張 黎 綜述，周 梅 審校

(重慶市渝北區(qū)人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，重慶 401120)

快速現(xiàn)場評價(ROSE)是一種在穿刺、活檢、刷片等方法收集標(biāo)本時，相關(guān)人員在場，對所得標(biāo)本滿意度進行快速評價、得出初步診斷和優(yōu)先策略，反饋指導(dǎo)下一步操作的技術(shù)。ROSE可用于多學(xué)科，在診斷性介入肺臟病學(xué)操作中，ROSE 是一項實時伴隨于取材過程的快速細胞學(xué)判讀技術(shù)。靶部位取材時，在基本不損失組織標(biāo)本的前提下，將部分取材印涂于玻片，制成細胞學(xué)片基，迅速染色并以專用顯微鏡綜合臨床信息立即判讀。作為一種細胞學(xué)載體，ROSE具備相應(yīng)功能，包括評價取材滿意度、實時指導(dǎo)介入操作手段與方式、形成初步診斷或縮窄鑒別診斷范圍、優(yōu)化靶部位標(biāo)本進一步處理方案、結(jié)合全部臨床信息與細胞學(xué)背景進行病情分析與轉(zhuǎn)歸預(yù)判[1]。但ROSE的應(yīng)用是否有益仍存在爭議，仍需進一步研究以獲取最佳的方法及標(biāo)準(zhǔn)，故本文擬將最新的ROSE在診斷性介入肺臟病學(xué)的應(yīng)用進展展開綜述。

1 ROSE的細胞學(xué)評判進展及操作者的選擇

ROSE是一個簡單而復(fù)雜的程序，具體的操作可以分為3個步驟:生產(chǎn)、染色、讀片解釋。由于ROSE的目的是實時指導(dǎo)干預(yù)過程，其技術(shù)核心有兩點:一是盡可能提高膜片的制作和染色速度；二是準(zhǔn)確解釋細胞學(xué)結(jié)果。因此，可能影響主要結(jié)果的ROSE處理信息包括如涂片方法、涂片技師的水平、染色方法、染色技師的水平、有創(chuàng)程序、讀片技師的職業(yè)等[2]。

在涂片方法上包括:印片(滾片)、刷片(涂片)、噴片、留片[1]；在染色方法上，可采用迪夫染色、甲苯胺藍染色、劉氏染色等，均可在1 min內(nèi)完成染色內(nèi)容[3]，WHO 推薦采用迪夫染液對 ROSE 細胞學(xué)片基進行快速染色[1]。迪夫染色與瑞氏染色類似，經(jīng)技術(shù)改良而成，結(jié)果也和瑞氏染色類似。迪夫染色耗時很短，僅30～70 s。因為制片、染色耗時極短，使 ROSE 判讀過程幾乎與介入操作過程形成“實時”反饋。染色時推薦采用“浸染”而非“滴染”以提高染色質(zhì)量與效率[4-5]。

如何判斷涂片的質(zhì)量？有學(xué)者研究了如何判斷ROSE樣本是否充足的簡單算法，2位病理學(xué)家分別對133例患者300個淋巴結(jié)行超聲內(nèi)鏡引導(dǎo)下經(jīng)支氣管針吸活檢(EBUS-TNBA)的ROSE涂片進行回顧，并將其結(jié)果與最終病理結(jié)果進行比較，發(fā)現(xiàn)采用組織核心大小(組織核心大于或等于2 cm)、有無惡性細胞、可見炭疽色素(MAP)和淋巴細胞密度增加(LD)≥40個細胞/蘇木精-伊紅(HP,40×)，敏感性和準(zhǔn)確率分別從64.4%提高至98.6%和64.7%提高至97.3%[6]。有研究通過對不同細胞形態(tài)參數(shù)的分析，發(fā)現(xiàn)對于腺癌，核仁和小/中細胞團簇的結(jié)合具有最佳的敏感性和特異性，對于鱗狀細胞癌，壞死大于或等于50%和大細胞團簇的結(jié)合具有最佳的敏感性和特異性。對于小細胞癌，中度壞死(50%)和單細胞存在的診斷準(zhǔn)確率最高；總體精確度在90%～97%。該研究表明，僅使用幾個容易識別的細胞形態(tài)學(xué)參數(shù)就可以建立ROSE期間最常見肺癌的組織類型。在ROSE中一個準(zhǔn)確的診斷可以幫助內(nèi)鏡醫(yī)師決定需要取多少腫瘤樣本，例如腺癌的生物分子特征需要更多的樣本，而鱗狀細胞癌一個樣本就足夠了[7]。對于如何更好地判斷ROSE涂片的制作及病理學(xué)方法，研究尚不多，有待進一步研究。

通常情況下，細胞學(xué)ROSE評估應(yīng)由專業(yè)的病理科醫(yī)師操作，或現(xiàn)場制片將鏡下觀察圖像通過遠程系統(tǒng)將數(shù)據(jù)傳輸至病理科醫(yī)師實時評估[7-8]。但由于條件限制，很多呼吸內(nèi)鏡中心缺乏專門的病理科醫(yī)師，從而限制了ROSE的發(fā)展，是否有替代方案？BONIFAZI等[9]報告，經(jīng)過3個月的細胞病理學(xué)培訓(xùn)后，呼吸科醫(yī)生和細胞病理學(xué)家對ROSE的評估達成了81%的總體一致。來自日本的一項研究提示，ROSE由1名呼吸科醫(yī)生完成，而該醫(yī)生在1位細胞技術(shù)專家的培訓(xùn)下總共工作了1個月，將ROSE的結(jié)果與細胞病理學(xué)家最終診斷結(jié)果進行比較，結(jié)果在所有操作中，ROSE的靈敏度為88.5%，特異性為83.0%，診斷準(zhǔn)確率為86.4%，提示經(jīng)過訓(xùn)練的肺科醫(yī)生通過ROSE對肺癌的判斷非常高，與病理學(xué)家的結(jié)論無明顯差異[10]。NATALI等[11]的研究結(jié)果也顯示，經(jīng)過專業(yè)訓(xùn)練的呼吸科醫(yī)生可以可靠地評估支氣管鏡下ROSE涂片的腫瘤負荷，特別是在評價淋巴結(jié)疾病時，這對于那些沒有定期提供細胞病理學(xué)家的機構(gòu)尤其有用。另一項研究也顯示，醫(yī)學(xué)專家對ROSE的判斷與病理學(xué)家無顯著差異，是一個可接受的選擇[12]。另外，與細胞病理學(xué)家的最終評估相比，由生物醫(yī)學(xué)科學(xué)家進行的ROSE和初步充分性評估及初步診斷都具有高度的準(zhǔn)確性[13]。上述研究提示，在ROSE過程中，對呼吸內(nèi)鏡醫(yī)生或呼吸科醫(yī)生進行培訓(xùn)后可以到達與病理科醫(yī)師類似的評估水平，特別是對腫瘤性疾病，對一些良性疾病的判別仍存在困難。但培訓(xùn)的內(nèi)容、時間等是否有標(biāo)準(zhǔn)化的參考仍缺乏研究。

2 ROSE在氣管鏡中的應(yīng)用

2.1ROSE在常規(guī)經(jīng)支氣管鏡針吸活檢(c-TBNA)和EBUS-TBNA中的應(yīng)用 c-TBNA和EBUS-TBNA是診斷性介入肺臟病學(xué)中的常見操作，也是呼吸科中ROSE 應(yīng)用最廣泛的領(lǐng)域。MALLYA等[14]研究表明，以組織病理學(xué)檢查為“金標(biāo)準(zhǔn)”，EBUS-TNBA聯(lián)合ROSE診斷的總體敏感性和特異性分別為85.4%和89.6%，單純惡性腫瘤的敏感性和特異性分別為100.0%和98.4%，從而認為這種新方法安全性高、診斷率高，在輔助介入支氣管鏡安全、準(zhǔn)確診斷方面具有很好的潛力，ROSE促進樣本充足，也有助于快速臨床決策。另一項236例患者EBUS-TBNA的研究顯示，ROSE組的病理分層診斷率明顯高于非ROSE組(90.5%vs.81.2%，P=0.003)，當(dāng)對肺癌患者肺門或縱隔淋巴結(jié)進行取樣時，可疑結(jié)果的發(fā)生率較低，因此提高了病理學(xué)分層診斷的診斷率[15]。專家和科學(xué)協(xié)會指南建議使用ROSE和EBUS-TBNA優(yōu)化肺癌基因分型，但尚未開展比較試驗來確認和量化其有效性，TRISOLINI等[16]的研究結(jié)果顯示，ROSE防止了對至少1/10的晚期肺癌患者進行分子譜分析的重復(fù)侵入性診斷程序的需要，并且顯著降低了提取樣本的風(fēng)險。不僅僅是腫瘤性疾病，在許多非腫瘤疾病中，ROSE也顯示出了積極的作用。關(guān)于一項EBUS-TNBA用于肉芽腫性疾病淋巴結(jié)取樣進一步ROSE的研究表明，ROSE與最終的細胞學(xué)診斷有很高的一致性，且ROSE可以縮短手術(shù)時間，加強樣本篩選，并消除進一步侵入性檢查的需要，唯一與一致性增加相關(guān)的變量是操作者的經(jīng)驗[17]。另一項對80例疑似結(jié)節(jié)病的患者的隨機對照研究顯示，當(dāng)對疑似結(jié)節(jié)病進行TBNA時，c-TBNA伴ROSE和EBUS-TBNA(伴ROSE或不伴ROSE)優(yōu)于單獨的c-TBNA，但c-TBNA伴ROSE是否可以等同于EBUS-TBNA，由于樣本量不多，這項研究尚無法確定，有待進一步大樣本的研究[18]。在沒有EBUS的中心，與單一c-TBNA相比，同時與ROSE聯(lián)合使用的TBNA產(chǎn)生的適宜樣本比例增加，可以縮短手術(shù)時間，增強樣本篩選，從而限制進一步侵入性診斷檢查的需要[19]。帶ROSE的c-TBNA是一種安全、有效、經(jīng)濟的支氣管鏡檢查方式，當(dāng)操作員常規(guī)執(zhí)行帶ROSE的c-TBNA時，可以獲得與EBUS-TBNA相似的診斷產(chǎn)量，即使在有EBUS設(shè)施的中心，c-TBNA也應(yīng)該常規(guī)進行[20]。提示ROSE在c-TNBA中的收益可能大于在EBUS-TNBA中的收益。

然而，一篇meta分析薈萃了5項研究后認為雖然在EBUS-TBNA期間，使用ROSE與針吸的次數(shù)較少以及在TBNA期間進行額外支氣管鏡檢查以作出最終診斷的總體需求較低相關(guān)，在c-TNBA中使用ROSE可以縮短并發(fā)癥的發(fā)生(但在EBUS-TNBA時沒有發(fā)揮該作用)，但是使用ROSE既不能提高TBNA的診斷率，又不能減少手術(shù)時間，該研究認為雖然ROSE是否用于所有TNBA患者還有爭議，但可以用于高?；颊撸热缍嘀丶膊』颊咭詼p少氣管鏡的程序[21]。在另一前瞻性研究中，348例EBUS-TBNA手術(shù)中，有213例使用ROSE進行，診斷的準(zhǔn)確率從84.4%提高至90.6%，但P=0.082，且在多變量模型中進行調(diào)整后，ROSE的益處仍未達到統(tǒng)計學(xué)差異顯著性。在惡性疾病或結(jié)節(jié)病的亞組患者中也得到了類似的結(jié)果。病變的大小并不影響ROSE對準(zhǔn)確性的影響，該項研究表明ROSE與EBUS-TBNA準(zhǔn)確性的適度提高相關(guān)，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)[8]。

ROSE在TNBA中的作用是否重要，仍然存在爭議，就現(xiàn)有研究來看，在c-TNNA中的優(yōu)勢大于EUBS-TNBA中的優(yōu)勢，這可能是由于EBUS-TBNA本身已具有較高的診斷率。另外，ROSE的作用與呼吸內(nèi)鏡中心操作者的經(jīng)驗有較大關(guān)系，故有待設(shè)計更嚴(yán)謹?shù)碾S機對照試驗，更多中心、大樣本的試驗來消除偏倚，進一步明確ROSE的意義所在。

2.2ROSE在新的肺臟疾病診斷性介入操作中的應(yīng)用 徑向探針支氣管內(nèi)超聲(R-EBUS)近年來已成為經(jīng)支氣管活檢(TBB)診斷肺周圍病變(PPLs)的有力工具，提高了診斷率，影響支氣管內(nèi)超聲引導(dǎo)下TBB診斷率的因素通常是探針的位置，病灶的大小、位置，PPLs的CT掃描外觀和支氣管鏡醫(yī)生的經(jīng)驗。來自臺灣的一項研究提示，ROSE可以提高R-EBUS對PPLs的診斷率，特別是對診斷困難的PPLs:病灶直徑小于3 cm，支氣管征象陰性，位于右肺尖和左肺尖后段，探頭靠近處伴有胸腔積液的PPLs。在這項研究中，R-EBUS聯(lián)合ROSE具有較高的診斷效果，診斷率在53%～94%。ROSE提高了所有相關(guān)專家的診斷能力，特別是難以觸及的具有挑戰(zhàn)性的病例，操作者可以根據(jù)ROSE結(jié)果改變穿刺部位、穿刺深度或穿刺角度。R-EBUS引導(dǎo)下的TBB沒有實時超聲引導(dǎo)下的采樣，使用R-EBUS引導(dǎo)下TBB鉗采集的標(biāo)本比EBUS-TBNA采集的標(biāo)本大，且使用ROSE后可降低支氣管肺泡灌洗(BAL)的比例，避免額外的診斷程序，降低支氣管鏡的并發(fā)癥發(fā)生率而不損失診斷率。盡管BAL等額外診斷程序的比例降低了，但ROSE組并不能縮短支氣管鏡檢查時間，因為ROSE的涂片準(zhǔn)備和復(fù)查需要時間[22]。另一項R-EBUS聯(lián)合ROSE的研究也提示，ROSE可提高診斷率，縮短手術(shù)時間，且未觀察到嚴(yán)重的手術(shù)相關(guān)并發(fā)癥，如氣胸和出血，R-EBUS聯(lián)合ROSE是診斷肺周圍病變是一種安全有效的方法[23]。

目前，氣管鏡對PPLs的診斷率仍然不足，為了提高氣管鏡的診出率，一項納入了45例患者的研究聯(lián)合支氣管超聲(EBUS)、虛擬支氣管鏡導(dǎo)航(VBN)和ROSE等技術(shù)，提示聯(lián)合使用這些技術(shù)可能有助于肺癌的診斷[24]。電磁導(dǎo)航支氣管鏡(ENB)常常和R-EBUS聯(lián)合使用，是用于周圍型肺部病灶診斷的新興技術(shù)，一項國內(nèi)最新研究顯示，電磁導(dǎo)航支氣管鏡活檢聯(lián)合 ROSE 更適用于肺外周型孤立性結(jié)節(jié)的診斷[25]。全肺實時診療導(dǎo)航(Lung-Pro)支氣管鏡技術(shù)是通過對患者薄層高分辨率CT數(shù)據(jù)進行三維重建，再結(jié)合虛擬支氣管鏡技術(shù)，深入到達12～14級支氣管結(jié)節(jié)部位，實現(xiàn)肺部病灶的實時導(dǎo)航和精確定位，一項國內(nèi)的研究表明，Lung-Pro導(dǎo)航可精確抵達病灶取得病理組織，有較高的診斷率，且有導(dǎo)航及手術(shù)時間短、安全、并發(fā)癥少等優(yōu)點，與ROSE結(jié)合可提高取樣質(zhì)量，減少活檢、穿刺次數(shù)，從而減少并發(fā)癥發(fā)生[26]。

PPLs的診斷一直是臨床的挑戰(zhàn)，機器人輔助的支氣管鏡平臺已經(jīng)被開發(fā)出來，有可能提高PPLs的診斷率。一項前瞻性、多中心試點的研究，在PPLs 1～5 cm大小的患者中使用了一種機器人支氣管鏡系統(tǒng)，該系統(tǒng)具有母女配置。主要終點是利用R-EBUS成像成功定位病變和觀察手術(shù)相關(guān)不良事件的發(fā)生率，所有病例均采用ROSE，ROSE確診時僅經(jīng)支氣管針吸即可；當(dāng)ROSE不能診斷時，使用機器人平臺進行經(jīng)支氣管活檢，然后由研究者自行決定常規(guī)引導(dǎo)的支氣管鏡入路。54例中有53例有R-EBUS影像。53例患者中51例(96.2%)病灶定位成功。這是首個對PPLs患者進行機器人支氣管鏡檢查的前瞻性、多中心研究。96.2%的病例成功進行了病灶定位，不良事件發(fā)生率與傳統(tǒng)的支氣管鏡手術(shù)相當(dāng)[27]。

上述研究提示，對于取材較困難的肺外周性病變，在使用各種介入肺臟病學(xué)臨床檢查取材時聯(lián)合使用ROSE，可以提高診斷率、減少操作流程，但仍需更多的大樣本研究。

3 結(jié)合其他方法的ROSE

傳統(tǒng)意義上的ROSE是一種細胞學(xué)診斷方法，然而，到目前為止，還沒有建立在氣管鏡檢查中對TBB標(biāo)本進行快速現(xiàn)場組織病理學(xué)診斷的方法。有研究顯示了未來組織病理學(xué)現(xiàn)場評價開發(fā)的價值，基于探針的共聚焦激光顯微內(nèi)鏡(pCLE)是一種新穎的、無創(chuàng)的技術(shù)，在支氣管鏡檢查中提供實時肺成像，采用吖叮黃對TBB標(biāo)本進行染色，利用pCLE對離體標(biāo)本進行良惡性結(jié)構(gòu)評估，根據(jù)細胞密度和核大小差異對良惡性病變進行分類，并確定是否可以通過pCLE對TBB標(biāo)本進行快速的組織病理學(xué)診斷。對36例標(biāo)本研究后顯示對惡性腫瘤的敏感性為91.3%，特異性為76.9%。因此認為pCLE可以作為一種工具在支氣管鏡檢查中用于快速的組織病理學(xué)現(xiàn)場診斷[28]。

快速現(xiàn)場診斷對早期肺癌是非常必要的，有學(xué)者研究了一種新的診斷照明納米技術(shù)，他們通過EBUS-TBNA、常規(guī)氣管鏡等獲取的淋巴結(jié)、癌組織和異常肺內(nèi)病變中提取組織標(biāo)本，制備了30例患者的30份組織標(biāo)本，隨后將CytoViva?照明納米技術(shù)應(yīng)用于每個活檢組織切片。細胞viva軟件一旦為每個實體組織創(chuàng)建了特定的光譜庫，就能夠在隨后的成對的同一疾病的幻燈片中再次識別出同一疾病。對該技術(shù)的進一步評價可以使這種照明納米技術(shù)成為一種有效的快速現(xiàn)場診斷工具。DARWI-CHE等[29]目前已經(jīng)制作了一種探針，可以通過支氣管鏡的工作通道插入，其能夠創(chuàng)建探針接觸到的任何組織的光譜庫，而不需要進行組織取樣和準(zhǔn)備檢查的載玻片，然而還需大量的臨床試驗以檢測該技術(shù)的優(yōu)缺點。

一項國內(nèi)的研究探討應(yīng)用xTAG70plex液相芯片技術(shù)對非小細胞肺癌(NSCLC)患者的ROSE細胞學(xué)制片進行EGFR、KRAS和PIK3CA基因檢測的可行性及其臨床價值，結(jié)果顯示除1例在組織學(xué)標(biāo)本檢出為KRAS突變而在配對的 ROSE細胞學(xué)標(biāo)本沒有檢測出來的病例外，其他病例基因突變檢測結(jié)果均相同，2種標(biāo)本EGFR基因突變檢測結(jié)果一致率為100%，KRAS基因突變檢測結(jié)果一致率為98.7%。提示xTAG70plex液相芯片技術(shù)可以有效地檢測ROSE 細胞學(xué)制片EGFR、KRAS和PIK3CA的基因突變狀態(tài)，對于NSCLC患者，ROSE細胞學(xué)制片可以作為組織學(xué)替代標(biāo)本進行基因檢測[30]。

上述最新的研究提示ROSE發(fā)展的新方向不僅僅是限于細胞學(xué)的現(xiàn)場診斷及評估，還應(yīng)該向現(xiàn)場組織病理學(xué)、更具分辨性的光譜分析、基因分析等方向發(fā)展。

4 結(jié)語與展望

ROSE作為一種以細胞學(xué)為背景的快速現(xiàn)場評價，在診斷性介入肺臟病學(xué)中已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用，雖然存在爭議，但對所得標(biāo)本滿意度進行快速評價、得出初步診斷和優(yōu)先策略方面的優(yōu)勢是有目共睹的。如何更好地應(yīng)用ROSE，規(guī)范的取材、印染、讀片技術(shù)都很關(guān)鍵，未來希望有更嚴(yán)謹?shù)难芯恳詭椭贫ǜ敿毜闹改弦?guī)范上述操作過程。ROSE應(yīng)用于c-TBNA的優(yōu)勢較EBUS-TNBA更明顯，這可能是由于EBUS-TBNA本身已具有較高的診斷率。對于取材較困難的肺外周性病變，ROSE聯(lián)合R-EBUS、VBN、ENB、Lung-Pro、機器人輔助的支氣管鏡平臺等新的診斷學(xué)介入方法的優(yōu)勢更為明顯。另外，ROSE發(fā)展的新方向不僅僅是限于細胞學(xué)的現(xiàn)場診斷及評估，還應(yīng)向現(xiàn)場組織病理學(xué)、更具分辨性的光譜分析、基因分析等各方向發(fā)展，以豐富診斷方法，提高肺部疾病診斷率。ROSE是一項簡單有復(fù)雜的技術(shù)，存在更多可能性，值得開展更多深入及拓展性的研究。