胡 婷，耿 勤，付 敏，陳 軍，何雪梅，孫 健，戴濤濤,*

（1.南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047；2.廣西果蔬貯藏與加工新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530007）

甜菜苷（Betanin，BT）是一種天然含氮的水溶性色素，呈現(xiàn)玫瑰紅至紫紅色[1]。廣泛分布于仙人掌科、陸商科、莧科等多種植物中，因最早在甜菜根中被發(fā)現(xiàn)而得名。甜菜苷是一類可食用天然色素，被批準(zhǔn)用于食品和藥品中的紅色著色劑[2]。甜菜苷作為一種天然產(chǎn)物，具有抗氧化、抗癌、抗炎癥、降血壓、降血脂等多種益于人體健康的生物活性[3]。與花青素相比，甜菜苷能在富含維生素C 和低酸性環(huán)境下維持穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)和色澤[4]，具有非常廣闊的應(yīng)用前景。然而，溫度、pH、氧氣等多種因素會(huì)促進(jìn)甜菜苷的降解，使其從艷麗的紫紅色褪為淺黃色，其抗氧化性等活性也隨之下降。高溫作為影響甜菜苷穩(wěn)定性的最大因素，在食品加工工業(yè)中極大地限制了甜菜苷的應(yīng)用。因此，尋找一種合適的保護(hù)方法至關(guān)重要。

蛋白質(zhì)作為一種公認(rèn)安全的可食用載體，因具有豐富營(yíng)養(yǎng)和良好功能特性而廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)中[5]，可以與多種生物活性物質(zhì)發(fā)生相互作用，形成復(fù)合物并擴(kuò)大生物活性物質(zhì)在食品工業(yè)中的應(yīng)用范圍。乳清蛋白是一種優(yōu)質(zhì)的動(dòng)物全價(jià)蛋白質(zhì)，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，容易消化吸收，具有多種人體必需的氨基酸[6]，有優(yōu)良的溶解性、乳化性、起泡性等，在食品領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。乳清蛋白是指牛乳在pH4.6 時(shí)酪蛋白沉淀后的可溶性蛋白的總稱，占乳蛋白的18%～20%[7]。乳清分離蛋白（Whey protein isolate, WPI）是將蛋白質(zhì)含量純化至90%以上的乳清蛋白粉末。

目前有大量的研究表明，蛋白質(zhì)能與小分子發(fā)生相互作用，形成復(fù)合物，對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生影響并保護(hù)小分子的活性。蛋白質(zhì)與甜菜苷相互作用的研究雖不多，卻為提高甜菜苷的穩(wěn)定性提供了良好的思路。大豆蛋白纖維被證明能與甜菜苷通過(guò)疏水相互作用形成聚集體，并提高甜菜苷的熱穩(wěn)定性[8]；11S 藜麥種子蛋白與甜菜苷結(jié)合并作為甜菜苷的負(fù)載體，能減少甜菜苷與氧和光的接觸，從而提高甜菜苷的穩(wěn)定性[9]。由此可見(jiàn)，蛋白可能是一類較好的主體生物聚合物，能與甜菜苷發(fā)生相互作用，從而提高甜菜苷穩(wěn)定性。然而，目前關(guān)于蛋白與甜菜苷相互作用機(jī)制的研究較少，且蛋白質(zhì)提高甜菜苷穩(wěn)定性的機(jī)理尚不明確。因此，為探明甜菜苷與蛋白質(zhì)的相互作用機(jī)制及對(duì)甜菜苷穩(wěn)定性的影響，本研究以乳清分離蛋白和甜菜苷為研究對(duì)象，明確乳清分離蛋白對(duì)甜菜苷熱穩(wěn)定的影響以及甜菜苷對(duì)蛋白內(nèi)源熒光、表面疏水性、二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響，并采用多光譜學(xué)結(jié)合分子模擬的方法探究乳清分離蛋白與甜菜苷的相互作用機(jī)制，為色素穩(wěn)定的研究及功能性蛋白色素復(fù)合物的應(yīng)用開(kāi)發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

乳清分離蛋白（WPI，Hilmar 9410，純度＞90%）美國(guó)Hilmar 公司；甜菜苷（用糊精稀釋的紅甜菜根的提取物，CAS：S26010-25g） 上海源葉生物科技有限公司；8-苯胺-1-萘磺酸鹽（ANS） 美國(guó)Sigma公司；PBS 磷酸鹽緩沖液 北京索萊寶科技有限公司。

UV-2450 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 日本Shimadzu公司；F-7000 型熒光光度計(jì) 日本Hitachi 公司；MOS-450 型圓二色譜儀 法國(guó)Bio-Logic 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 乳清分離蛋白-甜菜苷復(fù)合物的制備 乳清分離蛋白粉末溶于10 mmol/L PBS 緩沖液（pH7.0），過(guò)夜攪拌以使蛋白質(zhì)充分水合，在4 ℃下保存。甜菜苷溶于10 mmol/L PBS 緩沖液（pH7.0），現(xiàn)配現(xiàn)用。復(fù)合物的制備方法在Huang 等[10]的基礎(chǔ)上稍作修改。乳清分離蛋白溶液與甜菜苷溶液按一定比例混合，磁力攪拌30 min，形成乳清分離蛋白-甜菜苷混合液。

1.2.2 濁度的測(cè)定 采用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在600 nm 處測(cè)量WPI-Betanin 混合液的濁度，以相應(yīng)濃度的甜菜苷水溶液作為空白，通過(guò)宏觀濁度的比較初步判定復(fù)合物的形成[11]。乳清分離蛋白的終濃度為20 mg/mL，乳清分離蛋白與甜菜苷的質(zhì)量比分別為16:0、16:1、16:2、16:4、16:8。

1.2.3 紫外光譜測(cè)定 采用紫外光譜測(cè)定WPIBetanin 體系的紫外吸收，實(shí)驗(yàn)方法在Cai 等[12]的方法上稍作修改，將1.6 mg/mL 乳清分離蛋白母液與0.4 mg/mL 甜菜苷母液按不同比例配制成具有不同甜菜苷含量的WPI-Betanin 混合體系，使得體系中蛋白濃度為0.8 mg/mL、甜菜苷濃度為0.05、0.1、0.2 mg/mL。掃描WPI-Betanin 混合體系在250～345 nm 的紫外圖譜，以甜菜苷水溶液的紫外吸收為空白，并予以扣除。

1.2.4 內(nèi)源熒光光譜測(cè)定 采用F-7000 熒光光譜儀測(cè)定WPI-Betanin 混合體系的內(nèi)源熒光。熒光光譜測(cè)量方法根據(jù)前人的研究方法[13]有所改動(dòng)。將1.6 mg/mL 乳清分離蛋白母液與0.4 mg/mL 甜菜苷母液按不同比例配制成具有不同甜菜苷含量的WPI-Betanin 混合體系，使得體系中蛋白濃度為0.8 mg/mL、甜菜苷濃度為0.025、0.05、0.075、0.1、0.125、0.15、0.175、0.2 mg/mL。在298、304、310 K溫度條件下，測(cè)定WPI-Betanin 混合體系的內(nèi)源熒光，激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫波長(zhǎng)均為2.5 nm，在290～480 nm 處收集熒光發(fā)射光譜，掃描前分別在298、304、310 K 溫度條件下水浴30 min。

內(nèi)源熒光猝滅數(shù)據(jù)采用Stern-Volmer 方程（1）分析，WPI-Betanin 復(fù)合物的結(jié)合常數(shù)與結(jié)合位點(diǎn)通過(guò)雙對(duì)數(shù)方程（2）計(jì)算，采用Van’t Hoff 方程（3）和方程（4）計(jì)算WPI-Betanin 復(fù)合物結(jié)合過(guò)程中的焓變（ΔH），熵變（ΔS）和吉布斯自由能變化（ΔG），進(jìn)一步推斷復(fù)合物的相互作用機(jī)制[14]。

式中：F0：乳清分離蛋白起始內(nèi)源熒光；Fc：添加甜菜苷之后的內(nèi)源熒光；[BT]：甜菜苷濃度；KSV：Stern-Volmer 猝滅常數(shù)；Kq：乳清分離蛋白猝滅速率；τ0：生物大分子猝滅平均壽命6.2×10-9s[15]。

式中：Ka：結(jié)合常數(shù)；通用氣體常數(shù)R=8.314 J·mol-1·K-1；反應(yīng)溫度T=298、304、310 K。

1.2.5 表面疏水性的測(cè)定 采用F-7000 熒光光度計(jì)，以8-苯胺-1-萘磺酸鹽（ANS）為熒光探針測(cè)定表面疏水性[16]，激發(fā)波長(zhǎng)為390 nm，激發(fā)狹縫寬度為2.5 nm，發(fā)射狹縫寬度為5.0 nm。將16 μL 8 mmol/L ANS 添加到3.2 mL WPI-Betanin 混合溶液（蛋白濃度為0.8 mg/mL，甜菜苷濃度分別為0.025、0.05、0.075、0.1、0.125、0.15、0.175、0.2 mg/mL）中。相應(yīng)的甜菜苷的背景熒光被扣除以矯正熒光數(shù)據(jù)，以ANS 熒光強(qiáng)度來(lái)表示乳清分離蛋白的表面疏水性[17]。

1.2.6 圓二色譜的測(cè)定 采用圓二色譜儀測(cè)定WPIBetanin 復(fù)合體系的遠(yuǎn)紫外圓二色譜。在乳清分離蛋白濃度為0.8 mg/mL，甜菜苷濃度分別為0 （對(duì)照組）、0.1、0.2 mg/mL 時(shí)，測(cè)定乳清分離蛋白在200～240 nm下的遠(yuǎn)紫外吸收?？鄢鄳?yīng)濃度的甜菜苷背景后，根據(jù)DICHROWEB CONTIN 在線的方法計(jì)算乳清分離蛋白的α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角、無(wú)規(guī)則卷曲含量變化[18]。

1.2.7 分子對(duì)接模擬 采用Discovery Studio 2019軟件中的CDOCKER 程序進(jìn)行分子對(duì)接可視化地研究乳清分離蛋白與甜菜苷的相互作用。CDOCKER程序是Discovery Studio 中的一種半柔性分子對(duì)接分析方法。從PDB 數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取了包括β-乳球蛋白（PDB: 3NPO）、α-乳白蛋白（PDB: 1HFZ）、牛血清白蛋白（PDB: 3V03）和乳鐵蛋白（PDB: 1BLF）在內(nèi)的乳清分離蛋白的主要蛋白結(jié)構(gòu)，從PubChem 數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得甜菜苷分子結(jié)構(gòu)。然后將甜菜苷結(jié)構(gòu)及以上四種蛋白結(jié)構(gòu)導(dǎo)入分子對(duì)接軟件中，受體蛋白與配體甜菜苷賦予CHARMm 力場(chǎng)，采用CDOCKER 程序進(jìn)行分子對(duì)接。在2000 步的加熱程序下將WPIBetanin 加熱至700 K，然后在5000 步的降溫程序下將WPI-甜菜苷降溫至298 K。保存最多10 個(gè)對(duì)接結(jié)果，對(duì)接的聚類半徑為0.5 ?。選擇CDOCKER相互作用能（CDOCKER interaction energy）最低的對(duì)接結(jié)果為最優(yōu)構(gòu)象，進(jìn)行相互作用分析。

1.2.8 乳清分離蛋白對(duì)甜菜苷的保護(hù)作用 為了便于觀察蛋白質(zhì)對(duì)甜菜苷的熱保護(hù)效果，從宏觀上體現(xiàn)乳清分離蛋白-甜菜苷復(fù)合物在加熱過(guò)程中的顏色變化，本部分采用較高濃度的乳清分離蛋白與甜菜苷進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。分別制備WPI 終濃度為5、10 mg/mL，甜菜苷終濃度為5 mg/mL 的WPI-Betanin 復(fù)合物，使體系中WPI 與甜菜苷的質(zhì)量比分別為1:1 和2:1。甜菜苷溶于PBS 緩沖液作為對(duì)照組。三組溶液在避光條件下80 °C 水浴加熱60 min。此后，將樣品放入冰水中冷卻，然后在設(shè)定的時(shí)間（0、10、30、60 min）進(jìn)行表征。WPI-Betanin 混合體系中甜菜苷含量的測(cè)量方法在Liu 等[19]的基礎(chǔ)上略加改動(dòng)，將樣品以2500 g（8000 r/min）離心30 min 后使用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定甜菜苷的濃度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線法在538 nm 處測(cè)定甜菜苷含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)均重復(fù)三次或以上，采用SPSS 25.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的計(jì)算整理和統(tǒng)計(jì)分析，使用Origin 2021 軟件繪圖。試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均數(shù)±平均偏差表示，P＜0.05 代表樣品間存在顯著性差異，在圖中用不同字母表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳清分離蛋白-甜菜苷復(fù)合物的形成

通過(guò)使用紫外可見(jiàn)光譜法測(cè)量濁度來(lái)驗(yàn)證WPI-Betanin 復(fù)合物的形成。當(dāng)由光波的散射而形成膠體粒子時(shí)，溶液的濁度會(huì)增加。濁度增加的幅度取決于顆粒的數(shù)量、大小和折射率對(duì)比度等。因此，濁度的測(cè)量可以快速指示膠態(tài)顆粒的形成[20]。圖1顯示了乳清分離蛋白：甜菜苷質(zhì)量比對(duì)乳清分離蛋白-甜菜苷溶液的外觀和濁度的影響。當(dāng)乳清分離蛋白與甜菜苷的比例從16:0 增加至16:8 時(shí)，濁度從0.290 顯著提高至0.306 cm-1（P＜0.05），從外觀上看，溶液變得越來(lái)越混濁，但在室溫下儲(chǔ)存一天之后，也并沒(méi)有沉淀跡象。這些結(jié)果表明乳清分離蛋白與甜菜苷形成了相對(duì)較小的膠體復(fù)合物，具有較強(qiáng)的抗重力沉淀能力。

圖1 不同比例甜菜苷對(duì)乳清分離蛋白濁度的影響Fig.1 Effect of different proportions of betanin on turbidity of WPI

2.2 紫外光譜

蛋白質(zhì)分子微環(huán)境中芳香族氨基酸殘基的變化可能會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)的紫外吸收發(fā)生變化，因此可以應(yīng)用蛋白質(zhì)的紫外光譜來(lái)分析蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)變化。紫外光譜可反映乳清分離蛋白與甜菜苷間的相互作用，表現(xiàn)為紫外光譜峰值的藍(lán)移或紅移、信號(hào)的增強(qiáng)或減弱。圖2 中顯示乳清分離蛋白在280 nm 處有最大吸收峰，此處的吸收可能是由于色氨酸（Trp）和酪氨酸（Tyr）存在C=O 鍵的紫外吸收[12]。乳清分離蛋白的紫外吸收隨著甜菜苷濃度的增加而增加，進(jìn)一步證明乳清分離蛋白與甜菜苷發(fā)生了相互作用，改變了色氨酸和酪氨酸的微環(huán)境[13]。吳云雪等[21]觀察到了類似的現(xiàn)象，表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（EGCG）與乳清分離蛋白發(fā)生相互作用，蛋白的紫外吸收隨著EGCG 含量的增加而增加。

圖2 不同濃度甜菜苷對(duì)乳清分離蛋白紫外吸收的影響Fig.2 Ultraviolet spectra of WPI treated by betanin with different betanin concentrations

2.3 熒光發(fā)射光譜

于280 nm 的激發(fā)波長(zhǎng)，測(cè)定了0.6～1.2 mg/mL乳清分離蛋白的內(nèi)源熒光強(qiáng)度。從圖3A 可得知，乳清分離蛋白在0.6～1.2 mg/mL 的濃度范圍內(nèi)蛋白的熒光強(qiáng)度隨其濃度呈現(xiàn)先增后減的關(guān)系，且分為兩段線性關(guān)系，最大值位于0.9 mg/mL，因此選擇了0.8 mg/mL 的蛋白濃度進(jìn)行內(nèi)源熒光實(shí)驗(yàn)，該濃度可以避免蛋白濃度過(guò)高而引起的內(nèi)濾效應(yīng)，提高實(shí)驗(yàn)精度。圖3B～D 顯示了在298、304、310 K 溫度下，不同濃度甜菜苷對(duì)乳清分離蛋白內(nèi)源熒光的猝滅效果。乳清分離蛋白的色氨酸在280 nm 的激發(fā)波長(zhǎng)下在332 nm 處有最大的熒光發(fā)射峰，熒光強(qiáng)度隨著甜菜苷濃度的增加而不斷下降，表明甜菜苷對(duì)乳清分離蛋白有熒光猝滅效果。此外，由圖2 中可知，甜菜苷在0.2 mg/mL 濃度下，其紫外吸收非常低，（A280+A332）/2＜0.1，這表明甜菜苷對(duì)乳清分離蛋白幾乎不產(chǎn)生內(nèi)濾效應(yīng)[16]，這個(gè)熒光強(qiáng)度的下降可能是由于甜菜苷與乳清分離蛋白發(fā)生了相互作用并形成復(fù)合物，改變了乳清分離蛋白中酪氨酸和色氨酸的微環(huán)境。類似的現(xiàn)象也出現(xiàn)在一些多酚與乳清分離蛋白的相互作用中，咖啡酸（CA）、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（EGCG）與乳清分離蛋白通過(guò)非共價(jià)相互作用結(jié)合，猝滅了乳清分離蛋白的內(nèi)源熒光[22]。

圖3 不同濃度乳清分離蛋白的熒光強(qiáng)度和不同濃度甜菜苷對(duì)乳清分離蛋白的熒光猝滅Fig.3 Fluorescence intensity of WPI at different concentrations and fluorescence quenching of WPI at different concentrations of betanin

2.4 熒光猝滅機(jī)制及結(jié)合參數(shù)

如圖4 所示，在298、304、310 K 溫度下，Stern-Volmer 方程具有良好的擬合性，表明甜菜苷猝滅為動(dòng)態(tài)或靜態(tài)單一猝滅類型[23]。由表1 可知，在298、304、310 K 溫度下，WPI-Betanin 的猝滅常數(shù)分別為2.06×102·mol-1、2.26×102·mol-1和2.58×102·mol-1。最小的猝滅速率常數(shù)Kq（Kq=KSV/τ0）為3.32×1010L·mol-1·s-1明顯大于各類猝滅劑對(duì)生物大分子的最大動(dòng)態(tài)猝滅速率2.0×1010L· mol-1·s-1，表明甜菜苷猝滅乳清分離蛋白內(nèi)源熒光的機(jī)制為靜態(tài)猝滅過(guò)程[24]。對(duì)于靜態(tài)猝滅過(guò)程，可以采用雙對(duì)數(shù)方程（2）計(jì)算乳清分離蛋白與甜菜苷之間的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)。從表1中可知，在不同溫度下甜菜苷與乳清分離蛋白的結(jié)合常數(shù)分別為1783.16 L/mol （298 K）、672.59 L/mol（304 K）、259.81 L/mol（310 K），結(jié)合常數(shù)隨溫度的升高而明顯降低，說(shuō)明溫度對(duì)乳清分離蛋白-甜菜苷相互作用的影響比較大，溫度較低時(shí)結(jié)合得越緊密，這可能是因?yàn)榛钚孕》肿犹鸩塑諏?duì)高溫較敏感。溫度對(duì)結(jié)合位點(diǎn)數(shù)幾乎沒(méi)有影響，三種溫度下的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)均接近1，表明乳清分離蛋白與甜菜苷以1:1 的比例復(fù)合。

圖4 乳清分離蛋白-甜菜苷在298、304、310 K 溫度下Stern-Volmer 擬合（A）和靜態(tài)猝滅方程的擬合（B）Fig.4 Stern-Volmer fitting (A) and static quenching equation fitting (B) at 298, 304 and 310 K for WPI and betanin

相互作用的Van’t Hoff 方程為Y=14827.67X-42.27（R2=0.99），熱力學(xué)參數(shù)ΔH 和ΔS 可由方程的斜率和截距得出。蛋白質(zhì)與活性小分子之間常常通過(guò)靜電作用力、疏水作用力、氫鍵和范德華力等非共價(jià)相互作用結(jié)合成復(fù)合物[25]。根據(jù)熱力學(xué)參數(shù)的不同，可判斷二者結(jié)合的作用力類型。蛋白質(zhì)與小分子結(jié)合時(shí)，若ΔH＞0 及ΔS＞0 時(shí)，主要表現(xiàn)為疏水作用；若ΔH＜0 及ΔS＞0，主要表現(xiàn)為靜電作用；ΔH＜0 及ΔS＜0，主要表現(xiàn)為氫鍵或范德華力作用[26]。由表1可知，ΔG 為負(fù)值表明WPI-Betanin 復(fù)合物為自發(fā)結(jié)合的過(guò)程，ΔH 和ΔS 均為負(fù)值表明WPI-Betanin 復(fù)合物的形成為焓驅(qū)動(dòng)反應(yīng)，且主要相互作用為范德華力和氫鍵相互作用。

表1 乳清分離蛋白與甜菜苷的結(jié)合參數(shù)Table 1 Binding parameters of WPI and betanin

2.5 表面疏水性

疏水基團(tuán)指示著蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)，利用ANS熒光探針探究乳清分離蛋白與不同濃度甜菜苷結(jié)合后表面疏水性的變化。由圖5 所示，乳清分離蛋白的表面疏水性隨著甜菜苷含量的增加而逐漸降低。表面疏水性的降低可能是由于從甜菜苷引入了極性基團(tuán)（羧基和羥基）所致[27]。此外，甜菜苷與蛋白質(zhì)表面上的疏水性氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)（尤其是芳香環(huán)）結(jié)合導(dǎo)致熒光探針ANS 可檢測(cè)的表面疏水性基團(tuán)減少，這兩個(gè)因素都會(huì)導(dǎo)致疏水性降低。表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（EGCG）也被觀察到能使乳清蛋白的表面疏水性降低，并在240 μmol/g 的EGCG 濃度下降低50%[28]。

圖5 不同濃度甜菜苷對(duì)乳清分離蛋白表面疏水性的影響Fig.5 Effect of different concentrations of betanin on surface hydrophobicity of WPI

2.6 圓二色譜

圓二色譜主要反映蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化。圖6 顯示，乳清分離蛋白的圓二色譜在216 nm 附近顯示了一個(gè)負(fù)峰，這是二級(jí)結(jié)構(gòu)β-折疊的特征峰。如表2 所示，在不存在甜菜苷的情況下，乳清分離蛋白含有12.5%的α-螺旋，31.1%的β-折疊，24.4%的β-轉(zhuǎn)角和31.9%的無(wú)規(guī)則卷曲，隨著甜菜苷濃度的增加，α-螺旋含量和β-轉(zhuǎn)角含量分別降至10.1%和23.8%，而β-折疊含量增加至34.2%。由此可推斷出，乳清分離蛋白與甜菜苷之間的相互作用可能導(dǎo)致了蛋白質(zhì)多肽鏈的部分解折疊，并破壞了用于穩(wěn)定螺旋結(jié)構(gòu)的氫鍵，使得蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)變得更加松散[29]。花青素與乳清蛋白相互作用也有類似的現(xiàn)象，乳清蛋白與紫薯粉花青素結(jié)合后，α-螺旋含量從20.8%下降到13.4%，花青素分子在乳清蛋白的α-螺旋區(qū)域結(jié)合，破壞了穩(wěn)定螺旋結(jié)構(gòu)的氫鍵[30]。

圖6 不同濃度甜菜苷對(duì)乳清分離蛋白圓二色譜的影響Fig.6 Effect of different concentrations of betanin on circular dichroism spectrum of WPI

表2 不同濃度甜菜苷對(duì)乳清分離蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響Table 2 Effects of different concentrations of betanin on secondary structure of WPI

2.7 分子模擬

為了進(jìn)一步研究乳清分離蛋白與甜菜苷之間相互作用的位置，采用CDOCHER 分子對(duì)接可視化地進(jìn)行對(duì)接模擬。如圖7 所示，甜菜苷分別與乳清分離蛋白的主要成分α-乳白蛋白（1NFZ）、牛血清蛋白（3VO3）、乳鐵蛋白（1BLF）和β-乳球蛋白（3NPO）對(duì)接，甜菜苷被WPI 包裹在內(nèi)部。α-乳白蛋白（1HFZ）的His 107、 Asn 102、 He 101、 Asp 97 與甜菜苷通過(guò)氫鍵相互作用結(jié)合，且Asn 102 與甜菜苷形成了多個(gè)氫鍵（2.22 ?、5.73 ?、2.32 ?），Lys 108 與甜菜苷有靜電相互作用；牛血清蛋白（3V03）與甜菜苷主要通過(guò)氫鍵相互作用結(jié)合（Arg 435、Glu 186、 Lys 431、Arg 144、Leu 112、 Asp 111）；乳鐵蛋白（1BLF）的Ser 185、 His 253、Glu 187、Pro 188 與甜菜苷形成氫鍵，Asp 197、 Glu 15、 Lys 197 通過(guò)靜電相互作用與甜菜苷結(jié)合；β-乳球蛋白（3NPO）主要通過(guò)氫鍵（Gln 120、Pro 38）和靜電相互作用（Phe 105）與甜菜苷結(jié)合?？傮w而言，四種蛋白質(zhì)與甜菜苷結(jié)合以氫鍵相互作用為主，與圓二色譜數(shù)據(jù)結(jié)合，可推斷甜菜苷被包裹在蛋白質(zhì)中，與乳清分離蛋白中α-螺旋結(jié)構(gòu)中的氨基酸發(fā)生了大量的氫鍵相互作用，從而破壞了蛋白質(zhì)α-螺旋中原有的氫鍵，降低了α-螺旋的含量。

圖7 甜菜苷分別與（A）α-乳白蛋白（1NFZ）、（B）牛血清蛋白（3VO3）、（C）乳鐵蛋白（1BLF）、（D）β-乳球蛋白（3NPO）的分子對(duì)接圖Fig.7 Molecular docking of betanin with (A) α-lactalbumin (1NFZ), (B) bovine serum protein (3VO3),(C) lactoferrin (1BLF), and (D) β -lactoglobulin (3NPO)

2.8 乳清分離蛋白對(duì)甜菜苷的保護(hù)作用

蛋白質(zhì)分子可以與小分子物質(zhì)通過(guò)自組裝形成納米運(yùn)載體，以封裝和保護(hù)某些活性物質(zhì)，或改善產(chǎn)品的穩(wěn)定性和外觀[31]。如圖8 所示，與乳清分離蛋白形成復(fù)合物后，甜菜苷在80 ℃下的保留率提高，且隨著乳清分離蛋白比例的增加而增加。加熱1 h后，甜菜苷水溶液（對(duì)照組）中的甜菜苷保留率僅為6.17%，而乳清分離蛋白與甜菜苷1:1 復(fù)合后，保留率增加到18.78%，二者2:1 復(fù)合時(shí)，甜菜苷保留率為27.26%。表明在高溫條件下，乳清分離蛋白對(duì)甜菜苷有一定的保護(hù)作用，且該保護(hù)作用依賴于蛋白質(zhì)含量。結(jié)合前文相互作用及分子模擬的研究結(jié)果，推斷該保護(hù)作用可能歸因于甜菜苷被乳清分離蛋白包裹在內(nèi)部，與蛋白中氨基酸發(fā)生了大量的非共價(jià)相互作用，在一定程度上避免了甜菜苷的熱降解。

圖8 WPI-Betanin 復(fù)合物加熱過(guò)程中甜菜苷保留率的變化Fig.8 Change of retention rate of betanin in WPI-Betanin complex during heating

3 結(jié)論

本文通過(guò)多光譜學(xué)和分子模擬技術(shù)研究了乳清分離蛋白與甜菜苷的相互作用，并探討了乳清分離蛋白對(duì)甜菜苷的熱穩(wěn)定性影響及甜菜苷對(duì)乳清分離蛋白結(jié)構(gòu)性質(zhì)的影響。結(jié)果表明乳清分離蛋白對(duì)甜菜苷熱穩(wěn)定性的提高具有顯著性影響，使甜菜苷在80 ℃下加熱1 h 的保留率從6.17%提高到27.26%，穩(wěn)定性的提高與乳清分離蛋白-甜菜苷復(fù)合物的形成有關(guān)。乳清分離蛋白與甜菜苷通過(guò)范德華力和氫鍵發(fā)生相互作用以1:1 的比例形成復(fù)合物，從而提升甜菜苷的熱穩(wěn)定性。同時(shí)，甜菜苷的加入使乳清分離蛋白表面疏水性降低，α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角的含量降低，β-折疊和無(wú)規(guī)卷曲的含量增加。本文深入探究了甜菜苷與乳清分離蛋白的相互作用，對(duì)于甜菜苷的保護(hù)、運(yùn)載等方面的研究提供了思路，為功能性蛋白色素復(fù)合物的應(yīng)用開(kāi)發(fā)提供了理論基礎(chǔ)。