夏玉婷，婁尚榮，王 巖，文夢婷，倪學文

（湖北工業(yè)大學生物工程與食品學院，湖北 武漢 430068）

近年來，隨著社會對環(huán)保和食品安全要求的日益提高，研究者們提出利用可生物降解和環(huán)境友好材料開發(fā)食品活性包裝，在保證食品質(zhì)量安全的情況下，提高食品的貨架期。各種天然生物聚合物，如蛋白（明膠、大豆分離蛋白等）、多糖（淀粉、魔芋葡甘聚糖、殼聚糖、纖維素等）等因其優(yōu)越的成膜性及可再生性被應用于食品包裝膜的開發(fā)。其中，明膠（Gelatin，Gel）是一種水溶性蛋白，成膜性好、透明度高，具有無毒、可降解和生物相容性等優(yōu)點[1]；但純明膠膜由于親水性強、阻隔性能差，缺乏抑菌和抗氧化活性，阻礙了其在食品包裝上的應用。山蒼子油（Litsea cubebaoil，LCO）主要從山蒼子鮮果中提取，具有較強的抑菌和抗氧化活性[2]。玉米醇溶蛋白（Zein）存在于玉米胚乳中，具有安全無毒、生物相容性等優(yōu)點，其氨基酸基團引起的疏水性使其在極性溶劑下能自組裝形成納米粒子[3]。前期工作已利用反溶劑沉淀法制備包載山蒼子油的醇溶蛋白納米粒子，具有較強的抑菌和抗氧化性能。

生物聚合物薄膜是添加劑的優(yōu)良載體，將功能性納米粒子添加到生物聚合物基質(zhì)中可以改善薄膜的性能[4-5]。如Sooch 等[6]向明膠中添加氧化銅納米粒子，制備的食品包裝膜具有較好的抑菌活性，提高了番茄的貨架期。Maroufi 等[7]將含有百里香酚的玉米醇溶蛋白納米粒子與明膠共混，制得具有良好抗氧化和抑菌活性的薄膜。因此，本文將以明膠、玉米醇溶蛋白和山蒼子油為基材，制備包載山蒼子油的醇溶蛋白納米粒子/明膠復合膜。研究成膜組分間的相互作用，以及不同納米粒子添加量對復合膜的微觀結(jié)構(gòu)、熱性能、機械性能、疏水性能、抑菌和抗氧化性能等的影響，以期為食品活性包裝的開發(fā)提供一定參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

明膠（Mw=1.368×105Da） 國藥集團化學試劑有限公司；玉米醇溶蛋白（Mw=2.5～4.5×104Da） 百靈威試劑有限公司；山蒼子油 江西億森源植物香料有限公司；吐溫80、Span 80（脫水山梨糖醇單油酸酯）、甘油 國藥集團化學試劑有限公司；DPPH（2,2-二苯基-1-苦基肼基） 上海麥克林生化科技有限公司；ABTS[2,2′-聯(lián)氮雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）] 上海源葉生物科技有限公司；大腸桿菌、金黃色葡萄球菌 湖北工業(yè)大學生物工程與食品學院。

DNG-9031A 烘箱 中國上海精宏有限公司；DSA25 接觸角測量儀 德國克魯斯公司；DSC-Q10差示掃描量熱儀 美國梅特勒公司；TA. XT. Plus 質(zhì)構(gòu)儀 英國SMS 公司；SC 502 掃描電子顯微鏡 日本東京日立公司；W3/031 水蒸氣透過率儀 濟南蘭光有限公司；WF-28 精密色差儀 深圳市威福光電科技有限公司；UV-2600 紫外可見分光光度計 尤尼柯（上海）儀器有限公司；VERTEX 70 傅立葉紅外光譜儀 德國布魯克有限公司；Zetasizer Nano-ZS 納米粒度儀 英國馬爾文儀器公司；FA25 高速均質(zhì)機 上海弗魯克科技發(fā)展有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 包載山蒼子油的醇溶蛋白納米粒子（NL）分散液的制備 通過反溶劑沉淀法制備NL 分散液[8]。將0.2 g Zein 溶解在10 mL 乙醇/水（85:15，v/v）中，在 25 ℃ 下攪拌 30 min 得到Zein 溶液。將 0.1 g LCO添加到Zein 溶液中，以600 r/min 攪拌1 h。將混合溶液滴加到吐溫80/水溶液（0.5:100，w/v）中，用均質(zhì)機在25 ℃下以13000 r/min 的速度剪切2 min，形成包載山蒼子油的醇溶蛋白納米粒子分散液。通過納米粒度儀測得納米粒子的粒徑為（128.3±1.1） nm。

1.2.2 膜的制備 膜的原料配比見表1，制備流程如圖1 所示。將甘油和明膠溶解在蒸餾水中，60 ℃下200 r/min 攪拌0.5 h 得到明膠溶液。將Span 80 溶解于制備好的NL 分散液中，在25 ℃以200 r/min 磁力攪拌10 min。將分散液加入到明膠溶液中制備成膜液，攪拌0.5 h，攪拌速度600 r/min。然后將成膜液倒入圓形平皿（14 cm×14 cm×15 cm），于30 ℃烘箱中干燥10 h 得到膜樣品。純明膠膜和復合膜分別記為Gel、Gel-NL20、Gel-NL30、Gel-NL40、Gel-NL50。膜樣品測試前在25±1 ℃、相對濕度50%±2%的條件下平衡48 h。

圖1 復合膜的制備流程圖Fig.1 Preparation of blend films

表1 純明膠膜和復合膜的原料配比Table 1 The formulations of gelatin film and blend films

1.2.3 顏色與透明度測定 膜的顏色測定采用色度計，以白色標準色板（L*=89.74，a*=0.04，b*=1.64）作為背景進行測量。ΔL、Δa和Δb是標準色板與膜樣品之間的顏色差異。總色差（ΔE）計算如下[9]：

膜的不透明度計算如下[10]：

式中: Abs600為600 nm 處的吸光度值；x 為膜的厚度（mm）。

采用紫外可見分光光度計在240～500 nm 的波長范圍內(nèi)掃描膜的紫外吸收光譜。

1.2.4 掃描電子顯微鏡觀察 將膜樣品（3 mm×3 mm）在1000×倍下利用掃描電子顯微鏡觀察橫截面。樣品在7.5 Pa 真空度下噴金，噴金厚度為20 nm，時間為90 s，加速電壓為30 kV。

1.2.5 紅外光譜分析 采用衰減全反射傅里葉變換紅外光譜儀對樣品進行掃描分析。掃描波長為4000～400 cm-1，共有32 次完整掃描，分辨率為4 cm-1。

1.2.6 差示掃描量熱分析 利用差示掃描量熱儀對樣品進行熱性能分析。在干燥N2的條件下，將膜樣品（約3 mg）置于梅特勒皿中。檢測溫度為30～120 ℃，升溫速率為10 ℃/min。用10.00 版STARe（Mettler Toledo, Zurich, Switzerland）進行數(shù)據(jù)分析。

1.2.7 機械性能測定 將膜裁成5 mm×50 mm 的長條。根據(jù)ASTM D882-09 的方法[11]，膜的拉伸強度（TS）和斷裂伸長率（EAB）通過質(zhì)構(gòu)儀進行測試。測試條件：初始握柄分離30 mm，十字頭移動速率為0.5 mm/s。TS 和EAB 根據(jù)以下公式計算:

式中：Fmax為膜斷裂時的力（N）; S 為膜的截面面積（mm2）; L 為膜斷裂時的最終長度（mm）; L0為膜樣品的初始長度（mm）。

1.2.8 水接觸角測定 采用接觸角測量儀測定膜的水接觸角。膜樣品（3 cm×3 cm）固定于載玻片上，置于水平移動平臺，將3 μL 蒸餾水滴在膜上，測量第30 s的水接觸角[12]。

1.2.9 水蒸氣透過率測定 采用水蒸氣透過率儀測定膜的水蒸氣透過率。根據(jù)GB/T 1037-1988 的方法[13]測試，將膜樣品裁成適合的尺寸，組裝透濕杯（裝有25 mL 蒸餾水）并放入測試室。在連續(xù)模式下設置溫度為25 ℃，相對濕度為75%。

1.2.10 抗氧化活性測定 將200 mg 膜樣品浸泡在10 mL 乙醇/水（85:15，v/v）中，得到20 mg/mL 膜樣品溶液。

1.2.10.1 DPPH 自由基清除率 取200 μL 膜樣品溶液加入到100 μL 的0.1 mmol/L DPPH 乙醇溶液中。在25 ℃條件下避光混合30 min，在517 nm 處測定吸光值。

式中：ADPPH和Afilm分別為DPPH 乙醇溶液和膜樣品在517 nm 處的吸光值。

1.2.10.2 ABTS 自由基清除率 取4 mL 7 mmol/L ABTS[2,2′-聯(lián)氮雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）]溶液加入88 μL 過硫酸鉀溶液 （140 mmol/L），混合均勻，在25 ℃下避光靜置16 h，作為儲備液。用乙醇/水（95:5，v/v）稀釋儲備液作為工作液。取100 μL 膜樣品溶液加入到100 μL 的ABTS 工作液中，在25 ℃條件下避光混合30 min，在734 nm 處測定吸光值。

式中：AABTS和Afilm分別為ABTS 乙醇溶液和膜樣品在734 nm 處的吸光值。

1.2.11 抑菌實驗 將LB 固體培養(yǎng)基（15 mL）加入培養(yǎng)皿中，待完全固化后，加入100 μL 菌懸液（約106CFU/mL）均勻涂布于表面；然后將膜樣品（直徑10 mm）放置在培養(yǎng)基表面，在37 ℃培養(yǎng)24 h。陰性對照為明膠膜，抑菌活性通過抑制圈表示。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每個實驗至少重復測定三次，結(jié)果用平均值±SD（標準差）表示。采用Origin 軟件繪圖；SPSS 軟件進行單因素方差分析，Tukey 法進行顯著性檢驗，不同字母表示具有顯著性差異（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 顏色與透明度

純明膠膜和復合膜的顏色如表2 所示。隨著NL 添加量的增大，復合膜的明度（L*）和紅度（a*）降低，黃度（b*）增加，表明復合膜顏色逐漸變黃；ΔE增加，該結(jié)果表明復合膜顏色變化增大，與NL 的添加有關(guān)。隨著NL 添加量的增大，膜的不透明度從0.37顯著增加到5.61（P＜0.05），這是由于納米粒子和LCO對光的散射或透過產(chǎn)生了干擾[14]。復合膜的透明度低，作為包裝材料能有效防止食品的光氧化和變色。由圖2 可知，純明膠膜的紫外阻隔性能最弱；隨著NL 添加量的增大，復合膜的吸光度增大，紫外光透過率降低，意味著復合膜在250～280 nm 具有良好的紫外阻隔性能。這可能是由于LCO 含有多酚類物質(zhì)，其芳香族基團對紫外吸收性能較強[15]。

表2 純明膠膜和復合膜的顏色Table 2 Color of gelatin film and blend films

圖2 純明膠膜和復合膜的紫外可見光譜圖Fig.2 UV-Vis spectra of gelatin film and blend films

2.2 微觀結(jié)構(gòu)和紅外分析

膜的截面微觀形態(tài)如圖3 所示。純明膠膜截面結(jié)構(gòu)緊湊，NL 的添加破壞了明膠基質(zhì)的原生結(jié)構(gòu)。在復合膜中，Gel-NL30 截面相對致密，可能是由于NL 和明膠之間發(fā)生了較強的相互作用；Gel-NL20和Gel-NL40 的截面出現(xiàn)大小不同的微孔洞，粗糙度增加，可能是由于較小的油滴聚集所導致的[16]。Gel-NL50 的截面最粗糙，存在不連續(xù)且部分斷裂的結(jié)構(gòu)，可能是因為納米粒子發(fā)生了聚集。膜在干燥過程中，由于乙醇溶劑的揮發(fā)比水分子快，NL 因疏水相互作用或熱誘導交聯(lián)發(fā)生聚集，形成較大的顆粒，導致膜的截面有凸起、不致密[17]。

圖3 純明膠膜和復合膜的橫截面微觀圖Fig.3 Scanning electron microscopy images of the cross section of gelatin film and blend films

膜的紅外光譜如圖4 所示。對于純明膠膜，波數(shù)3298 cm-1處的峰是-OH 基團對應的氫鍵特征峰[18]；波數(shù)2935 cm-1處對應于C-H 基團的拉伸振動；1631和1541 cm-1處的峰是C=O 和N-H 基團的拉伸振動；1450 到1236 cm-1之間的峰對應C-N 和N-H 的拉伸振動；1034 cm-1處的峰對應于甘油中O-H 拉伸振動[19]。與純明膠膜相比，復合膜光譜吸收峰從3298 cm-1移動到3285 cm-1，是由于明膠中的氫鍵和O-H 拉伸，意味著氫鍵交聯(lián)的增強[20]，明膠與NL 之間發(fā)生了氫鍵相互作用。復合膜中沒有發(fā)現(xiàn)新峰，說明明膠與NL 之間沒有形成化學鍵。此結(jié)果與Shen 等[21]向普魯蘭-明膠溶液中添加丁香精油納米乳液的研究結(jié)果類似。

圖4 純明膠膜和復合膜的紅外圖譜Fig.4 Infrared spectra of gelatin film and blend films

2.3 熱穩(wěn)定性

差示掃描量熱曲線分析反映膜材料的熱穩(wěn)定性及膜組分間的相容性。如圖5 所示，純明膠膜在87.22 ℃出現(xiàn)一個吸收峰，在此溫度下，明膠膜由玻璃態(tài)向高彈態(tài)轉(zhuǎn)變，對應的溫度為玻璃化轉(zhuǎn)變溫度（Tg）[22]，與Chen 等[23]的研究結(jié)果一致。NL、Gel-NL20、Gel-NL30、Gel-NL40 和Gel-NL50 的Tg分別為68.07、84.42、90.04、80.40 和80.41 ℃。Gel-NL30 復合膜的Tg最高，可能是由于膜中明膠和NL 之間的氫鍵相互作用最強，使得有更大的空間位阻，限制了生物聚合物的運動[19]。復合膜均表現(xiàn)出單一的Tg，表明聚合物各組分相容性良好。此現(xiàn)象與含有玉米醇溶蛋白/百里酚納米粒子的明膠膜的熱穩(wěn)定性類似[23]。

圖5 純明膠膜和復合膜的差示掃描量熱曲線Fig.5 Differential scanning calorimetry curves of gelatin film and blend films

2.4 機械性能

拉伸強度和斷裂伸長率用于表征膜的機械性能，拉伸強度越大，表明膜的外力承受性越強；斷裂伸長率越大，表明膜的延展性越好。如圖6 所示，純明膠膜的拉伸強度為（6.54±0.14） MPa，斷裂伸長率為5.13%±0.52%。當添加NL 時，復合膜的拉伸強度降低，可能與不同NL 含量下膜的微觀結(jié)構(gòu)有關(guān)。斷裂伸長率在Gel-NL30 中最大（15.61%±0.96%），之后隨著NL 添加量的增加而下降。由于復合膜的機械性能與納米粒子的形態(tài)和聚合物的性質(zhì)有關(guān)，可能是NL 在明膠基質(zhì)中起到“增塑”的作用，與初始聚合物鏈相比，增加了聚合物鏈的遷移率，從而增加斷裂伸長率[24]；而繼續(xù)增加NL 的添加量，膜中NL 聚集成大顆粒，可能對膜中分子滑移有一定的抑制作用，復合膜的延展性降低，從而降低其斷裂伸長率。

圖6 純明膠膜和復合膜的拉伸強度和斷裂伸長率Fig.6 Tensile strength and elongation at break of gelatin film and blend films

2.5 水接觸角和水蒸氣透過率（WVP）

水接觸角與WVP 值用來評估膜材料的疏水性能。水接觸角越大，WVP 值越小，表明材料的疏水性能越好。如圖7（A）所示，純明膠膜的水接觸角為39.01°，意味著其表面親水性較好。復合膜的水接觸角顯著大于純明膠膜的水接觸角（P＜0.05），表明NL的添加提高了復合膜的表面疏水性。隨著NL 添加量的增大，復合膜的水接觸角顯著增大（P＜0.05），疏水性增強，可能是由于明膠與NL 之間的氫鍵相互作用降低了明膠在膜表面可用的親水基團。如圖7（B）所示，純明膠膜的WVP 值為（16.29±0.29）×10-11g·cm/（cm2·s·Pa），與Moula 等[16]的研究結(jié)果相似。隨著NL 添加量的增大，復合膜的WVP 值呈下降趨勢，對水蒸氣的阻隔性能增強。這是由于膜中存在納米粒子，使水分子擴散通道變得曲折狹窄，傳質(zhì)效率降低[25]。研究報道，與納米粒子共混后，可以通過增加生物聚合物的結(jié)晶度或減少明膠基質(zhì)中的自由親水基團來降低水蒸氣的滲透性[26]。此外，醇溶蛋白和LCO 的疏水性增加了親水分子的傳質(zhì)阻力。

2.6 抗氧化性能

本實驗采用DPPH 和ABTS 自由基清除法來評價膜的抗氧化性能。由圖8 可知，純明膠膜對DPPH 和ABTS 自由基的清除率分別為10.07%±2.13%和27.23%±1.62%，抗氧化活性較差，可能歸因于明膠肽的抗氧化特性[27]。隨著NL 添加量的增大，復合膜對兩種自由基的清除率顯著增大（P＜0.05），抗氧化活性增強，主要是由于NL 中的LCO 含有檸檬醛、萜類等多種生物活性化合物，協(xié)同作用后具有較高的抗氧化活性[28]。Gel-NL50 復合膜對DPPH和ABTS 的清除率最大，分別為44.53%±3.05%和78.30%±1.47%。與Roy 等[29]研究發(fā)現(xiàn)明膠/瓊脂基復合膜的抗氧化活性隨著丁香精油含量的增加而增強的結(jié)果相似。

2.7 抑菌性能

食源性致病菌是影響食品質(zhì)量和安全的重要因素，因此復合膜的抑菌性能很重要。純明膠膜對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均無抑菌活性，復合膜對兩種菌表現(xiàn)出抑菌活性（圖9）。Wang 等[30]利用氣相色譜-質(zhì)譜技術(shù)對LCO 分析，發(fā)現(xiàn)檸檬醛（63.75%）和檸檬烯（7.38%）是LCO 的主要成分。檸檬醛具有很強的抑菌活性，由于其具有親脂性，能穿透并破壞細菌的內(nèi)膜和外膜[2]。由表3 可知，Gel-NL20、Gel-NL30 和Gel-NL40 對大腸桿菌的抑菌效果無顯著差異（抑菌圈直徑9.17～9.45 mm，P＞0.05），對金黃色葡萄球菌的抑菌效果也無顯著差異（抑菌圈直徑10.02～10.35 mm，P＞0.05）。Gel-NL50 對兩種菌的抑菌效果顯著高于其它膜（P＜0.05），其對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑分別為（10.00±0.20）mm和（11.10±0.12）mm。復合膜的抑菌活性不僅與NL的濃度有關(guān)，還取決于菌種的類型。與大腸桿菌相比，復合膜對金黃色葡萄球菌的抑制作用較強，可能是革蘭氏陽性菌細胞膜中的脂磷壁酸有助于LCO的滲透，而革蘭氏陰性菌固有的外源性膜限制了LCO通過脂多糖層的擴散[31]。

表3 純明膠膜和復合膜的抑菌活性Table 3 Antibacterial activity of gelatin film and blend films

圖9 純明膠膜和復合膜對大腸桿菌（A）和金黃色葡萄球菌（B）的抑菌效果Fig.9 Antibacterial effect of gelatin film and blend films on Escherichia coli (A) and Staphylococcus aureus (B)

3 結(jié)論

本文研究了不同NL 添加量對明膠基復合膜結(jié)構(gòu)與性能的影響。結(jié)果表明，明膠中添加NL 后，仍具有較好的成膜性；隨著NL 添加量的增大，復合膜的紫外阻隔性能和抗氧化性能增強，水接觸角增大，水蒸氣透過率降低；復合膜對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有明顯的抑制作用；其中Gel-NL30 復合膜的截面最致密，斷裂伸長率最大（15.61%±0.96%），玻璃化轉(zhuǎn)變溫度（Tg）最高（90.04 ℃），這可能與NL 和明膠之間相容性良好以及在成膜過程中形成氫鍵有關(guān)。綜上，Gel-NL30 的理化性能最佳，可作為一種食品活性包裝材料。后續(xù)關(guān)于復合膜的成膜機理、活性成分緩釋以及在食品保鮮中的應用效果評價還需要進一步的研究。