′-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3′，下游：5′-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3′。根據(jù)2-△△Ct法計(jì)算GSN的相對(duì)表達(dá)量。

1.5.2.2Western印跡檢測(cè) 取轉(zhuǎn)染48 h后細(xì)胞，經(jīng)12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離2 h后，電轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，用3%的脫脂牛奶常溫封閉1 h；加入兔抗人GSN單克隆抗體(1∶1 000稀釋)，常溫過夜后，PBST充分洗滌，加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG (1∶2 000釋)，常溫作用2 h；PBST充分洗滌后，加入TMT底物,避光顯色，用蒸餾水終止顯色。

1.5.3GSN過表達(dá)對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖影響的檢測(cè) 采用CCK8檢測(cè)法。收集轉(zhuǎn)染48 h后細(xì)胞，棄去培養(yǎng)液，PBS洗2次，加入0.25% 胰蛋白酶消化3 min后，加入含10%FBS的MEM完全培養(yǎng)基，吹打細(xì)胞，用移液管將細(xì)胞液移至10 ml離心管中，離心、棄去上清。按CCK8試劑盒說明書進(jìn)行操作：取100 μl細(xì)胞懸液接種至96孔培養(yǎng)板中，5×103個(gè)細(xì)胞/孔，置37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于細(xì)胞培養(yǎng)24、48、72 h時(shí)，加入CCK8試劑，10 μl/孔，再于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，置酶標(biāo)儀波長(zhǎng)405 nm處讀取各孔吸光度值(A)。

1.5.4GSN過表達(dá)對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞侵襲影響的檢測(cè) 采用Transwell侵襲試驗(yàn)。收集轉(zhuǎn)染48 h后細(xì)胞，棄去培養(yǎng)液，PBS洗2次后，加入0.25%胰蛋白酶消化3 min；加入含10%FBS的完全培養(yǎng)基，用吸管吹打細(xì)胞，將吹打下來的細(xì)胞吸至10 ml離心管中，離心，棄上清，用無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，將細(xì)胞濃度調(diào)整為5×104個(gè)細(xì)胞/ml后，接種在Transwell上室，100 μl/孔，并使上室每孔細(xì)胞與無血清培養(yǎng)基總體積約300 μl；在Transwell下室加入500 μl含10% FBS完全培養(yǎng)基，置37℃、5%CO2孵箱中孵育48 h；取出小室，棄去培養(yǎng)基，PBS漂洗5 min后，用95%乙醇固定10 min，0.1%結(jié)晶紫靜置染色1 h，PBS洗滌，用棉簽擦去上室內(nèi)細(xì)胞，將小室倒置在載玻片上于鏡下進(jìn)行拍照后，隨機(jī)取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)每個(gè)視野MCF-7細(xì)胞數(shù)，取平均值。

1.6GSN過表達(dá)對(duì)MCF-7細(xì)胞中PI3K-AKT信號(hào)通路影響的檢測(cè) 采用Western印跡法。取轉(zhuǎn)染48 h后細(xì)胞，加入100 μl裂解液，冰上裂解30 min，12 000 r/min離心10 min，收集上清液，按BCA試劑盒說明書測(cè)定上清中蛋白濃度。取7 μl蛋白樣品，常規(guī)SDS-PAGE分離2 h后，電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用3%的脫脂牛奶封閉1 h；分別加入兔抗人GSN單克隆抗體(1∶1 000稀釋)、兔抗人PI3K(1∶1 000稀釋)、兔抗人AKT(1∶500稀釋)和兔抗人p-AKT(1∶1 000稀釋)，4℃孵育過夜；TBST洗滌后，加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶100稀釋)，室溫孵育2 h。充分洗膜后，在膜上滴加電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒曝光液，于凝膠成像系統(tǒng)中曝光，以GAPDH為內(nèi)參照，用ImageJ軟件分析各抗體蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism7軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1GSN的表達(dá)水平 與乳腺正常組織(GSN在乳腺正常組織細(xì)胞胞質(zhì)中呈棕黃色高表達(dá)，32.246±2.948)相比，GSN在T1N1-3期和T2-3N0期乳腺癌組織明顯低于乳腺正常組織(8.542±5.267、18.146±7.393，P<0.05)，且T1N1-3期乳腺癌組織中GSN含量最低，見圖1。

圖1 GSN在乳腺正常組織及T1N1-3期、T2-3N0期乳腺癌組織中表達(dá)(SP，×200)

2.2GSN過表達(dá)轉(zhuǎn)染效率 與空白組相比，GSN過表達(dá)組GSN mRNA和蛋白的相對(duì)表達(dá)水平顯著上調(diào)(P<0.05)，表明轉(zhuǎn)染成功，見圖2、表1。

1～3：空白組，空載組，GSN過表達(dá)組，圖4同

表1 RT-qPCR與Western印跡驗(yàn)證GSN過表達(dá)轉(zhuǎn)染效率

2.3GSN過表達(dá)對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖的影響 與空白組相比，GSN過表達(dá)24 h和48 h時(shí)顯著抑制MCF-7細(xì)胞增殖(P<0.05)；但培養(yǎng)72 h時(shí)，GSN過表達(dá)組對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖的影響與空白組對(duì)比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表2 GSN過表達(dá)在各時(shí)間點(diǎn)對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖的影響

2.4GSN過表達(dá)對(duì)MCF-7細(xì)胞侵襲的影響 與空白和空載組相比，GSN過表達(dá)組顯著抑制MCF-7細(xì)胞的侵襲〔(865.00±15.716)個(gè)、(853.33±24.906)個(gè)、(735.67±14.844)個(gè)；P<0.05〕，見圖3。

圖3 GSN過表達(dá)對(duì)MCF-7細(xì)胞侵襲的影響(結(jié)晶紫染色，×100)

2.5GSN過表達(dá)對(duì)MCF-7細(xì)胞中PI3K-AKT信號(hào)通路的影響 與空白組和空載組相比，GSN過表達(dá)組顯著下調(diào)PI3K-AKT信號(hào)通路中相關(guān)蛋白PI3K和p-AKT蛋白的表達(dá)水平(P<0.05)，表明GSN過表達(dá)可抑制PI3K-AKT信號(hào)通路活化，見圖4、表3。

圖4 GSN過表達(dá)對(duì)MCF-7細(xì)胞中PI3K-AKT信號(hào)通路的影響

表3 Western印跡檢測(cè)PI3K-AKT通路相關(guān)蛋白表達(dá)

3 討 論

作為胞質(zhì)內(nèi)一種重要的肌動(dòng)蛋白(actin)結(jié)合蛋白，GSN與炎癥、腫瘤等多種疾病的病理過程密切相關(guān)〔8〕。在體外，GSN在乳腺癌〔5〕和胃癌〔9〕、結(jié)腸癌〔10〕、腎癌〔11〕、卵巢癌〔12〕等多種腫瘤中表達(dá)水平均降低，具有明顯的腫瘤抑制作用，在腫瘤的發(fā)生過程中起負(fù)調(diào)節(jié)作用，被認(rèn)為是1種候選的抑癌基因。

本研究結(jié)果與以往的研究結(jié)果一致，推測(cè)GSN可能在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌的發(fā)生和淋巴轉(zhuǎn)移中起了抑制作用。雖然目前對(duì)GSN 在腫瘤細(xì)胞中低表達(dá)的機(jī)制尚不很清楚，但Haga等〔13〕研究發(fā)現(xiàn)，組蛋白脫乙?；饔煤?GSN 基因啟動(dòng)子核心區(qū)域形成的莖環(huán)結(jié)構(gòu)是GSN 基因啟動(dòng)子沉默的原因；Kim等〔14〕通過對(duì)胃癌的研究，認(rèn)為GSN在腫瘤中的低表達(dá)與癌組織中組蛋白去乙?；?1 的高表達(dá)密切相關(guān)，是由于基因外的機(jī)制調(diào)控所致；Ni等〔15〕在對(duì)胰腺癌研究顯示，泛素-蛋白酶體途徑參與了GSN 的降解，致 GSN 在胰腺癌中呈低表達(dá)，推測(cè)蛋白翻譯后修飾是 GSN 在腫瘤中低表達(dá)的一個(gè)重要因素。

Zhu等〔11〕在體外觀察到，GSN的過表達(dá)在抑制786-0透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌細(xì)(ccRCC)的黏附能力的同時(shí)，也抑制了該細(xì)胞的增殖和侵襲；也有研究顯示，GSN過表達(dá)降低了結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖和侵襲〔10〕；GSN過表達(dá)可抑制自然殺傷(NK)細(xì)胞/T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞的增殖和侵襲〔16〕。Chen等〔17〕認(rèn)為，GSN對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖的抑制機(jī)制可能是GSN過表達(dá)發(fā)生在MCF-7細(xì)胞G0/G1期的細(xì)胞周期停滯，中止細(xì)胞周期向DNA合成(S期)的進(jìn)展所致；趙元茵等〔5〕認(rèn)為，GSN過表達(dá)對(duì)MCF-7細(xì)胞侵襲的抑制機(jī)制可能是由于雌激素介導(dǎo)的ERK活化被GSN抑制，亦或GSN上調(diào)了TIMP-3導(dǎo)致的，因?yàn)镋RK是細(xì)胞增殖的重要刺激因素，而TIMP-3是腫瘤細(xì)胞侵襲關(guān)鍵抑制因子。也有學(xué)者認(rèn)為，GSN 抑制腫瘤的作用機(jī)制可能與其調(diào)節(jié) actin微絲的長(zhǎng)度、抑制磷脂信號(hào)傳遞〔18〕、參與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期〔19〕、調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡〔20〕等相關(guān)；通過降低基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2和MMP-9的水平抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力，MMP2和MMP9被認(rèn)為是腫瘤細(xì)胞遷移的關(guān)鍵因素，MMP2和MMP9被GSN刺激后呈劑量依賴性降低〔21〕。

PI3K是一種胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶，作為細(xì)胞存活的重要調(diào)節(jié)劑，被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵因素〔22〕；AKT是一種絲氨酸/蘇氨酸特異性蛋白激酶，在多種細(xì)胞的代謝、生長(zhǎng)、增殖、存活、轉(zhuǎn)錄及蛋白質(zhì)合成等方面發(fā)揮重要作用，因此PI3K/AKT通路是同時(shí)具有磷脂酰肌醇激酶和絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路〔23〕，可參與調(diào)節(jié)多種細(xì)胞的增殖、凋亡、存活、生長(zhǎng)等生理功能，并已通過抑制細(xì)胞凋亡和促進(jìn)細(xì)胞增殖靶向許多癌癥〔24〕。有研究發(fā)現(xiàn)，GSN-PI3K-AKT信號(hào)傳導(dǎo)可能參與調(diào)節(jié)惡性腫瘤遷移和侵襲的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)〔11〕，GSN 通過抑制 PI3K/AKT信號(hào)通路，減少EMT誘導(dǎo)細(xì)胞骨架重塑，從而抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移〔25〕。

本研究結(jié)果與Guo等〔16〕的研究結(jié)果一致，GSN過表達(dá)可顯著下調(diào)了MCF-7細(xì)胞PI3K-AKT信號(hào)通路中PI3K和p-AKT蛋白的表達(dá)水平，表明GSN過表達(dá)可抑制PI3K/Akt信號(hào)通過，GSN過表達(dá)對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖和侵襲的抑制機(jī)制可能是通過抑制PI3K/AKT信號(hào)通路所致，可作為抑制乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌早期轉(zhuǎn)移的一個(gè)治療靶點(diǎn)。