祁玉麟 葉河江

視網(wǎng)膜變性類疾病[如視網(wǎng)膜色素變性(RP)、年齡相關性黃斑變性(AMD)、糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)等]、青光眼等眼病共同的病理改變?yōu)楦泄饧毎?、神?jīng)節(jié)細胞等視網(wǎng)膜神經(jīng)元細胞的損傷和變性凋亡[1-2]。目前，三磷酸腺苷(ATP)及嘌呤能離子通道型7(P2X7)受體在神經(jīng)性疼痛、阿爾茨海默病、帕金森病、脊髓損傷及多發(fā)性硬化等神經(jīng)退行性疾病中發(fā)揮重要作用而成為研究的焦點[3-6]，P2X7受體介導的信號異常表達或激活與神經(jīng)退行性及炎癥疾病的病變過程相關。視網(wǎng)膜作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)向外延伸的一部分，P2X7受體在視網(wǎng)膜多種類型的細胞中表達，ATP通過對P2X7受體的作用來調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜中一系列細胞功能。P2X7受體功能異?？赡軐е虑喙庋酆瓦z傳性視網(wǎng)膜退化中神經(jīng)元細胞喪失，以及AMD和DR視網(wǎng)膜的炎癥反應[7-9]，而調(diào)控P2X7受體功能可能在防止視網(wǎng)膜神經(jīng)元喪失、減輕與視網(wǎng)膜疾病相關的炎癥或改變免疫細胞吞噬作用等方面發(fā)揮作用。本文對近年來嘌呤P2X7受體在視網(wǎng)膜變性類疾病中的作用進行綜述。

1 P2X7受體的結構及功能

ATP及其降解產(chǎn)物是體內(nèi)重要的信息傳遞分子，在應激狀態(tài)下細胞內(nèi)高濃度的ATP被釋放到胞外環(huán)境中，作用于配體門控離子通道(P2X1-7)受體[10]和代謝型G蛋白連接的嘌呤能受體(P2Y12,4,6,11-14)[11]。作為P2嘌呤家族受體的成員之一，P2X7受體由595個氨基酸殘基組成，具有兩個跨膜結構、一個胞外結構域，胞內(nèi)由N端和C端組成[12]，C端區(qū)在P2X受體家族中最長，與其他蛋白無同源性，帶有蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的結合基序，此特殊結構使P2X7受體具有獨特的分子功能，能通過擴展N端的胞質(zhì)尾區(qū)引起質(zhì)膜滲透障礙，導致細胞毒性及凋亡[13]。P2X7受體是P2X受體家族的最后一個成員，與嘌呤家族其他配體門控離子通道不同，其獨特之處在于：首先，P2X7受體是對ATP敏感性最低的亞型，相較于其他P2X受體需要更高濃度的ATP來激活，其可根據(jù)ATP激活的濃度和持續(xù)時間來介導不同的功能[14]；其次，P2X7是唯一不僅可滲透小分子陽離子，還可以通過應用激動劑暫時打開滲透無機大分子的亞型。P2X7受體的最初激活可導致非選擇性胞膜孔道的開放，允許Na+、Ca2+內(nèi)流和K+外流，對Ca2+具有顯著的滲透性[15]。在低二價陽離子或持續(xù)性刺激活化則可導致跨膜孔道的形成，可通過相對分子質(zhì)量低于900的親水性分子參與相應的病理生理過程[16-17]。

2 P2X7受體在視網(wǎng)膜中的分布

細胞中ATP代謝介導視網(wǎng)膜的病理過程，在視網(wǎng)膜中也檢測到幾種P2受體的表達[18]。研究顯示，P2X7受體可在視網(wǎng)膜多種類型的細胞中表達，包括神經(jīng)元細胞、膠質(zhì)細胞、視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)細胞和血管細胞[4,8]。在成年鼠視網(wǎng)膜的內(nèi)核層和神經(jīng)節(jié)細胞層的許多細胞上均可檢測到免疫標記的P2X7受體，也發(fā)現(xiàn)其存在于視桿及雙極細胞中[8]。視網(wǎng)膜神經(jīng)元包括感光細胞、神經(jīng)節(jié)細胞(RGC)和腺分泌細胞，它們均表達P2X7受體[8]。有研究者通過應用P2X7激動劑BzATP[19]或敲除小鼠基因[8]進一步證明了P2X7受體在感光細胞中的表達及作用。

除了在神經(jīng)元細胞表達外，P2X7受體在視網(wǎng)膜膠質(zhì)細胞中也有表達。視網(wǎng)膜膠質(zhì)細胞對維持視網(wǎng)膜穩(wěn)態(tài)至關重要，在疾病過程中具有關鍵作用。研究表明，視網(wǎng)膜Müller細胞、小膠質(zhì)細胞中也表達P2X7受體[8,20-21]，激活P2X7受體可調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜Müller細胞膠質(zhì)增生改變和功能障礙。同樣，P2X7受體激動劑可增加視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細胞激活及釋放白細胞介素-1β(IL-1β)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)損傷視網(wǎng)膜細胞。在病理條件下，P2X7受體的表達上調(diào)使視網(wǎng)膜神經(jīng)元易于受損，因此靶向 P2X7 受體可作為治療視網(wǎng)膜疾病的手段[22]。

3 P2X7受體在視網(wǎng)膜變性類疾病中的作用

3.1 P2X7受體介導視網(wǎng)膜神經(jīng)元細胞的損傷及凋亡

3.1.1 感光細胞感光細胞包含視錐細胞和視桿細胞，二者感知并傳遞光刺激，在視覺信號轉(zhuǎn)導通路中具有重要作用。視網(wǎng)膜嘌呤能信號異?？赡軙绊懜泄饧毎耐暾院凸δ堋TP是P2X7受體的內(nèi)源性激動劑[23]，在正常生理條件下,細胞外二價陽離子濃度和細胞外低濃度的ATP維持低水平的P2X7受體活性[24]。P2X7受體在低濃度ATP中不激活，而應激狀態(tài)下RPE細胞和視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞均可釋放大量ATP激活RPE細胞及感光細胞上的P2X7受體[24-25]。一項體外研究發(fā)現(xiàn)，加入P2X7受體激動劑BzATP后視網(wǎng)膜感光細胞出現(xiàn)死亡率的增加[19]，伴隨Caspase-8/-9的激活和促凋亡因子的形成及轉(zhuǎn)移。同樣在動物實驗中，于嚙齒動物或貓的玻璃體內(nèi)注射高濃度ATP導致其視網(wǎng)膜感光細胞快速及持續(xù)性丟失[26-27]。

感光細胞表達P2X7受體，P2X7受體激活介導了感光細胞凋亡，而敲除P2X7受體或采用P2X7拮抗劑治療則抑制其視網(wǎng)膜感光細胞的死亡[19]。在RP小鼠模型感光細胞變性期間，視網(wǎng)膜中P2X7受體mRNA表達上調(diào)[28]。玻璃體內(nèi)注射ATP導致大鼠視網(wǎng)膜中感光細胞的持續(xù)凋亡，而使用P2X7受體拮抗劑則明顯減少感光細胞凋亡。在RP模型rd1小鼠中使用嘌呤能拮抗劑吡哆醛衍生物(PPADS)可減少約30%的感光細胞死亡[26]。同樣，滲出型AMD中感光細胞丟失伴隨視網(wǎng)膜下出血，在視網(wǎng)膜下出血小鼠模型中采用P2X7受體拮抗劑Brilliant Blue G(BBG)治療可起到保護作用，阻止晚期AMD視網(wǎng)膜下出血引起的感光細胞死亡[29]。這些研究結果表明，P2X7受體在感光細胞死亡中的作用及其受體拮抗劑可能具有一定的保護作用。

3.1.2 RPE細胞RPE細胞在視網(wǎng)膜外層形成血-視網(wǎng)膜屏障，其向內(nèi)緊鄰視網(wǎng)膜光感受器的外段，為相鄰的光感受器提供多種支持功能，向外則與脈絡膜供血相鄰[30]。RPE細胞損傷是AMD病理改變的始動環(huán)節(jié)。研究表明，P2X7受體參與AMD氧化應激、炎癥反應等過程，P2X7受體激活引起Ca2+穩(wěn)態(tài)失常也是AMD形成的可能原因[31]。也有研究指出，老年P2X7受體敲除小鼠表現(xiàn)出受體活性的改變以及早期AMD的特征[9]。當組織受到炎癥、損傷、感染等刺激時會引起細胞外的ATP釋放增加，P2X7受體激活膜孔形成導致Ca2+內(nèi)流，RPE細胞凋亡；同時，激活P2X7受體，釋放ROS刺激慢性氧化應激發(fā)生，促使RPE細胞老化導致AMD發(fā)生。也有研究表明，P2X7受體介導的NLRP3炎癥小體激活引起RPE細胞死亡和地圖樣萎縮，參與干性AMD的發(fā)生[32]。此外，在ABCA4-/-RP小鼠模型中，激活P2X7受體導致RPE細胞通過涉及Ca2+流入的過程釋放IL-6，在細胞外高ATP濃度條件下增加RPE細胞中的炎癥或保護性信號傳導，而使用P2X7R拮抗劑 A438079、A839977及AZ10606120 則抑制IL-6的釋放[33]。因此，阻斷P2X7受體的激活可能對RPE細胞的功能起到保護作用。

3.1.3 RGC細胞外ATP濃度改變和P2X7受體激活可導致RGCs的病理性喪失和視網(wǎng)膜功能障礙[34-37]。在DR模型鼠中Müller細胞釋放ATP通過激活小膠質(zhì)細胞上P2X7受體及其隨后炎癥細胞因子的表達，進而誘導RGCs凋亡[38]。RGCs損傷死亡也與青光眼患者視力喪失密切相關，有研究指出ATP誘導的P2X7受體活化是青光眼的發(fā)病機制[39]，ATP水平伴隨眼壓的增加而上升，進而激活RGCs上P2X7受體表達對RGCs產(chǎn)生有害作用[4]。P2X7受體介導缺氧或高眼壓誘導的RGCs死亡[7,40]，其活化后可促進IL-18和IL-6等炎癥因子的釋放參與RGCs死亡，而RGCs的死亡可伴隨眼壓增高，進而加劇P2X7受體的活化，導致炎癥因子表達上調(diào)，加速RGCs的死亡[37]。P2X7受體的激活增加可能與其他因素一起導致視網(wǎng)膜功能的變化和 RGCs的死亡[40]。此外，P2X7受體的異常激活通過依賴于細胞內(nèi)Ca2+濃度增加的方式導致RGCs死亡[34]，對年齡相關性青光眼神經(jīng)變性的遺傳小鼠(DBA/2J小鼠)模型采用P2X7受體拮抗劑治療，可顯著改善PERG信號，同時降低視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細胞激活，對RGCs具有神經(jīng)保護作用[41]。通過P2X7受體阻斷或基因敲除可延遲細胞死亡和減少吞噬小膠質(zhì)細胞的增加，保護RGCs免受視神經(jīng)的擠壓，因此阻斷P2X7受體激活對RGCs具有神經(jīng)保護作用。

3.2 P2X7受體調(diào)控視網(wǎng)膜膠質(zhì)細胞的作用

3.2.1 小膠質(zhì)細胞小膠質(zhì)細胞作為眼內(nèi)主要的固有免疫細胞，其過度激活促進神經(jīng)毒性因子的釋放，如TNF-α、IL-1β、氧和氮自由基以及 Fas-配體，從而導致神經(jīng)元和感光細胞變性凋亡。Vessey等[8]在小鼠視網(wǎng)膜中發(fā)現(xiàn)小膠質(zhì)細胞表達P2X7受體，Gu等[25]也在靈長類動物眼的小膠質(zhì)細胞上檢測到P2X4和P2X7受體表達，兩種受體一旦被激活可能會導致先天吞噬作用的喪失并使個體易患AMD。在小鼠激光誘導的脈絡膜新生血管(CNV)模型中，小膠質(zhì)細胞累積激活并表達嘌呤能受體P2X4、P2X7、P2Y2和 P2Y12，運用P2受體抑制劑可以顯著影響小膠質(zhì)細胞的功能，抑制CNV的形成[21]。P2X7受體是ATP刺激視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細胞活化并分泌促炎細胞因子的關鍵，P2X7受體介導NLPR3信號通路調(diào)控視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細胞的活化增殖，促使其產(chǎn)生并釋放一些促炎細胞因子，如TNF-α、IL-6、IL-1β等，導致RGCs損傷及凋亡[42]。

3.2.2 星形膠質(zhì)細胞P2X7受體除了在膠質(zhì)細胞激活中發(fā)揮作用外，還可增加星形膠質(zhì)細胞中炎癥因子的啟動。視神經(jīng)盤中星形膠質(zhì)細胞通過Pannexin半通道釋放機械敏感性ATP，導致P2X7受體激活并通過NF-κB途徑引發(fā)炎癥信號[43]。P2X7 受體參與視網(wǎng)膜中星形膠質(zhì)細胞IL-6機械敏感性的上調(diào)和釋放，P2X7拮抗劑則可阻止星形膠質(zhì)細胞腫脹誘導的IL-6表達升高[44]。在慢性青光眼Tg-MYOC(Y437H)小鼠模型中，響應于升高的眼壓，通過上調(diào)星形膠質(zhì)細胞中的Pannexins半通道引起ATP 釋放，激活P2X7受體，增加視網(wǎng)膜細胞的死亡[45]

3.2.3 Müller細胞Müller細胞是視網(wǎng)膜上ATP的重要來源，其釋放的ATP是維持視網(wǎng)膜中水動力的關鍵，而阻止這種釋放會導致視網(wǎng)膜腫脹和水腫[20]。有研究表明，谷氨酸可以通過激活Müller細胞上的N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)及非NMDA受體導致ATP的釋放[46]。P2X7受體激活促使Müller細胞去極化，從而降低谷氨酸攝取率，導致細胞外谷氨酸水平升高，降低細胞外滲透壓和神經(jīng)元衍生的滲透劑的攝取，進而引起Müller細胞腫脹和視網(wǎng)膜水腫。在大鼠玻璃體內(nèi)注射I 型代謝型谷氨酸受體激動劑(S)-3,5-二羥基苯基甘氨酸(DHPG)誘導Müller細胞激活增生，導致ATP 釋放增加[47]，可以通過上調(diào)P2X7受體表達導致RGC-5細胞的凋亡，增強ATP的有害作用，而加入P2X7受體阻斷劑后可以抑制Müller細胞激活，減少RGC的凋亡[48-49]。

3.3 P2X7受體調(diào)控視網(wǎng)膜炎癥反應P2X7受體參與多種關鍵細胞因子分泌和介導炎癥反應[50]。作為炎癥反應中重要的參與者，炎癥因子在視網(wǎng)膜中異常聚集可能損傷血管內(nèi)皮細胞，造成組織水腫、滲漏及無灌注區(qū)的形成。此外，炎癥反應能夠降解血-視網(wǎng)膜屏障的完整性，進而導致視網(wǎng)膜血管阻塞和局部缺血[51]。P2X7受體的激活誘導Ca2+流入，促使NLRP3炎癥小體激活和IL-1β、IL-18的加速釋放，導致視網(wǎng)膜炎癥反應和損傷[52]。研究表明DR復雜病理情況與病變部位炎癥因子的持續(xù)活化有關[53]。在DR模型中，P2X7受體激活調(diào)節(jié)細胞因子的過度表達和釋放，誘導炎癥反應，破壞血-視網(wǎng)膜屏障的完整性，加重視網(wǎng)膜內(nèi)皮細胞的損傷[54]。P2X7受體又可通過細胞內(nèi)Ca2+水平介導周細胞的收縮，激活P2X7受體導致體外DR大鼠視網(wǎng)膜毛細血管周細胞釋放炎癥因子并促進炎癥反應，導致周細胞死亡，從而損害血-視網(wǎng)膜屏障的完整性，導致血管滲漏和黃斑水腫[55]。使用P2X7受體拮抗劑OxATP可以明顯減輕P2X7受體激動劑BzATP對視網(wǎng)膜毛細血管周細胞的毒性作用，提高細胞存活率[56]。

3.4 P2X7受體影響新生血管生成血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是視網(wǎng)膜血管損傷發(fā)生和進展的核心因素，參與DR、AMD等許多視網(wǎng)膜疾病的發(fā)病機制。P2X7受體激活或過表達促進VEGF的分泌和累積，從而促進疾病過程中新生血管的生成。ATP 水平升高可能會促進內(nèi)皮細胞和先天性免疫細胞中 P2X7受體介導的缺氧誘導因子-1α(HIF-1α)活化，反過來又會促進VEGF釋放和血管異常增殖[57]。VEGFA是DR的靶點和生物標志物，P2X7受體激動劑BzATP增加了體外視網(wǎng)膜內(nèi)皮細胞中VEGFA mRNA的表達[58]。此外，P2X7受體激活引起NLRP3過度表達，在轉(zhuǎn)基因Akimba高血糖小鼠中NLRP3激活失調(diào)導致血管滲漏和視網(wǎng)膜新生血管形成[59]。而在STZ誘導的大鼠高血糖性視網(wǎng)膜病變模型中P2X7受體表達增加，運用兩種不同的P2X7受體拮抗劑A740003或AZ10606120靶向抑制P2X7受體可有效降低血管通透性，減少VEGF和IL-6的釋放[60]。這些研究結果表明，靶向P2X7受體可能是抑制VEGF釋放的有效途徑。

4 P2X7受體調(diào)控神經(jīng)元細胞損傷相關機制通路

有研究表明P2X7受體的激活誘導許多細胞信號通路[61]。細胞外ATP和P2X7受體相結合產(chǎn)生寡聚化反應，打開離子通道或膜孔后K+外流，這一變化激活重要的核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3(NLRP3)炎癥小體[62]。NRLP3炎癥小體的激活可增強炎癥及視網(wǎng)膜疾病中細胞死亡。NRLP3炎癥小體的激活與Caspase-1的裂解和促炎細胞因子IL-1β、IL-18的釋放有關。在CNV小鼠模型中，視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細胞激活并通過P2X7/NLRP3/Caspase-1炎癥小體通路參與CNV生成[63]。P2X7受體可以輔助NLRP3精確聚焦K+流出和Ca2+流入的位置，通過調(diào)節(jié)NLRP3的表達水平來放大促炎信號[64]。有研究指出P2X7R/NLRP3信號通路可影響視網(wǎng)膜組織導致DR的發(fā)生和進展[65]。高糖條件下誘導組織缺血缺氧，可激活RPE細胞上P2X7受體,從而活化NLRP3炎性復合體,使其釋放炎性介質(zhì)發(fā)揮生物學作用[66]，通過下調(diào)DR小鼠視網(wǎng)膜中P2X7R/NLRP3通路蛋白表達可保護視網(wǎng)膜細胞[67]。此外，阻斷P2X7受體通過調(diào)控NLRP3及NF-κB信號通路可降低Caspase-1的表達，抑制ROS生成以及HIF-1α和VEGF表達來減輕視網(wǎng)膜炎癥和抑制新生血管形成，保護視網(wǎng)膜功能[68]；阻斷P2X7/NLRP3/Caspase-1信號及抑制下游IL-1β表達可減緩眼底玻璃疣沉積物現(xiàn)象，促進AMD小鼠視網(wǎng)膜結構恢復[69]。

此外，P2X7受體可激活小膠質(zhì)細胞導致釋放溶酶體蛋白酶組織蛋白酶S釋放，進而促進神經(jīng)元趨化因子CX3CL1/CX3CR1的參與并反饋給小膠質(zhì)細胞，在神經(jīng)元損傷性信號轉(zhuǎn)導中起關鍵作用[70]。P2X7R/CX3CL1/CX3CR1信號通路激活小膠質(zhì)細胞，導致細胞內(nèi)p38 MAPK蛋白磷酸化，隨后刺激釋放IL-6和IL-1β?lián)p傷神經(jīng)元細胞[71-72]，介導神經(jīng)元-小膠質(zhì)細胞的相互作用。NMDA受體激活后大量 Ca2+內(nèi)流被認為是視網(wǎng)膜神經(jīng)元細胞死亡的一種機制，P2X7 受體的激活參與了 NMDA受體介導的體內(nèi)大鼠視網(wǎng)膜組織損害和RGCs死亡。使用P2X7受體拮抗劑A438079、BBG防止NMDA誘導的SD大鼠視網(wǎng)膜損傷和抑制膠質(zhì)細胞對谷氨酸的攝取[73]。

5 小結

視網(wǎng)膜變性類疾病是嚴重致盲性眼病，感光細胞凋亡和視網(wǎng)膜神經(jīng)元進行性退化會引起不可逆的視網(wǎng)膜損傷，然而目前尚無有效的治療方法。P2X7受體被認為是多種眼部疾病的潛在藥理學靶點，P2X7受體激活與視網(wǎng)膜神經(jīng)元及膠質(zhì)細胞的關系成為研究熱點，靶向P2X7受體的治療可發(fā)揮保護視網(wǎng)膜組織功能及神經(jīng)元細胞的作用。目前，運用P2X7受體拮抗劑(如A438079、A839977、BBG和MRS 2540等)可防止視網(wǎng)膜神經(jīng)元細胞的損傷和凋亡[43-44,73-75]，其中BBG 也是眼科手術中的一種獲批佐劑藥物。阻斷P2X7受體及其介導的相關信號通路能夠抑制膠質(zhì)細胞激活，保護視網(wǎng)膜神經(jīng)元細胞，促使P2X7受體有望成為治療視網(wǎng)膜變性類疾病的一個重要新靶點。目前已經(jīng)開發(fā)出高選擇性小分子P2X7受體抑制劑，部分已被用于一些慢性炎癥疾病的 I期和II期臨床研究中測試并評估[76]。但是，P2X7受體與視網(wǎng)膜神經(jīng)元及膠質(zhì)細胞的關系仍需要進一步的基礎研究及臨床試驗進行探索，對于全面認識P2X7受體并驗證其保護視網(wǎng)膜變性類疾病的作用及機制具有重要的意義。