林雨潔 劉 紅 李宏宇 王 凱 王 鈺

長治醫(yī)學院附屬和平醫(yī)院，山西 長治 046000

大腦皮質(zhì)的發(fā)育是一個極其復雜的過程，Notch信號通路在進化上非常保守，是哺乳動物皮層神經(jīng)元數(shù)量的決定因素，可促進人類皮質(zhì)祖細胞的自我更新并阻止分化，決定了神經(jīng)前體細胞增殖和神經(jīng)元分化的時間和持續(xù)時間。Notch 信號通路中某一關(guān)鍵分子突變，都有可能導致一系列的神經(jīng)系統(tǒng)疾病。NOTCH2NL 作為Notch 信號和神經(jīng)發(fā)生的特異性修飾物，可通過細胞自主激活Notch途徑擴大人類皮質(zhì)祖細胞并增加其在克隆水平上的神經(jīng)元輸出，從而參與人類大腦皮質(zhì)的進化。NOTCH2NL基因具有4 種 同 源 基 因：NOTCH2NLA、NOTCH2NLB 和NOTCH2NLC 位于1q21.1 位點，NOTCH2NLR（14%的人缺乏），每個NOTCH2NL 基因大于100 kb 的基因組區(qū)域與NOTCH2 序列同源性＞99.1%，NOTCH2NL的各個拷貝在chr 著絲粒的兩側(cè)以串聯(lián)重復的形式分布，且在人類皮質(zhì)祖細胞中高度表達。NOTCH2NL基因的缺失和復制與神經(jīng)發(fā)育表型有關(guān)，1q21.1 位點基因組穩(wěn)定性的喪失，會導致神經(jīng)發(fā)育障礙。NOTCH2NLC 基因于2018 年才被首次發(fā)現(xiàn)，但其致病性和功能尚未清楚，直到發(fā)現(xiàn)其與神經(jīng)元包涵體病密切相關(guān)，其致病機制才逐漸被認識。隨后，陸續(xù)的一些研究發(fā)現(xiàn)NOTCH2NLC 基因5’非翻譯區(qū)GGC的重復擴增與許多神經(jīng)退行性疾病均相關(guān)，如神經(jīng)元包涵體病、阿爾茨海默病、額顳葉癡呆、特發(fā)性震顫、帕金森病、成人腦白質(zhì)病變及多系統(tǒng)萎縮等。這些神經(jīng)退行性疾病重疊，可能具有共同的病因。因此，對NOTCH2NL 以及NOTCH2NLC 基因5’非翻譯區(qū)GGC 的重復擴增在神經(jīng)變性疾病中的作用機制進行研究，從而可以找到其共同的聯(lián)系，并揭示為何相似的基因突變卻導致不同疾病的原因，有助于尋找針對這些疾病的新藥，提供新的治療方案。

1 Notch信號通路

Notch 信號通路是一個進化上非常保守的信號傳導系統(tǒng)，由Notch 受體、Notch 配體、靶基因和DNA轉(zhuǎn)錄因子等組成。Notch 廣泛表達于從無脊椎動物到脊椎動物等多個物種。Notch 信號通路通過受體與配體間相互作用來精確調(diào)控各譜系細胞及組織的分化。Notch受體能夠轉(zhuǎn)導細胞信號，參與細胞生命活動。Notch受體與不同的配體相互作用，參加細胞的一系列形態(tài)發(fā)展，包括增殖、分化，決定了神經(jīng)前體細胞增殖和神經(jīng)元分化的時間和持續(xù)時間，影響突觸可塑性與神經(jīng)元衰老［1］。Notch信號通路的作用途徑直接從細胞膜到細胞核，特異性極強，其信號通路中某一關(guān)鍵分子突變，都有可能導致一系列的神經(jīng)系統(tǒng)疾病。Notch 信號的組成部分在大腦中表達和活躍，是成人神經(jīng)干細胞的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，也在調(diào)節(jié)未成熟和成熟神經(jīng)元的遷移、形態(tài)、突觸可塑性和生存方面發(fā)揮作用，對大腦發(fā)育至關(guān)重要。近年來，Notch 信號傳導已被證明在一些神經(jīng)疾病中在幾種神經(jīng)退行性疾病模型動物中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，并在介導幾種環(huán)境因素的神經(jīng)毒性中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用［2］。

2 NOTCH2NL激活NOTCH信號通路的機制

NOTCH2NL 是NOTCH2 的一個重要家族，通過Notch途徑促進自我更新，最終增加人類皮質(zhì)祖細胞的神經(jīng)元輸出，引起人類新皮質(zhì)的快速進化。功能分析表明，NOTCH2NL可通過細胞自主激活Notch通路，在克隆水平上擴增人類皮質(zhì)祖細胞，增加其神經(jīng)元產(chǎn)量［3］。Notch 是一個跨膜受體家族，由哺乳動物中的Delta 樣（Dll1、Dll3 和Dll4）和鋸齒狀（Jag1 和Jag2）等跨膜配體激活。一旦激活，Notch 胞內(nèi)域（NICD）被釋放并移位到細胞核，在那里與DNA結(jié)合蛋白RBPj 形成復合物。在分子水平上，NOTCH2NL主要通過激活Notch信號發(fā)揮作用。Notch信號能控制細胞的發(fā)育途徑，在神經(jīng)發(fā)生過程中起著重要作用［2］。NOTCH2NL 是大腦Notch 信號通路中特異性調(diào)控因子之一［4］。NOTCH2NL 部分地通過抑制順式分子中的Notch 配體，以細胞自主的方式發(fā)揮作用。NOTCH2NL也可以通過側(cè)向抑制或另一種直接機制發(fā)揮非自主性作用，它還可以與其他Notch配體或受體結(jié)合。抑制DLL1 轉(zhuǎn)導反式信號的能力可能會導致祖細胞產(chǎn)生相反的神經(jīng)原效應［5］。

3 NOTCH2NLC基因

NOTCH2NL 基因是一種新的缺口樣基因［5-6］，編碼一種分泌性多肽，其結(jié)構(gòu)與NOTCH2 基因N 端相似，具有4種同源基因：NOTCH2NLA、NOTCH2NLB和NOTCH2NLC 位于1q21.1 位點，第4 個完全不同的類似基因NOTCH2NLR（14%的人缺乏），位于1 號染色體p 臂上的NOTCH2 附近。每個NOTCH2NL 基因大于100 kb 的基因組區(qū)域與NOTCH2 序列同源性＞99.1%，且在人類皮質(zhì)祖細胞中高度表達［5］。NOTCH2NLC是一種通過片段復制進化而來的基因，在放射狀膠質(zhì)細胞、星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞等多種放射狀膠質(zhì)細胞群體中高度表達，并參與了人類大腦皮質(zhì)的進化［7］。NOTCH2NLC 在NOTCH2 起始密碼子下游有2bp的缺失，缺少N-末端信號肽，但可產(chǎn)生蛋白質(zhì)產(chǎn)物。NOTCH2NL基因的缺失和復制與神經(jīng)發(fā)育表型有關(guān)，1q21.1 位點基因組穩(wěn)定性的喪失，會導致神經(jīng)發(fā)育障礙［3-5］。近年來，研究發(fā)現(xiàn)NOTCH2NLC 基因5’非翻譯區(qū)GCC 重復擴增與許多神經(jīng)退行性疾病，如神經(jīng)元包涵體病、阿爾茨海默病、額顳葉癡呆、帕金森病、成人腦白質(zhì)病變、特發(fā)性震顫等發(fā)病有關(guān)。

4 NOTCH2NL基因與神經(jīng)退行性疾病

4.1 神經(jīng)元核內(nèi)包涵體病 神經(jīng)元核內(nèi)包涵體?。╪euronal intranuclear inclusion disease，NIID）是一種慢性進展性神經(jīng)退行性疾病，臨床表現(xiàn)復雜多樣，中樞神經(jīng)系統(tǒng)受累常表現(xiàn)為癡呆、共濟失調(diào)、發(fā)作性意識障礙、行為異常、震顫、癲癇發(fā)作、卒中樣發(fā)作等，周圍神經(jīng)受累表現(xiàn)為：感覺障礙、遠端肌力下降；還可有自主神經(jīng)受累表現(xiàn)，如瞳孔縮小、尿失禁、暈厥等，癥狀上可與多種神經(jīng)變性病相疊加。病理學上，NIID的特征是中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元細胞核內(nèi)對抗泛素和抗p62 抗體呈免疫反應的嗜酸性透明包涵體形成［8］。NIID 在磁共振成像（MRI）上的特征性是經(jīng)典“綢帶征”，表現(xiàn)為灰白質(zhì)交界處的彌散加權(quán)成像（DWI）異常。NIID可分為散發(fā)性和家族性兩種類型，后者目前頗受關(guān)注。

基因表達異?？赡軈⑴cNIID的發(fā)病。中南大學湘雅醫(yī)院唐北沙教授的團隊研究發(fā)現(xiàn)NOTCH2NLC基因的動態(tài)突變與NIID 家系相關(guān)，GGC 重復序列的擴增可能導致NIID［9］。隨后的兩項研究，利用長讀基因組長測序（LRS）方法，發(fā)現(xiàn)Notch2 N 端類似C（NOTCH2NLC）基因5’UTR 區(qū)域的一個三核苷酸（GGC）n 擴展重復序列與NIID 相關(guān)［10-11］。另有學者對5 代NIID 家系進行了遺傳連鎖分析，并將其定位于1p13.3-q23.1。長讀基因組測序在人類特異性NOTCH2NLC 中也發(fā)現(xiàn)GGC 重復序列，通過RP-PCR和GC-PCR 進一步證實NOTCH2NLC 基因5’UTR 區(qū)擴增的GGC重復序列（≥66）在其他家系（40例）和散發(fā)性NIID患者中均有存在。ZHANG等［9］人，在一位62歲的NIID患者家系中，檢測到患者和其兩個弟弟在NOTCH2NLC基因5’UTR區(qū)擴增了GGC重復序列［12］。一般認為NOTCH2NLC基因5’UTR區(qū)域GGC重復擴增次數(shù)＞60 次具有致病性，GGC 病理性重復次數(shù)與臨床表現(xiàn)的多樣性相關(guān)，如以肢體無力為表現(xiàn)的患者GGC 重復次數(shù)在約200 次，以認知功能障礙為主要表現(xiàn)者其重復次數(shù)在120 次。在NIID 家系中，除GGC序列重復擴增外，還有GGA和AGC兩種重復中斷形式。這些研究均提示NOTCH2NLC 基因的缺失和復制可能參與了NIID的發(fā)病。

4.2 癡呆和腦白質(zhì)變性 癡呆具有臨床異質(zhì)性、進行性和不可逆性，癥狀經(jīng)常重疊，神經(jīng)退行性癡呆主要涉及的疾病包括阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）、路 易 體 癡 呆（Lewy body dementia，DLB）、額顳葉癡呆（frontotemporal dementia，F(xiàn)TD）等。其中，AD 是導致老年人癡呆的首要原因，占所有癡呆的50%～75%［13-14］，其特征是突觸丟失和神經(jīng)元死亡，細胞內(nèi)神經(jīng)原纖維纏結(jié)和細胞外Aβ斑塊，臨床表現(xiàn)為記憶減退、執(zhí)行功能障礙以及人格和行為改變等全面性癡呆［15］。CHEN等［16］通過Notch信號轉(zhuǎn)導途徑，研究miR-98對AD小鼠Aβ產(chǎn)生、氧化應激和線粒體功能障礙的影響。分別采用MTT法和流式細胞儀檢測海馬神經(jīng)元活性和細胞凋亡率，在AD小鼠中，發(fā)現(xiàn)miR-98 靶向的HEY2 和miR-98 的表達水平較低，而HEY2 的表達水平較高。MIR-98 通過抑制HEY2 使Notch 信號通路失活，從而抑制海馬神經(jīng)元凋亡，提高海馬神經(jīng)元存活率。研究表明，miR-98通過與HEY2 結(jié)合激活Notch 信號通路，減少AD 小鼠Aβ的產(chǎn)生，改善氧化應激和線粒體功能障礙。由此可見，Notch 信號通路調(diào)節(jié)功能的改變，導致的Notch 受體表達降低，可能會導致神經(jīng)退行性病變，如誘發(fā)AD［17］。

NOTCH2NL 作為NOTCH2 的一個重要家族，隨后的一項研究檢測了1 004 例中國大陸地區(qū)神經(jīng)退行性癡呆患者的NOTCH2NLC基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)4例散發(fā)性癡呆患者攜帶NOTCH2NLC重復擴增，在4例突變攜帶者中，3 名和1 名分別被臨床診斷為AD 和額顳癡呆FTD。此外，其中3例在T2-FLAIR成像中發(fā)現(xiàn)腦白質(zhì)病變。該研究表明NOTCH2NLC 重復擴增可能與AD 或FTD 樣表型以及白質(zhì)腦病有關(guān)。但NOTCH2NLC 的擴增頻率明顯低于NIID 患者［18］。TIAN等［9］的研究還檢測到3例AD表型分別攜帶40、45和58個重復，介于致病重復66的最小大小和正常大小38 之間。事實上，這些中間重復序列的致病性尚不清楚，需要來自不同種族的大量隊列才能確定致病性重復序列和正常重復序列的大小。

4.3 特發(fā)性震顫 特發(fā)性震顫（essential tremor，ET）是成人常見的運動障礙疾病［19］，其特征為雙側(cè)上肢孤立的姿勢和（或）運動性震顫，伴或不伴其他部位（如頭部、聲音或下肢）的震顫。ADELING 等［20-21］對462 例ET 患者進行研究，在4 例散發(fā)性ET 患者中發(fā)現(xiàn)GGC 重復擴增＞80 個單位，提示NOTCH2NLC GGC 重復擴增可與散發(fā)性ET 相關(guān)，純ET 表型的攜帶者有可能會在最初震顫開始后40 a 內(nèi)轉(zhuǎn)為NIID。NOTCH2NLC擴增在臨床特征良好的ET家系中仍然很少見。對于出現(xiàn)純ET表型的NIID患者，需要高度懷疑和長期隨訪。NOTCH2NLC（Hg38）的參考序列包含11個GGC重復序列，中間有兩個GGA三核苷酸［（GGC）9（GGA）2（GGC）2］。當比較擴增陽性ET 患者和9例NOTCH2NLC GGC擴增陰性的NIID患者之間的三核苷酸中斷數(shù)據(jù)時，觀察到ET的GGA重復中斷頻率（1.0%）低于NIID 患者（1.6%）。SUN 等［22］也觀察到，NOTCH2NLC 基因5’非翻譯區(qū)GGC 重復序列的異常擴增與ET 有關(guān)。與NIID 相比，家族性ET病例中GGA 中斷的頻率要低得多，GGC 頻率明顯高于NIID，且GGC 重復擴增異常的先證者震顫表型較重，日常生活活動能力較低，但差異統(tǒng)計學無意義，可能是因患者數(shù)量較少［23］。然而，一項對歐洲人ET患病率與NOTCH2NLC 基因中GGC 重復擴增進行的研究，卻并未發(fā)現(xiàn)任何在NOTCH2NLC 基因中攜帶GGC 重復擴增的患者。NOTCH2NLC 基因中異常的GGC 重復擴增導致不同表型，GGC 重復大小和不同的重復中斷是否在這些表型中起重要作用尚不清楚，這些都有待于進一步研究［24］。

4.4 帕金森病 帕金森?。≒arkinson’s disease，PD）是第二大常見的神經(jīng)退行性疾病，以黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元進行性變性和路易體形成為特征。PD 患者表現(xiàn)出運動癥狀，包括運動遲緩、靜止性震顫、肌張力增高和姿勢不穩(wěn)［25］。一項研究利用DLL1 缺失小鼠，發(fā)現(xiàn)Notch 信號在中腦多巴胺能神經(jīng)前體細胞（neural progenitor cells，NPC）的分化和擴增過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用，在DLL1缺陷小鼠的中腦或在使用Notch信號抑制劑治療后，觀察到神經(jīng)元過早分化。在分化早期，Notch信號減弱導致神經(jīng)前體細胞減少，多巴胺能神經(jīng)元數(shù)量增加，并伴隨著順序連接的多巴胺能神經(jīng)前體細胞（Msx1/2+，Ngn2+，Nurr1+）比例的動態(tài)變化，這些分化效應導致產(chǎn)生的多巴胺能神經(jīng)元數(shù)量顯著減少［26］。

MA等［27］對1 000例散發(fā)性PD患者，用聚合酶鏈反應試驗篩選NOTCH2NLC GGC擴增重復序列的存在，并用長讀基因組測序驗證代表性樣本。其結(jié)果發(fā)現(xiàn)，攜帶致病性NOTCH2NLC GGC 41～64 個重復序列的擴增的散發(fā)性PD 病患者可以出現(xiàn)典型的帕金森病，PD患者GGC 擴張期內(nèi)無GGA 中斷，AGC 中斷頻率明顯高于NIID患者。這部分患者對低劑量左旋多巴反應良好，不出現(xiàn)藥物相關(guān)的并發(fā)癥。在幾年的隨訪后也未表現(xiàn)出NIID的其他臨床或影像學特征。臨床NIID 病例報告有＞65 個重復。41～64 個重復序列的擴展可能構(gòu)成PD的遺傳風險，或代表不同的關(guān)聯(lián)。這種中間重復范圍是否代表一種具有隨后臨床表現(xiàn)潛力的內(nèi)表型仍是推測的。另外，對1 011 例患有PD 的漢族人進行的一項研究發(fā)現(xiàn)，中間長度的NOTCH2NLC GGC 重復序列擴增在PD 中的作用，與報道的NIID患者相比，隊列中中等長度重復序列陽性PD 患者的GGC 重復數(shù)顯著增加，GGA/AGC 重復數(shù)的中斷數(shù)明顯減少，且GGC 重復擴增與成纖維細胞中NOTCH2NLC 表達的改變和自噬功能障礙有關(guān)［28］。然而，WAI等［29］的研究表明，運動障礙在白人NOTCH2NLC 中GGC 重復擴增的頻率較低，且NOTCH2NLC 中GGC 重復序列重復擴展是ET 的遺傳因素還是NIID表型譜中的一個亞型仍不確定。

4.5 NOTCH2NLC基因序列擴增與MSA的關(guān)系

多系統(tǒng)萎縮（multiple system atrophy，MSA）也是一種神經(jīng)退行性疾病，其特征是各種癥狀的組合，如帕金森病、自主神經(jīng)功能障礙和小腦性共濟失調(diào)［30］。最近的一項研究報告了MSA 中GGC 重復序列擴增的陽性結(jié)果［31］。XU等［32］在中國人群中對328例散發(fā)性MSA患者進行了NOTCH2NLC基因GGC重復序列的篩查。然而，并未發(fā)現(xiàn)任何MSA患者NOTCH2NLC基因的GGC重復突變。MSA被廣泛認為是一種散發(fā)性疾病，這使得識別MSA 的潛在致病基因變得困難。此外，NIID臨床癥狀有廣泛的異質(zhì)性，包括認知功能障礙、帕金森病樣行為、周圍神經(jīng)病變、共濟失調(diào)、震顫、不自主運動、肌肉無力、發(fā)作和無力、癲癇發(fā)作和頭痛［33-34］。其中一些癥狀似乎與MSA 重疊，幾乎所有的MSA 患者都有顯著的自主神經(jīng)功能障礙，而在被診斷為NIID的成年人中，最常見的癥狀是認知能力下降和癡呆［35-36］。因此，對于MRI顯示病程較長、癡呆和白質(zhì)腦病的MSA患者，進行額外的皮膚活檢和基因篩查，以評估NIID的可能性。

神經(jīng)變性疾病的發(fā)病機制十分復雜。Notch 信號通路具有可以促進干細胞增殖分化、改變小膠質(zhì)細胞極化、阻止少突膠質(zhì)細胞分化和髓鞘的再生等多項功能，其調(diào)節(jié)功能的改變可能參與許多神經(jīng)變性疾病的生理病理過程，NOTCH2NL作為Notch信號和神經(jīng)發(fā)生的特異性修飾物，可以激活Notch信號通路，可能與許多神經(jīng)退行性疾病密切相關(guān)，目前國內(nèi)外已經(jīng)開展了許多相關(guān)研究，NOTCH2NLC基因相關(guān)疾病具有高度復雜性和異質(zhì)性，GGC 異常擴增表達可引起不同臨床表型的機制仍然不清楚，其GGC 重復序列數(shù)量是否發(fā)揮重要作用亦不清楚，其具體分子學機制仍需大量基礎研究的證實。深入研究NOTCH2NL 及NOTCH2NLC 基因在神經(jīng)變性疾病的作用機制，可以為神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病機制提供更多的理論依據(jù)，為尋找潛在的治療靶點提供新的思路，具有其重要的臨床意義。