劉文光

（內(nèi)蒙古鄂爾多斯市伊金霍洛旗動物疫病預(yù)防控制中心，內(nèi)蒙古 鄂爾多斯 017200）

馬梨形蟲病又稱血孢子蟲病或焦蟲病，是通過媒介蜱傳播而引發(fā)的一種馬屬動物紅細(xì)胞內(nèi)的血液原蟲病。該病的主要癥狀為急性溶血性貧血、呼吸受阻、高熱以及黃疸等，若發(fā)生急性感染，馬匹極容易死亡。近年來，隨著科學(xué)技術(shù)水平的不斷提升，已逐步建立一套較為完善的馬梨形蟲病診斷技術(shù)，為馬梨形蟲病的防治奠定了堅實的基礎(chǔ)。

1 馬梨形蟲病概述

1.1 病原特點

馬梨形蟲病是由硬蜱傳播巴貝斯科和泰勒科原蟲引起的血液原蟲病，病原屬頂復(fù)器門梨形蟲綱梨形蟲目巴貝斯科和泰勒科。不同種蟲的形態(tài)特征存在差異。常見的形態(tài)有圓形、梨形、桿形、阿米巴形。它們常寄生于哺乳動物紅細(xì)胞內(nèi)。泰勒蟲還寄生于白細(xì)胞或組織細(xì)胞內(nèi)。石榴體為多核蟲體，是在組織細(xì)胞或白細(xì)胞內(nèi)裂殖生殖形成的裂殖體。常見的病原體包括雙芽巴貝斯蟲和泰勒蟲。

1.1.1 基體形態(tài)

（1）雙芽巴貝斯蟲大型梨形蟲，長度大于紅細(xì)胞半徑；形態(tài)多樣，包括圓形、梨籽形、球形等；典型蟲體為兩個梨籽形蟲體，以尖端相對形成銳角；寄生于紅細(xì)胞中央，染色質(zhì)位于蟲體邊緣；每個紅細(xì)胞內(nèi)寄生數(shù)量為1～3個，特殊情況為6～7個。

（2）泰勒蟲病 小型梨形蟲，大小為1.5～2.1μm×0.7μm，小于紅細(xì)胞半徑；形態(tài)多樣，包括圓形、梨籽形、球形等。

1.1.2 生活史 梨形蟲以蜱蟲作為傳播媒介，其生活史相對復(fù)雜。蟲體多選擇在紅細(xì)胞內(nèi)以成對出芽的形式繁殖。寄生有梨形蟲的紅細(xì)胞被蜱蟲吸血食入后在蜱蟲腸內(nèi)僅在1h內(nèi)就可以完成配子生殖，形成合子。96h內(nèi)蟲體隨血淋巴進(jìn)入蜱蟲的卵內(nèi)，孵化出幼蜱。幼蜱發(fā)育為若蜱，在唾液腺內(nèi)發(fā)育成子孢子。子孢子吸食健康牛馬等哺乳動物的血液，導(dǎo)致哺乳動物造成梨形蟲感染。

1.2 流行特點梨形蟲的生活史決定了其通過終末宿主硬蜱傳播。一種是利用蜱卵傳播，即通過蜱蟲吸食馬屬動物血液而使梨形蟲進(jìn)入蜱蟲體內(nèi)并在其中生長以及繁殖，待繁殖后期利用蜱卵而傳播給蜱蟲后代，后代在吸血過程中通過分泌唾液而將梨形蟲傳遞至馬屬動物體內(nèi)。另一種為期間傳播，即幼蜱或者若蜱在吸食感染馬屬動物血液后，可迅速成長為若蜱或成蜱，接著通過吸食馬屬動物血液而傳播。在我國，每年的3、4月，馬梨形蟲病例逐漸增多，待5月份后其流行逐漸停止。目前，國內(nèi)已查明的梨形蟲的主要傳播媒介為微小牛蜱，它是馬、牛等動物梨形蟲并感染的主要宿主蜱。通過梨形蟲的生活史可以分析出梨形蟲并主要通過宿主蜱下一代傳播本病。因此，馬梨形蟲病的發(fā)生與流行頻率與微小牛蜱每年的繁殖代數(shù)保持一致。馬梨形蟲病多見于2歲以內(nèi)的成年馬，死亡率地域成年牛。馬梨形蟲病存在帶蟲免疫的現(xiàn)象，但帶蟲免疫效果表現(xiàn)出不穩(wěn)定、易復(fù)發(fā)的特征。

2 臨床癥狀

馬梨形蟲病的潛伏期為14～20d，初期有稽留熱癥狀。體溫可升至30～41.8℃。主要癥狀為高熱、黃疸、貧血以及心肺機能障礙。根據(jù)其臨床癥狀的不同可以將其劃分為心肺型以及胃腸型兩種。在發(fā)病初期，兩種類型病例均表現(xiàn)為體溫升高、精神萎靡、食欲不佳、結(jié)膜潮紅、腹痛難耐、顫抖不止。（1）心肺型病例還會表現(xiàn)為呼吸以及心跳頻率加快，而胃腸型還需表現(xiàn)為咽喉腫痛。發(fā)病中期，病畜體溫超過40℃，出現(xiàn)稽留熱現(xiàn)象。心肺型病例心率增快并表現(xiàn)為心律不齊，心跳加快、精神不振、食欲減少，可視粘膜黃染，眼瞼部有出血斑點，唇部及舌面存在出血點，尿液顏色為黃棕色，部分公畜陰囊明顯腫大。（2）胃腸型病畜在發(fā)病中期的主要癥狀為流涕及流涎，還表現(xiàn)出先便秘后腹瀉的癥狀，其糞便內(nèi)夾雜有黏液或血液。中期行動上出現(xiàn)搖擺不穩(wěn)的癥狀。待發(fā)病后期食欲廢絕、反應(yīng)遲鈍、臥地不起，病例體溫降低，血液日漸稀薄，及時蚊蟲叮咬亦出血不住，最終因衰竭而死亡。

3 診斷方法

通過流行特點以及臨床癥狀可進(jìn)行初診，利用實驗室診斷方法可以確診。

3.1 病原組織學(xué)檢測

3.1.1 血液涂片鏡檢 在馬梨形蟲病急性感染期，血液涂片鏡檢是最為可靠的一種確診方法。此方便操作簡便，僅需在被檢測動物耳尖部位采集少量血液，待染色后觀察其紅細(xì)胞，即可明確其是否感染有梨形蟲。血液涂片鏡檢方法應(yīng)用較為廣泛。

3.1.2 淋巴結(jié)穿刺檢查法 馬梨形蟲病臨床有淋巴腫大的表現(xiàn)。淋巴結(jié)穿刺檢查法主要用于判斷涂片內(nèi)是否存在裂殖體。其具體操作過程如下：（1）選擇淋巴腫大部位的皮膚做剪毛、消毒處理；（2）準(zhǔn)備10mL注射器及較粗的針頭；（3）在被檢測動物體表下腫大淋巴結(jié)部位穿刺，抽取淋巴組織；（4）拔出針頭，將內(nèi)容物擠出到載玻片上，（5）用內(nèi)容物制作組織涂片后固定，待染色后放置在顯微鏡下觀察，尋找樣本中是否存在柯赫氏藍(lán)體病原體。若涂片內(nèi)存在裂殖體即可確診。淋巴結(jié)穿刺檢查法對檢查時機要求較為嚴(yán)格，因此通常用于輔助性檢測。該方法多應(yīng)用于早期馬梨形蟲病的診斷。

3.2 血清學(xué)檢測

3.2.1 補體結(jié)合試驗 該試驗是一種傳統(tǒng)的血清學(xué)檢測方法，其敏感性強、特異性高、判斷結(jié)果明確，應(yīng)用極為廣泛，適用于疫病中后期的檢測。補體結(jié)合試驗不僅可用于檢測已感染動物，同時對健康帶蟲動物敏感性亦較高。

3.2.2 免疫熒光抗體檢測 免疫熒光抗體檢測方法主要用于診斷外表健康、無明顯臨床癥狀的帶蟲宿主，其敏感性以及特異性較強，檢測準(zhǔn)確率較高，缺點為操作復(fù)雜，熒光抗體所需要的成本較高。

3.3 核酸檢測

3.3.1 PCR檢測法PCR檢測法是采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)進(jìn)行病原學(xué)檢測的方法。PCR通過一對特異性引物對特異性靶基因進(jìn)行體外DNA擴(kuò)增的技術(shù)。Figueroa于1922年建立了檢測雙芽巴貝斯蟲感染的PCR方法。方式的檢測靈敏度達(dá)到了10pg蟲體基因組的量。Aktas等于2005年通過PCR技術(shù)檢測野外具尾扇頭蜱感染羊泰勒蟲的情況，發(fā)現(xiàn)在192個受檢蜱中感染羊泰勒蟲的陽性率為19.27%。Willams和Welsh對PCR技術(shù)通過建立DNA隨機擴(kuò)增技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)。他設(shè)計2對引物對目的片段進(jìn)行兩次擴(kuò)增。這次改進(jìn)提升了PCR技術(shù)測定雙芽巴貝斯蟲的靈敏性。Liu等于2006年建立巢氏PCR技術(shù)對國內(nèi)湖北境內(nèi)水牛巴貝斯蟲的流行病學(xué)進(jìn)行了調(diào)查，確定水牛的巴貝斯蟲染蟲率為10-8時可檢測到基因組DNA。Andy Alhassan等于2005年采用18SrRNA建立可同時檢測多種梨形蟲的PCR方法。該方法也是依據(jù)擴(kuò)增目的條帶大小的不同來鑒別梨形蟲的感染情況。這種檢測方法操作簡單快速，測試結(jié)果與其他方法相同。Chul K等用Realtime PCR方法對來自加納和巴西兩個地區(qū)的馬匹進(jìn)行血液原蟲的檢測，檢出馬泰勒蟲陽性檢出率為100%。劉啟生建立的實時熒光PCR檢測方法，用快速定性檢測巴貝斯蟲（Babe-sia bovise、Babesia bigemina）。這兩種方法的檢測靈敏性更，目前以廣泛應(yīng)用于蜱蟲傳播的梨形蟲病的初期診斷，成為馬梨形蟲病臨床快速檢測的重要手段。與傳統(tǒng)的血液涂片鏡檢方法相比，PCR檢測法具備更高的敏感性，同時其操作簡便快速，應(yīng)用較為普遍。雖然PCR法可快速鑒定目標(biāo)病原體，但是這種方法依賴于檢測某一部分序列，未足夠精準(zhǔn)量化整個靶序列，在其具體應(yīng)用過程中，PCR技術(shù)無法很好的量化感染程度。

3.3.2 環(huán)介等溫擴(kuò)增技術(shù) 環(huán)介等溫擴(kuò)增技術(shù)是一種新興快速擴(kuò)增技術(shù)，該技術(shù)敏感性較強、操作簡便并且快速，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于疫病檢測以及食品安全檢測當(dāng)中，這一檢測方法非常適宜開展現(xiàn)場檢測。環(huán)介等溫擴(kuò)增技術(shù)可以對PCR技術(shù)存在的部分缺點有效克服，自建立以來即開始在各種核酸DNA檢測中得到應(yīng)用，其在馬梨形蟲病的檢測當(dāng)中亦發(fā)揮了積極的作用。

3.3.3 反向線性印跡技術(shù)（RLB）反向線性印跡技術(shù)也叫斑點印跡法或點印跡法。它是一種以PCR和針探雜交為基礎(chǔ)的分子診斷技術(shù)。采用反向線性印跡技術(shù)檢測馬梨形蟲病的原理與PCR類型，也是根據(jù)設(shè)計不同特異性擴(kuò)增產(chǎn)物與針探雜交來檢定梨形蟲病病原體。謝俊仁建立的反向線性印跡技術(shù)檢測馬梨形蟲病的方法，可同時對多個樣本進(jìn)行檢測。樣品最多可達(dá)45個。同時檢測樣本的方法提高了馬梨形蟲病的檢出效率，為馬梨形蟲病的鑒別和快速確診奠定了基礎(chǔ)。在調(diào)查馬梨形蟲的流行病學(xué)并對其進(jìn)行臨床試驗診斷時，可能會發(fā)現(xiàn)部分動物同時感染有多種血液原蟲病原，此時即可應(yīng)用反向線性印跡技術(shù)。這一技術(shù)主要是在印跡膜上固定特異性探針，采用放射物質(zhì)標(biāo)記PCR引物，接著擴(kuò)靶DNA，待膜上探針與擴(kuò)增產(chǎn)物特異性雜交后，可通過生物素顯影或者放射顯影的方式以確定PCR產(chǎn)物內(nèi)核酸序列差異。反向線性印跡技術(shù)的在馬梨形蟲病檢測中的應(yīng)用優(yōu)勢是結(jié)果準(zhǔn)確、檢出快速，局限在于操作技術(shù)難度高、過程復(fù)雜，對專業(yè)技術(shù)人員要求極高，不便于基層推廣。

4 綜合診斷

4.1 臨床診斷根據(jù)臨床癥狀結(jié)合病死馬尸體剖檢進(jìn)行確診。病死馬尸體器官組織體有明顯的實質(zhì)性病變?；祭嫘蜗x病的病死馬匹有全身明顯的實質(zhì)性器官腫大、出血癥狀。最為典型的癥狀是胃黏膜腫脹，出現(xiàn)血斑，有高粱至蠶豆大面積的潰瘍發(fā)生。病變部位邊緣隆起，呈現(xiàn)紅色。中間凹，呈灰色。感染嚴(yán)重的馬匹病灶潰瘍面積超過胃部的50%。其中以泰勒蟲病潰瘍面積≥50%的癥狀極為典型。

4.2 特征性診斷根據(jù)臨床癥狀結(jié)合病死馬實體器官組織抹片檢查找到石榴體確診。

4.3 病原學(xué)診斷根據(jù)臨床癥狀結(jié)合血液病原檢查蟲體的結(jié)果確診。發(fā)病后1～2d高熱期時可采血進(jìn)行血液病原學(xué)檢查。馬梨形蟲病在臨床上沒有血紅蛋白尿的特征，黏膜黃疸癥狀也相對不明顯。

4.4 限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性技術(shù)（RFLP）限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性技術(shù)也是一種建立在PCR基礎(chǔ)上的病原學(xué)檢測基礎(chǔ)。該技術(shù)也需要通過設(shè)計合適的擴(kuò)增引物，通過擴(kuò)增片段的限制性內(nèi)切酶識別。它是目前馬梨形蟲病臨床檢測診斷中應(yīng)用最廣泛的技術(shù)。其應(yīng)用優(yōu)勢是敏感性好，可檢測多種媒介內(nèi)的梨形蟲病原體感染情況。該方法的實施是在PCR的基礎(chǔ)上，對不同的屬和種以不同的酶內(nèi)切后電泳條帶的不同加以分別。Gebels等于2000年用該技術(shù)對牛巴貝斯蟲、牛泰勒蟲進(jìn)行檢測。Jefferies等于2007年用該技術(shù)來對狗梨形蟲進(jìn)行鑒定。徐宗可用PCR-RFLP技術(shù)改進(jìn)后對羊梨形蟲進(jìn)行鑒定。PCR-RFLP技術(shù)的發(fā)展為梨形蟲病的流行病學(xué)調(diào)查、致病機理研究及診斷奠定了基礎(chǔ)。

PCR-RFLP技術(shù)在多類型梨形蟲混合感染的鑒定與診斷方面的應(yīng)用優(yōu)勢較為突出。其局限性在于鑒定操作工作量大。相對于傳統(tǒng)的RFLP技術(shù)，PCR-RFLP技術(shù)在梨形蟲臨床診斷方面的技術(shù)還有待進(jìn)一步研究。PCR-RFLP技術(shù)最為重要的價值在于發(fā)現(xiàn)了梨形蟲病的新蟲種與新基因型。在這方面的研究，可通過與DNA檢測技術(shù)的綜合性研究來實現(xiàn)。