郭君燕 綜述，戴一揚 審校

(浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第四醫(yī)院，浙江 義烏 322000)

消化道腫瘤是臨床常見的一大類腫瘤，在全球發(fā)病率前十位的腫瘤中占50%，且死亡人數(shù)均較高[1]，因此，早期診斷消化道腫瘤對于改善預(yù)后、減輕社會壓力和疾病負擔(dān)具有重要意義。外周血游離核酸(ccfNAs)是指存在于人體血液循環(huán)中的游離于細胞外的微量內(nèi)源性或外源性核酸片段，包括循環(huán)游離DNA和循環(huán)游離RNA等，本文將從上述2個方面入手，對ccfNAs在消化道腫瘤診斷方面的應(yīng)用做一綜述。

1 循環(huán)游離DNA

1.1概述 1948年，MANDELD等[2]首次發(fā)現(xiàn)，在血漿和血清中存在著游離DNA(cfDNA)。cfDNA是一種胞外DNA，主要來自于細胞的壞死和凋亡，在外周血中的水平隨著年齡的增長而增加，且當(dāng)機體處于某些疾病或特殊狀態(tài)如創(chuàng)傷、膿毒癥、無菌性炎癥、氧化應(yīng)激、運動、腫瘤等情況時也可升高[3]。在cfDNA中存在著一類位于血液循環(huán)中的來自腫瘤基因組的DNA片段，稱為循環(huán)腫瘤DNA(ctDNA)。ctDNA僅占cfDNA的一小部分(有時小于0.01%)，半衰期通常小于2 h，主要來源于凋亡或壞死的腫瘤細胞、腫瘤細胞釋放DNA入血及循環(huán)腫瘤細胞裂解等途徑，可攜帶有突變、插入、缺失、重排、拷貝數(shù)異常和甲基化等基因變異特征[4]。

1.2分離與檢測 cfDNA在血清中的含量遠高于血漿，但由于易受到基因組DNA(gDNA)的污染，現(xiàn)有的證據(jù)更推薦將血漿作為分離檢測的最佳標(biāo)本[5]，其分離方法有相分離法、基于硅膜的離心柱法和基于磁珠的分級篩選法。

目前,已有研究表明，在消化道腫瘤患者的外周血中可以檢測到cfDNA且與健康人群相比存在著DNA片段的差異[6]。其檢測方法通常包含兩大類：一類是以聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)為基礎(chǔ)的數(shù)字PCR(dPCR)、微滴式數(shù)字PCR(ddPCR)、實時熒光定量PCR(qRT-PCR)、乳液微滴數(shù)字分析技術(shù)(BEAMing)等，另一類是以二代基因測序(NGS)為基礎(chǔ)的標(biāo)記擴增深度測序(TAm-Seq)、癌癥個體化深度測序(CAPP-Seq)、全基因組測序(WGS)、全外顯子測序(WES)等技術(shù)。

1.3cfDNA在消化道腫瘤診斷中的應(yīng)用

1.3.1cfDNA濃度 邱蘊文等[7]發(fā)現(xiàn)食管癌(EC)患者cfDNA濃度及完整性均高于食管良性病變及健康對照組，聯(lián)合CEA和SCC后靈敏度可提高至95.6%和94.1%，表明cfDNA濃度可作為食管癌診斷的潛在生物標(biāo)記。QIAN等[8]的研究指出Ⅰ期胃癌(GC)患者的cfDNA水平是健康人群的6倍且診斷效率顯著高于腫瘤標(biāo)志物如CEA、CA19-9、CA72-4和CA50。此外，YAN等[9]發(fā)現(xiàn)，原發(fā)性肝細胞癌(HCC)患者的cfDNA水平高于肝硬化患者，且血漿cfDNA與年齡、甲胎蛋白(AFP)聯(lián)合檢測HCC的診斷效能高于單用cfDNA或AFP。上述多項研究結(jié)果表明，cfDNA濃度在消化道腫瘤患者中顯著升高，單一cfDNA或聯(lián)合腫瘤標(biāo)志物可作為消化道腫瘤診斷的檢測指標(biāo)。鄭照正等[10]發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌(CRC)患者的cfDNA濃度顯著高于健康對照組，進一步將Ⅰ期、Ⅰ+Ⅱ期、Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ期以及Ⅰ-Ⅳ期CRC患者分別作為疾病組繪制ROC曲線，其AUC分別為0.667、0.636、0.685及0.753，提示盡管cfDNA濃度具有一定的輔助診斷價值，但作為早期診斷指標(biāo)的準確性仍較低，或?qū)?dǎo)致部分患者漏診。

1.3.2基因突變 HU等[11]利用血漿cfDNA檢測腫瘤突變負荷(TMB)，發(fā)現(xiàn)右側(cè)結(jié)腸癌較左側(cè)更高，聯(lián)合cfDNA濃度及CEA對CRC早期檢測的AUC高于單用CEA，表明cfDNA對疾病的定位也有一定幫助。QU等[12]開發(fā)了一種名為HCC篩檢的技術(shù)，通過聯(lián)合檢測cfDNA突變和血清生物標(biāo)志物，旨在從無癥狀的HBsAg陽性個體中篩查出HCC患者，該項目在合并肝結(jié)節(jié)和(或)AFP水平升高的患者中檢測靈敏度為85%，特異度為93%，進一步將此方法應(yīng)用于隊列研究，發(fā)現(xiàn)在HBsAg陽性且肝臟超聲和血清甲胎蛋白水平正常的個體中的檢測敏感度為100%，特異度94%。WANG等[13]發(fā)現(xiàn)，單獨使用KRAS基因突變對Ⅰ～Ⅳ期胰腺癌患者診斷的敏感性依次為30%、46%、40%及83%，而聯(lián)合CA19-9后其敏感性可提高至82%、82%、83%和89%，表明外周血游離核酸基因突變檢測聯(lián)合血清腫瘤標(biāo)志物對消化道腫瘤的早期診斷也具有一定的潛在價值。

1.3.3cfDNA甲基化 DNA甲基化是一種常見的表觀遺傳學(xué)改變，通常是指通過DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的作用介導(dǎo)CpG二核苷酸胞嘧啶5′碳位甲基化形成5-甲基胞嘧啶的過程，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中器重要作用。

LI等[14]發(fā)現(xiàn)，CDH1、DAPK、RASSF1A、RAR-β、p16基因甲基化在食管鱗癌(ESCC)患者中的檢測水平較對照組高，其中前三者對ESCC診斷的靈敏度為62.2%～84.4%，特異度為80.0%～93.3%，若聯(lián)合檢測上述2種或2種以上基因甲基化，在將特異度提高至100%的同時仍可維持較高的靈敏度。另一項研究表明，CDKN2A、CDH1、DAPK1基因甲基化單獨診斷GC的靈敏度為28.13%～40.62%，特異度為61.23%～70.21%，三者聯(lián)合后靈敏度和特異性均較高，可作為GC診斷的分子標(biāo)志物[15]。SALIMINEJAD等[16]發(fā)現(xiàn)，P16、RASSF1A、RPRM、RUNX3基因甲基化在GC患者中的表達水平有所升高，單獨檢測RPRM基因和RUNX3基因甲基化對早期胃癌的診斷有一定幫助，同時聯(lián)合二者將進一步提高診斷水平。

甲基化SEPT9基因(mSEPT9)可參與細胞的凋亡、增殖等多項過程，是調(diào)控腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因子，現(xiàn)已被美國FDA批準應(yīng)用于結(jié)腸癌的早期篩查，但現(xiàn)有的研究也不局限于結(jié)腸癌。SONG等[17]將mSEPT9檢測運用于EC、GC、CRC及HCC患者后發(fā)現(xiàn)其檢測敏感性分別為42.6%、47.7%、76.6%及77.7%，提示mSEPT9對CRC及HCC的檢測效力相當(dāng)，而在GC和EC中的檢測效力較弱。而在早期胃癌(EGC)患者中，曹長琦等[18]發(fā)現(xiàn)，mSEPT9甲基化的陽性率為28.4%，與RNF180聯(lián)合后可提高檢測靈敏度至40.5%。沈志明等[19]發(fā)現(xiàn)，HCC患者的SEPT9甲基化陽性率高于膽管細胞癌和健康對照組，聯(lián)合GGT對HCC診斷的靈敏度為88.6%，特異度為68.3%，表明該基因在提高HCC診斷水平的同時也有助于與膽管細胞癌的鑒別診斷。OUSSALAH等[20]將mSETP9應(yīng)用于肝硬化患者HCC檢測的AUC為0.940，其中對于巴塞羅那分期為A期的患者，AUC為0.863。此外，對于HCV相關(guān)肝硬化患者而言，mSETP9對HCC檢測的準確性高于AFP，提示在cfDNA甲基化檢測一定程度上能更靈敏的反應(yīng)腫瘤的信息。

2 循環(huán)游離RNA

2.1概述 CfRNA是指存在于血液、尿液、肺泡灌洗液、胸腹水等體液中的胞外RNA(exRNA)，主要包括信使RNA(mRNA)、小RNA(miRNA)、長鏈非編碼RNA(IncRNA)、環(huán)狀RNA(circRNA)等，其中存在于血液中的游離RNA即為循環(huán)游離RNA。cfRNA的來源目前仍尚未明確，ZHOU等[21]開展的體外試驗發(fā)現(xiàn)，exRNA濃度可在缺氧及細胞代謝速率增加時升高，這或許可以解釋cfRNA在腫瘤患者中升高的現(xiàn)象，但該發(fā)現(xiàn)還未在在體試驗中得到證實。

2.2分離與檢測 由于血漿中存在大量的核糖核酸酶，cfRNA通常與脂質(zhì)、蛋白質(zhì)或膜泡結(jié)合以復(fù)合物的形式存在以避免被降解，高純度的RNA分離與檢測現(xiàn)今仍是一大難題[22]。常用的分離方法主要包括異硫氰酸胍-酚提取法、胍鹽-β巰基乙醇提取法、硅膠膜離心吸附柱法、Trizol法等，檢測方法與cfDNA相類似，主要為各類PCR及二代測序(NGS)技術(shù)，其中qRT-PCR是RNA定量檢測的金標(biāo)準[23]。

2.3CfRNA在消化道腫瘤診斷中的應(yīng)用

2.3.1循環(huán)mRNA 循環(huán)mRNA水平在消化道腫瘤患者與健康人群中的表達也存在差異。麗敏等[24]發(fā)現(xiàn)，人端粒反轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)mRNA對GC診斷具有較高的靈敏度(84.8%)和特異度(82.7%)，與傳統(tǒng)的腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合后還可以有效降低胃癌漏診率。ABDEL GHAFAR等[25]的研究表明，血清中Metadherin mRNA診斷CRC的敏感性和特異性均高于糞便潛血檢測及CA199、CEA等腫瘤標(biāo)志物，表明循環(huán)mRNA檢測在某種程度上優(yōu)于傳統(tǒng)的腫瘤標(biāo)志物。

此外，HAN等[26]發(fā)現(xiàn)，血清RIPK3 mRNA可輔助AFP提高早期肝癌的診斷效率，但目前仍缺乏進一步的前瞻性多中心臨床試驗。DENG等[27]發(fā)現(xiàn)，MCM2和NUSAP1 mRNA在胰腺癌細胞系和組織中的表達水平均較健康人群升高，但仍缺乏血清學(xué)研究證據(jù)，表明循環(huán)mRNA也可作為消化道腫瘤診斷的標(biāo)志物，但仍需要更多的臨床研究結(jié)果證實。

2.3.2循環(huán)miRNA miRNA作為短單鏈RNA序列，可與靶基因的3′-UTR進行堿基互補配對介導(dǎo)調(diào)控原癌基因、抑癌基因等下游靶基因的表達，由于與下游靶基因聯(lián)系密切，可將miRNA失調(diào)作為診斷工具早期識別腫瘤的發(fā)生。ZHANG等[28]的研究顯示，miR-21、miR-223、miR-375可作為食管癌尤其是0～Ⅰ期和Tis～T1期ESCC診斷的生物標(biāo)志物，其AUC分別為0.80、0.73、0.69。2010年TSUJIURA等[29]的研究證實miR-106b在GC患者中表達升高，而let-7a則表達下降，利用miR-106b/let-7a比值對GC患者診斷的AUC為0.879。有研究提出可通過聯(lián)合miR-23a-3p、miR-27a-3p、miR-142-5p和miR-376c-3p，這4種miRNA對CRC進行檢測，在Ⅰ期或Ⅱ期CRC患者中也顯示出較高的診斷性能[30]。

3 結(jié)語與展望

綜上所述，外周血游離核酸檢測在消化道腫瘤的早期診斷方面具有深遠而廣泛的應(yīng)用價值。但現(xiàn)有研究仍存在一定的局限性。一方面，ccfNAs的檢測技術(shù)缺乏相關(guān)行業(yè)標(biāo)準，不同的研究在樣本采集、保存、運輸及操作方面均有所區(qū)別，使得研究結(jié)果之間存在較大差異；另一方面，多數(shù)研究納入的樣本量過小，缺乏多中心、大規(guī)模的前瞻性臨床研究，使得研究結(jié)果的臨床應(yīng)用及推廣受到一定限制。目前,ccfNAs的研究正處于高速發(fā)展之中，相信隨著現(xiàn)有技術(shù)及研究的不斷深入，在不久的將來ccfNAs可廣泛應(yīng)用于臨床，在消化的腫瘤的早期診斷及精準治療方面發(fā)揮巨大的作用。