高于婷 張如意 蔡 飛

1）湖北科技學(xué)院醫(yī)學(xué)部藥學(xué)院，湖北 咸寧 437100 2）湖北科技學(xué)院糖尿病心腦血管病變湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 咸寧 437100

研究表明，神經(jīng)疾病如脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)（spinocerebellar ataxia，SCA）、肌萎縮側(cè)索硬化癥（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）、帕金森綜合征（Parkinson’s disease，PD）、阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）、腦缺血/再灌注損傷（cerebral ischemia reperfusion injury，I/R）等發(fā)病率逐年升高，給患者帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)和精神負(fù)擔(dān)。研究發(fā)現(xiàn)，適應(yīng)性應(yīng)激反應(yīng)是細(xì)胞能夠應(yīng)對外在和內(nèi)在危險的關(guān)鍵細(xì)胞機(jī)制［1］，然而，蛋白質(zhì)毒性應(yīng)激會導(dǎo)致蛋白質(zhì)錯誤折疊，末端錯誤折疊蛋白的積累可以觸發(fā)與神經(jīng)退行性疾病相關(guān)有毒蛋白聚集體的形成。RNF4 是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種可以參與錯誤折疊蛋白質(zhì)降解的泛素連接酶，其主要在小鼠胚胎發(fā)育中的神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)，在背根神經(jīng)節(jié)和發(fā)育中的性腺也有較強(qiáng)的表達(dá)［2］。以上研究表明RNF4 在細(xì)胞周期調(diào)控中發(fā)揮重要作用，提示RNF4這一降解錯誤折疊蛋白質(zhì)的泛素連接酶可能在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中發(fā)揮作用。本文就RNF4在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，為神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病機(jī)制及防治提供新的思路。

1 RNF4的生物學(xué)特征及生理功能

1.1 RNF4 的生物學(xué)特征 RNF4 發(fā)現(xiàn)于20 世紀(jì)90年代末，由RNF4 基因編碼，位于人類染色體4p16.3上，由190個氨基酸組成［3-4］。RNF4家族包括釀酒酵母Slx5、裂殖酵母Rfp1、裂殖酵母Rfp2、網(wǎng)柄菌屬M(fèi)IP1、果蠅屬CG10981和人類的RNF4和RNF111［5］。從結(jié)構(gòu)上看，RNF4同源物包含有4個N末端SIMs和1個C末端RING指狀域，其中SIMs可以識別SUMO修飾的蛋白，并通過環(huán)結(jié)構(gòu)域催化其泛素化，從而物理連接泛素和SUMO通路，潛在地調(diào)節(jié)真核基因組的穩(wěn)定性［6］。定點(diǎn)誘變試驗(yàn)結(jié)果表明，SIM2 和SIM3 在結(jié)合SUMO-2鏈中起主要作用，是底物高效泛素化的關(guān)鍵，而SIM1和SIM4起次要作用［7］。RNF4的C端環(huán)狀結(jié)構(gòu)域則主要促進(jìn)同源二聚體化以及與E2結(jié)合酶的相互作用［8］。

RNF4 作為一種SUMO 靶向泛素連接酶，在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均有表達(dá)，同時也是一種環(huán)蛋白，在發(fā)育中的神經(jīng)和生殖系統(tǒng)中表達(dá)，尤其在睪丸中的表達(dá)水平非常高，在小鼠胚胎發(fā)育中的背根神經(jīng)節(jié)中表達(dá)次之，而在脾臟、腎臟、結(jié)腸、心臟等組織中表達(dá)水平則相對較低，這表明RNF4可能在發(fā)育和細(xì)胞生長程序的調(diào)節(jié)中發(fā)揮關(guān)鍵作用［9］。另外，有研究顯示，RNF4 可調(diào)節(jié)類固醇受體依賴性轉(zhuǎn)錄和基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄，并與多種參與細(xì)胞生長控制的核蛋白相互作用。

1.2 RNF4 的生理功能 RNF4 可通過直接控制自身SUMO 化的E2 結(jié)合酶Ubc9 和自身SUMO 化的E3連接酶來維持SUMO 信號的動態(tài)平衡［10］。在RNF4家族成員中，RNF4 和RNF111 被證明具有SUMO 靶向泛素連接酶的功能［11］。有研究證明在siRNA清除RNF4 表達(dá)的人類細(xì)胞中，積累了高分子量的SUMO形式，表明RNF4參與了體內(nèi)SUMO鏈修飾蛋白的降解。此外，在26S 蛋白酶體抑制劑［12］存在的情況下，高分子量的SUMO 偶聯(lián)物也會大量增加，進(jìn)一步表明SUMO 修飾在泛素介導(dǎo)的蛋白水解中起作用［13］?？偟膩碚f，RNF4具有SUMO E3 連接酶活性、泛素連接酶活性及轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能［14-16］。

研究表明，細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)主要通過泛素蛋白酶體系統(tǒng)（ubiquitin proteasome system，UPS）和自噬系統(tǒng)進(jìn)行降解。而神經(jīng)退行性疾病的形成與錯誤折疊蛋白的積累密切相關(guān)，細(xì)胞中RNF4和STUbL系統(tǒng)共同參與錯誤折疊蛋白質(zhì)的降解。然而，RNF4的調(diào)節(jié)功能不僅僅是標(biāo)記細(xì)胞蛋白以實(shí)現(xiàn)泛素介導(dǎo)的降解，RNF4的修飾還可以改變底物的亞細(xì)胞定位和功能動力學(xué)［17］。RNF4 作為SUMO 靶向的泛素連接酶介導(dǎo)了SUMO 化和泛素修飾融合，作為重要的細(xì)胞機(jī)制，涉及多種病理過程，包括癌癥、心血管疾病、免疫疾病、神經(jīng)疾病以及衰老［18］。因此，RNF4 在體內(nèi)發(fā)揮著廣泛的生理作用，其本身、受體、信號通路的研究是眾多潛在疾病的治療靶點(diǎn)。

2 RNF4與神經(jīng)系統(tǒng)疾病之間的關(guān)系

2.1 RNF4與脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)之間的關(guān)系 脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)7型（spinocerebellar ataxia 7，SCA7）是一種遺傳性神經(jīng)系統(tǒng)疾病，其特征是小腦及其相關(guān)結(jié)構(gòu)中的神經(jīng)元嚴(yán)重喪失，以及黃斑變性［19-20］。突變的、錯誤折疊的共濟(jì)失調(diào)蛋白7（polyQ-ATXN7）在細(xì)胞核內(nèi)積累，RNF4 則有助于ATXN7 突變體的清除。研究表明，RNF4 和SUMO2 的過表達(dá)顯著降低了polyQ-ATXN7 的水平，且在蛋白酶體抑制后，polyQ-ATXN7 的多聚泛素化顯著增加，這表明RNF4能夠泛素化并降解SUMO2 修飾的polyQ-ATXN7，減少錯誤折疊的polyQ-ATXN7。此外，有文獻(xiàn)證明，蛋白酶體的活性會隨著衰老過程而下降，在幼年小鼠中，SUMO 化通過活躍的蛋白酶體有助于突變的ATXN7 的降解，但在老年小鼠中，這種降解會受到影響，因此，ATXN7 的包涵物會隨著時間的推移而增加［21］，并且研究發(fā)現(xiàn)蛋白酶體功能障礙通常與晚發(fā)性疾病有關(guān)，如阿爾茨海默癥、帕金森癥或亨廷頓?。?2］。RNF4可識別和泛素化錯誤折疊蛋白，使這些錯誤折疊的蛋白成為蛋白酶體降解的靶標(biāo)。除SCA7 外，RNF4 在脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)1 型（spinocerebellar ataxia type 1，SCA1）中也發(fā)揮類似作用。突變體ataxin-1 被SUMO2 修飾，并通過RNF4靶向進(jìn)行降解。另外，有研究發(fā)現(xiàn)RNF4消除錯誤折疊的蛋白質(zhì)的功能依賴于SUMO2/3，因?yàn)檫@種能力在缺乏SUMO2/3 的細(xì)胞中受到損害，但在缺乏SUMO1 的細(xì)胞中沒有。以上研究揭示了RNF4 通過SUMO修飾及泛素化去除錯誤折疊蛋白，并在對抗錯誤折疊蛋白類疾病中發(fā)揮作用［23］。

2.2 RNF4與肌萎縮側(cè)索硬化癥之間的關(guān)系 肌萎縮側(cè)索硬化癥是一種罕見的累及上、下運(yùn)動神經(jīng)元的神經(jīng)退行性疾病，臨床研究發(fā)現(xiàn)ALS 患者存在認(rèn)知和行為功能的損害［24］，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，至今仍無定論，目前認(rèn)為ALS 的發(fā)病機(jī)制與免疫紊亂和異常蛋白質(zhì)積累有關(guān)。在ALS 發(fā)生和發(fā)展過程中，神經(jīng)元內(nèi)蛋白質(zhì)的降解受到明顯抑制，異常蛋白質(zhì)在神經(jīng)元內(nèi)過度積聚，形成具有不同特征表現(xiàn)的包涵體，并發(fā)揮神經(jīng)毒性作用，造成神經(jīng)元的變性、壞死［25］。為了避免有毒的蛋白質(zhì)聚集，細(xì)胞進(jìn)化出了細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)蛋白質(zhì)質(zhì)量控制系統(tǒng)，有人提出RNF4是哺乳動物PQC 系統(tǒng)的一部分，該系統(tǒng)通過SUMO 化和泛素化去除細(xì)胞核中錯誤折疊的蛋白質(zhì)［21，23，26］。RNF4 還可調(diào)節(jié)應(yīng)激顆粒（stress granule，SGs）中ALS相關(guān)FUS突變體的區(qū)域化［22］。作為對蛋白毒性應(yīng)激的響應(yīng)，細(xì)胞通過觸發(fā)mRNAs 和RNA 結(jié)合蛋白（RNA-binding proteins，RBPs）在胞漿SGs 中的瞬時儲存來限制毒性蛋白質(zhì)的合成，有研究證明，細(xì)胞核STUbL 通路與SG 動力學(xué)的調(diào)節(jié)有關(guān)。在壓力情況下，許多RBPs和SG成分被SUMO啟動的泛素化所靶向。此外，有證據(jù)表明，SUMO2和RNF4是正確清除熱或亞砷酸鹽誘導(dǎo)的SGs 所必需的。通常ALS 蛋白的致病突變，如FusP525L，也會導(dǎo)致SG 動力學(xué)的改變。目前的概念是，突變體積累在細(xì)胞質(zhì)中，它們誘導(dǎo)SGs從液體到固體的異常轉(zhuǎn)變，最終可能導(dǎo)致病理性包涵體的形成，這一過程在STUbL 途徑缺陷時會加劇，如在SUMO2/3或RNF4耗盡時FusP525L與SGs的結(jié)合增強(qiáng)，那么RNF4泛素化突變蛋白的程度就會有所下降［27］。因此通常認(rèn)為，通過SUMO-RNF4途徑靶向RBPs 可以清除這些蛋白在細(xì)胞核中錯誤折疊的亞組分。然而，由于蛋白質(zhì)的錯誤折疊是不可避免的，而且往往不能因突變、生物遺傳錯誤或不可修復(fù)的損傷而逆轉(zhuǎn)，細(xì)胞最終依賴降解系統(tǒng)維持蛋白質(zhì)質(zhì)量。但目前對這些系統(tǒng)仍知之甚少，盡管泛素-蛋白酶體途徑以及自噬一定是這些系統(tǒng)的重要組成部分，但它們?nèi)绾芜x擇性地識別錯誤折疊的蛋白質(zhì)并將其靶向降解的關(guān)鍵問題仍難以捉摸。

2.3 RNF4與亨廷頓舞蹈癥之間的關(guān)系 亨廷頓舞蹈癥（Huntington’s disease，HD）是一種遲發(fā)性的神經(jīng)退行性疾病，主要表現(xiàn)為運(yùn)動、認(rèn)知以及記憶功能的喪失，患者發(fā)病后15～20 a 死亡。該病具有高度的腦區(qū)選擇性，主要侵害基底神經(jīng)節(jié)和大腦皮質(zhì)，表現(xiàn)為紋狀體投射性GABA神經(jīng)元和大腦運(yùn)動皮層錐體神經(jīng)元死亡［28］。至今為止，HD發(fā)病分子機(jī)制尚不清楚，但是越來越多的證據(jù)表明，轉(zhuǎn)錄調(diào)控異常與HD 發(fā)生密切相關(guān)［29］。突變的亨廷頓蛋白（HTT）是HD的病原體，該蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)過度聚集會形成大的分子團(tuán)，從而影響神經(jīng)細(xì)胞的正常功能導(dǎo)致HD的發(fā)生。在亨廷頓病細(xì)胞模型中，細(xì)胞活力和基因表達(dá)譜會發(fā)生改變。利用酵母模型系統(tǒng)，研究者證明了SUMO靶向泛素連接酶SLX5降低了HD病原體亨廷頓蛋白的突變、易于聚集的片段HTT 相關(guān)的毒性和異常轉(zhuǎn)錄活性。在功能上還發(fā)現(xiàn)SLX5 的額外拷貝特異性地減少了胞漿中的HTT聚集體以及細(xì)胞核中與染色質(zhì)相關(guān)的HTT 聚集體。那么，RNF4 作為SLX5的同源基因，可能也具有抑制人類細(xì)胞系中易于聚集的HTT 的異常轉(zhuǎn)錄活性。最后，通過基因分析發(fā)現(xiàn)SLX5和RNF4分別降低了HTT在酵母和人類細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄活性［30］。以上研究提示STUbL作為一種保守的機(jī)制，可以防止HTT 等聚集蛋白在染色質(zhì)上積累，并抑制其在酵母和哺乳動物細(xì)胞中的錯配轉(zhuǎn)錄活性，這一機(jī)制為未來HD的治療提供了一個新的研究思路。

2.4 RNF4 與多巴反應(yīng)性肌張力障礙之間的關(guān)系多巴反應(yīng)性肌張力障礙（dopa-responsive dystonia，DRD）是由生物胺神經(jīng)遞質(zhì)代謝異常導(dǎo)致的與遺傳相關(guān)的運(yùn)動障礙性疾病［31-32］，大多由編碼多巴胺和四氫生物蝶呤（tetrahydrobiopterin，BH4）生物合成過程中酶的基因突變引起，如三磷酸鳥苷環(huán)化水解酶Ⅰ（guanosine triphosphate cyclohydrolase Ⅰ，GCH1）基因、酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase，TH）基因和墨蝶呤還原酶（sepiapterin reductase，SPR）基因［33］。研究發(fā)現(xiàn)，RNF4作為共激活因子參與了GCH基因的表達(dá)，GCH 近端啟動子上的RNF4 反應(yīng)元件定義為CCAAT 盒；RNF4 對該CCAAT 盒無特異的DNA 結(jié)合活性，提示RNF4可能是CCAAT和結(jié)合蛋白核因子Y（nuclear factor Y，NF-Y）的共激活因子；另外，將RNF4 導(dǎo)入神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系，觀察到內(nèi)源性GCH mRNA 水平的升高，以及RNF4 與內(nèi)源性GCH啟動子在染色質(zhì)免疫沉淀中的相互作用［34］。以上發(fā)現(xiàn)不僅為GCH 的調(diào)控提供了分子基礎(chǔ)，而且擴(kuò)展了RNF4介導(dǎo)的基因激活機(jī)制的認(rèn)識。蛋白質(zhì)生成、穩(wěn)定性和降解性之間的平衡是至關(guān)重要的。研究發(fā)現(xiàn)女性患者更容易受到HPD/DRD 的影響［35］，而RNF4可與雄激素受體和雌激素受體等類固醇受體相互作用［36-37］，通過與雄激素受體（androgen receptor，AR）的DNA結(jié)合域相互作用，作為AR反應(yīng)啟動子的輔助激活因子。因此，了解RNF4 是否與HPD/DRD 中GCH基因表達(dá)的性別差異具有非常重要的意義。

2.5 RNF4與多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤之間的關(guān)系 多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（glioblastoma multiforme，GBM）作為顱內(nèi)惡性程度最高的惡性腫瘤，患者多于確診2 a 內(nèi)死亡，具有血供豐富、高度浸潤以及逃逸攻擊等機(jī)制［38］。膠質(zhì)瘤中存在一種具有干細(xì)胞樣特征的腫瘤細(xì)胞亞群，稱為膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞（glioma initiating cell，GICs）。GIC 表現(xiàn)出持續(xù)的自我更新，并驅(qū)動腫瘤的啟動、增殖和放射/化療耐藥。研究發(fā)現(xiàn)，在人腦膠質(zhì)瘤中，Hey1表達(dá)上調(diào)與USP11和PML下調(diào)以及惡性程度高相關(guān)。早幼粒細(xì)胞白血?。╬romyelocytic leukemia，PML）蛋白可控制多種腫瘤抑制功能，并通過不完全特征化的翻譯后修飾機(jī)制在不同類型的人類癌癥中下調(diào)。有證據(jù)表明，泛素介導(dǎo)的蛋白酶體降解是導(dǎo)致腫瘤中PML下調(diào)的關(guān)鍵機(jī)制［39］。而RNF4可介導(dǎo)SUMO化的PML降解，這一過程可能在GBM的發(fā)展中起作用，因此，科學(xué)家們找到RNF4 的一個功能相互作用因子USP11，USP11 是一種泛素蛋白酶，在正常生長條件下具有中和RNF4的能力。USP11 的耗盡導(dǎo)致核體數(shù)量的減少，而RNF4的耗盡則導(dǎo)致相反的結(jié)果，證明了USP11可以去泛素化和穩(wěn)定PML［40］。因此研究者們確定了一條PML 降解途徑，其中Notch 效應(yīng)子Hey1 抑制PML 特異性去泛素化酶USP11，以增強(qiáng)PML泛素化和降解，這種途徑在膠質(zhì)瘤中表現(xiàn)出來，在GBM中高度激活，并與GBM和GICs的惡性特征有關(guān)，阻斷此通路可能是治療侵襲性GBM的一種治療策略［41］。

3 結(jié)語及展望

RNF4 是一種SUMO 靶向的泛素連接酶，通過泛素蛋白酶體途徑和細(xì)胞信號調(diào)控參與多種病理生理過程，其中泛素并且靶向降解錯誤折疊的蛋白質(zhì)在研究神經(jīng)退行性疾病中發(fā)揮重要作用。此外，其可通過參與轉(zhuǎn)錄過程以及作為核因子的共激活因子在某些神經(jīng)疾病中發(fā)揮作用。但是以上研究都是在動物體內(nèi)進(jìn)行的，在人類是否會產(chǎn)生同樣的作用有待進(jìn)一步研究。另外，RNF4對神經(jīng)退行性疾病是否還有其他通路共同作用尚不明確；RNF4對錯誤折疊蛋白的調(diào)節(jié)作用是通過單一通路還是多個通路共同作用尚不明確；如能設(shè)計(jì)出RNF4小分子類似物或其激動劑將有助于以RNF4為靶點(diǎn)治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病。