李小妹，李 想，王利利，杜麗艷，宋愛林

甲狀腺癌（thyroid cancer，TC）是臨床多見的內(nèi)分泌系統(tǒng)惡性腫瘤，且發(fā)病率呈逐年增加趨勢(shì)，其中甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid of carcinoma，PTC）占80%～90%[1]。越來越多研究發(fā)現(xiàn)，PTC與鼠類肉瘤病毒癌基因同源物B1（v-raf murinesarcoma viral oncogene homolog B1，BRAF）基 因 突 變 存 在 相 關(guān) 性。隨 著BRAFV600E基因突變研究的深入，該突變已被證實(shí)是影響PTC侵襲性的危險(xiǎn)因素，且多中心臨床研究結(jié)果顯示，BRAFV600E基因突變與腫瘤侵襲性病理特征、復(fù)發(fā)、生存情況密切相關(guān)[2，3]，因此研究BRAFV600E基因突變的相關(guān)因素對(duì)于臨床治療具有重要指導(dǎo)意義。流行病學(xué)研究表明，長(zhǎng)期高碘攝入可增加PTC發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，而PTC中是BRAFV600E基因突變最常見、最有特異性遺傳突變[4]，故而可推測(cè)BRAFV600E基因突變與高碘攝入量存在相互關(guān)系。在臨床實(shí)踐發(fā)現(xiàn)仍有部分BRAFV600E突變型PTC患者有良好預(yù)后，表明BRAFV600E基因突變難以有效預(yù)測(cè)PTC患者預(yù)后情況[5]。PTC患者手術(shù)方式是影響預(yù)后重要因素，而病灶數(shù)目、病灶分布決定手術(shù)方式選擇，如單灶或者多灶位于一側(cè)腺葉者，以甲狀腺患側(cè)葉及峽部切除聯(lián)合患側(cè)中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)清掃術(shù)為主；多灶位于兩側(cè)者，則需行甲狀腺全切聯(lián)合雙側(cè)中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)清掃術(shù)[6]。目前，關(guān)于BRAFV600E基因突變與PTC患者病灶數(shù)目及碘攝入量關(guān)系尚不明確，因此筆者將通過實(shí)例進(jìn)一步探討和研究BRAFV600E基因突變與術(shù)后復(fù)發(fā)的關(guān)系，旨在為臨床治療提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 臨床材料

選擇2018年6月至2020年10月在邢臺(tái)醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校第一附屬醫(yī)院收治的248例PTC患者，其中男性68例，女性180例；年齡32～70歲，平均年齡52.28歲（標(biāo)準(zhǔn)差5.44歲）；腫瘤T分期，T1期148例，T2期61例，T3期30例，T4期9例；病灶數(shù)目，單病灶176例，多病灶72例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移57例。

選擇標(biāo)準(zhǔn)：①符合術(shù)后病理診斷為PTC，且接受碘放射治療；②患者均接受BRAFV600E基因檢測(cè)；③均初次接受甲狀腺手術(shù)，術(shù)前未曾接受過放化療及其他輔助治療；④臨床病理資料完整，且均完成3年隨訪；⑤患者均簽署知情同意書，且該研究已獲得倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①復(fù)發(fā)后再次手術(shù)或者因殘余癌灶而行二次手術(shù)；②合并其他部位非甲狀腺轉(zhuǎn)移性腫瘤；③合并有其他病理類型的TC；④頭頸部放射治療史及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；⑤未行中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)清掃。

1.1.2 主要試劑與儀器

BRAFV600E基因突變熒光試劑盒（檢測(cè)靈敏度為1%。廈門艾德生物醫(yī)藥科技股份有限公司，中國(guó)）。7500型聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）系統(tǒng)（Applied Biosystems，美國(guó)）。

1.2 方法

1.2.1 BRAFV600E突變基因檢測(cè)

于PTC手術(shù)中獲取PTC組織標(biāo)本。

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)檢測(cè)法進(jìn)行BRAFV600E突變基因檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)過程按試劑盒操作步驟進(jìn)行。借助Primer 5引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)引物。

PCR反應(yīng)體系共50μL，包括上、下游引物各2μL，0.25μL Taq酶，10μL 2×Taq PCR MasterMix，1μL DNA模版，2μL dNTP Mixture，無菌水定容至50μL。PCR擴(kuò)增條件：95℃×10 min；92℃×15 s，60℃×60 s，共45個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后，取5μL擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離，紫外燈檢查擴(kuò)增結(jié)果。根據(jù)突變情況分為突變組和未突變組。

1.2.2 觀察指標(biāo)

根據(jù)突變情況對(duì)患者進(jìn)行分組后，統(tǒng)計(jì)兩組癌灶平均大小、淋巴結(jié)陽性（指淋巴結(jié)清掃個(gè)數(shù)高于5個(gè)，檢測(cè)到至少5個(gè)淋巴結(jié)發(fā)生轉(zhuǎn)移）、T分期（tumor node metastasis classification）（參照第8版TNM系統(tǒng)[7]，T1為原發(fā)灶最大徑≤3 cm，T2為原發(fā)灶最大徑3～5 cm，T3為原發(fā)灶最大徑5～7 cm，T4為原發(fā)灶最大徑＞7 cm）、復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)分級(jí)[高風(fēng)險(xiǎn)：腫瘤不完全切除，輕微腺外侵犯，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)（＞3 cm）；中風(fēng)險(xiǎn)：輕微腺外侵犯，具有侵襲性組織學(xué)，血管侵犯或≥5個(gè)淋巴結(jié)（0.2～3.0 cm）；低風(fēng)險(xiǎn)：局限于腺內(nèi)的分化型甲狀腺癌，＜5個(gè)淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移（＜0.2 cm）[2]]、腺外侵犯（病理學(xué)檢查報(bào)告顯示腫瘤侵犯甲狀腺外纖維脂肪組織）、病灶數(shù)目、碘攝入量。

1.2.3 腫瘤無復(fù)發(fā)生存分析

對(duì)PTC患者進(jìn)行隨訪。分析病灶數(shù)目、碘攝入量、BRAFV600E基因突變與腫瘤無復(fù)發(fā)生存（relapse free survival，RFS）關(guān)系。根據(jù)病灶數(shù)目分組，分為單灶性組和多灶性組；根據(jù)突變情況分為突變組和未突變組；以尿碘值表示碘攝入量，采用過硫酸銨消化砷鈰催化分光光度法檢測(cè)尿碘值，以尿碘值中位數(shù)值為臨界值，將患者分為高碘攝入組和低碘攝入組。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。連續(xù)型正態(tài)分布計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)。腫瘤RFS分析采用Kaplan-Meier檢驗(yàn)，采用Cox多元回歸分析BRAFV600E基因突變相關(guān)危險(xiǎn)因素。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者基線資料比較

248例PTC患者中BRAFV600E基因突變178例（71.77%），未突變70例（28.23 %）。兩組患者的性別、年齡、癌灶平均大小、淋巴結(jié)陽性率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)分級(jí)、腺外侵犯、T分期、病灶數(shù)目及碘攝入量與BRAFV600E基因突變有關(guān)（P＜0.05）。見表1。

表1 兩組患者基線資料比較Tab.1 Comparison of baseline data between 2 groups

2.2 BRAFV600E基因突變相關(guān)因素Cox多元回歸分析

Cox多元回歸分析顯示，復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)分級(jí)、腺外侵犯、T分期、病灶數(shù)目及碘攝入量均是BRAFV600E基因突變相關(guān)危險(xiǎn)因素（P＜0.05）。見表2。

表2 BRAFV600E基因突變相關(guān)因素Cox多元回歸分析Tab.2 Cox multiple regression analysis of BRAFV600E gene mutation related factors

2.3 腫瘤無復(fù)發(fā)生存分析

2.3.1 基于BRAFV600E基因突變分層PTC患者的RFS分析

隨訪3年，共有54例患者復(fù)發(fā)。突變組與未突變組PTC患者的RFS曲線差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.295，P=0.038），突變組患者有更高的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，風(fēng)險(xiǎn)比（hazard ratio，HR）（95 % CI）=2.095（1.034～3.330）。見圖1。

圖1 突變組與未突變組PTC患者的RFS曲線比較Fig.1 Comparison of RFS curves between mutation group and non-mutation group of PTC patients

2.3.2 基于病灶數(shù)目分層PTC患者的RFS分析

病灶數(shù)目多灶性組與單灶性組PTC患者的RFS曲線差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.349，P=0.037），多灶性組患者有更高的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，HR（95%CI）=1.775（1.040～3.488）。見圖2。

圖2 多灶性組與單灶性組PTC患者的RFS曲線比較Fig.2 Comparison of RFS curves between multiple lesions group and single lesion group of PTC patients

2.3.3 基于碘攝入量分層PTC患者的RFS分析

高碘攝入量組（118例）與低碘攝入量組（130例）PTC患者的RFS曲線差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.602，P=0.032），高碘攝入量組患者有更高的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，HR（95%CI）=1.804（1.052~3.065）。見圖3。

圖3 高碘攝入量組與低碘攝入量組PTC患者的RFS曲線Fig.3 Comparison of RFS curves between high-iodine-intake group and low-iodine-intake group of PTC patients

3 討論

PTC屬于分化良好的惡性腫瘤，死亡風(fēng)險(xiǎn)較低，10年生存率高達(dá)90%，即使患者確診時(shí)已發(fā)生頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，仍具有較好預(yù)后情況[8]。PTC中約40%～80%患者存在BRAFV600E基因突變，BRAFV600E基因突變是PTC中最常見的遺傳學(xué)改變。BRAFV600E基因突變是PTC侵襲性分子機(jī)制的致癌基因，參與調(diào)控腫瘤侵襲性病理特征，影響腫瘤復(fù)發(fā)及預(yù)后，因此臨床上可根據(jù)BRAFV600E基因突變情況篩選高危人群，從而指導(dǎo)臨床精準(zhǔn)治療及預(yù)后評(píng)估。

筆者研究結(jié)果顯示基因突變發(fā)生率為71.77 %（178/248例），與既往研究結(jié)果相近[9，10]。BRAF基因位于人類7號(hào)染色體，其作用是編碼RAF家族絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，進(jìn)而調(diào)控絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）/細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK）信號(hào)通路，影響細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、分化、分裂等生物學(xué)過程。BRAF基因突變中T1799A點(diǎn)突變占90%以上，即第600位密碼子的谷氨酸替代纈氨酸（V600E），進(jìn)而導(dǎo)致編碼的激酶活化，促進(jìn)細(xì)胞的無限增殖、分裂，最終發(fā)生癌變，故而BRAFV600E基因突變對(duì)于PTC的發(fā)生、發(fā)展具有重要意義[11]。筆者研究結(jié)果顯示，復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)分級(jí)、腺外侵犯、T分期、病灶數(shù)目及碘攝入量與BRAFV600E基因突變有關(guān)（P＜0.05），且通過Cox多元回歸分析進(jìn)一步證實(shí)以上臨床病理特征均是BRAFV600E基因突變相關(guān)危險(xiǎn)因素 （P＜0.05）。Ayala MD等[12]研究表明，存在BRAFV600E基因突變的PTC患者，即使確診時(shí)處于疾病早期階段，腫瘤的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)也高于野生型（未發(fā)生基因突變），推測(cè)認(rèn)為基因突變可降低對(duì)放射性131I的吸收率，進(jìn)而影響PTC的預(yù)后，從而增加復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。另外，從分子水平上推測(cè)認(rèn)為，長(zhǎng)期的高碘攝入導(dǎo)致鈉碘同向轉(zhuǎn)運(yùn)體mRNA表達(dá)降低，抑制甲狀腺組織攝取碘及甲狀腺激素合成，進(jìn)而引起下丘腦過度分泌促甲狀腺激素，使得發(fā)生甲狀腺腫，引起甲狀腺癌的發(fā)生，而PTC患者中多數(shù)存在BRAFV600E基因突變[13，14]，故而筆者研究顯示高碘攝入量是BRAFV600E基因突變相關(guān)危險(xiǎn)因素。BRAFV600E基因突變?cè)赑TC癌組織中具有高度的特異性，是PTC侵襲性分子機(jī)制的致癌基因，進(jìn)而增加腺外侵襲、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)，增加腫瘤病灶數(shù)目，故而腫瘤病灶數(shù)目與BRAFV600E基因突變顯著相關(guān)。

盡管PTC患者死亡風(fēng)險(xiǎn)較小，但疾病復(fù)發(fā)率仍然較高，特別是BRAFV600E基因突變的PTC患者，需要接受更徹底的治療方案，且配合長(zhǎng)期隨訪，從而降低疾病復(fù)發(fā)、死亡風(fēng)險(xiǎn)。國(guó)外很多研究表明BRAFV600E基因突變者預(yù)后較差[15]，在中國(guó)PTC患者中BRAFV600E基因突變率較高，但并沒有明確證據(jù)顯示BRAFV600E變異型預(yù)后更差，因此該基因突變?cè)谠u(píng)估PTC患者預(yù)后中的價(jià)值尚待確證。筆者研究結(jié)果顯示，隨訪3年，共有54例患者復(fù)發(fā)，其中BRAFV600E基因突變組患者有更高的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)（P＜0.05），與朱長(zhǎng)雨等[5]研究結(jié)果相近，BRAFV600E基因突變加強(qiáng)PTC的侵襲性，是PTC復(fù)發(fā)的高危因素。研究認(rèn)為BRAFV600E與老年P(guān)TC患者間存在更明顯的相關(guān)性，相對(duì)年輕患者具有更差的臨床結(jié)果，包括更高的PTC復(fù)發(fā)率和特異性死亡率[16]，結(jié)合此次研究結(jié)果，進(jìn)一步證實(shí)BRAFV600E基因突變可增加術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。Angell TE等[17]研究認(rèn)為BRAFV600E基因與PTC患者的異常免疫反應(yīng)有關(guān)，即突變型基因可能增加腫瘤免疫抑制，導(dǎo)致PTC預(yù)后不良。同時(shí)，筆者研究顯示，高碘攝入量組患者有更高的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)（P＜0.05），分析認(rèn)為長(zhǎng)期的高碘攝入一方面可通過“脫逸”現(xiàn)象、Wolff Chaikoff效應(yīng)引起膠質(zhì)性甲狀腺腫，并誘發(fā)自身免疫反應(yīng)、細(xì)胞凋亡，進(jìn)而導(dǎo)致甲狀腺細(xì)胞過度死亡；另一方面，還可以抑制鈉碘同向轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)、轉(zhuǎn)錄，損傷甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞的攝取碘功能，進(jìn)而減少甲狀腺激素分泌，升高促甲狀腺激素水平，促甲狀腺激素的長(zhǎng)期刺激引起甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞增生，最終增加TC發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[18]。BRAFV600E基因突變、高碘攝入均可降低鈉碘同向轉(zhuǎn)運(yùn)體mRNA表達(dá)，進(jìn)而降低甲狀腺癌細(xì)胞攝碘能力，最終影響放射性碘的治療效果，增加術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。另外，多灶性組患者有更高的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)（P＜0.05），分析認(rèn)為病灶數(shù)目影響手術(shù)切除范圍的選擇，多病灶手術(shù)切除相對(duì)復(fù)雜，特別是對(duì)于難以識(shí)別的微小腫瘤，往往容易忽視而導(dǎo)致腫瘤殘留，增加復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，因此對(duì)可疑病灶進(jìn)行基因檢測(cè)[19]，可為穿刺組織的病理診斷提供重要線索。

綜上所述，PTC患者病灶數(shù)目及碘攝入量均是BRAFV600E基因突變相關(guān)危險(xiǎn)因素，多灶性、高碘攝入量、BRAFV600E基因突變患者有更高的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。