孫 文 謝春毅 何德英 米 虹

(1.重慶市中醫(yī)院老年病科，重慶 400016；2.上海市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院心內(nèi)科，上海 200082；3.重慶市中醫(yī)院中醫(yī)經(jīng)典科，重慶 400016)

糖尿病心肌病(Diabetic cardiomyopathy，DCM) 是一種由高血糖和胰島素抵抗引起的心肌結(jié)構(gòu)和功能改變的原發(fā)性、特異性心肌病[1]。目前，DCM尚無統(tǒng)一的診斷標(biāo)準(zhǔn)，是指排除高血壓病、冠狀動(dòng)脈疾病和瓣膜病變等器質(zhì)性心臟疾病以外的糖尿病人群中的心室舒張和(或)收縮功能障礙的一種心肌病[2]，主要臨床表現(xiàn)為心律失常、心臟擴(kuò)大、心力衰竭甚至猝死等。紅景天苷是自中藥紅景天中提取的主要有效成分，是一種苯乙醇類化合物，紅景天苷具有促進(jìn)血管再生、抑制心肌細(xì)胞凋亡、改善心肌缺血及抗氧化[3]等作用。本研究通過紅景天苷不同劑量干預(yù)DCM大鼠，并與曲美他嗪相比較，分析紅景天苷對DCM大鼠血清指標(biāo)的影響，并與傳統(tǒng)改善心肌能量代謝的藥物曲美他嗪進(jìn)行對比，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級成年雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量為(200±20)g，由中國科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[動(dòng)物許可證編號：SCXK(滬)2008—2002]，所有大鼠均在相同標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境(GB14925—2001)內(nèi)飼養(yǎng)(上海中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心)，予人工光照(明暗各12 h)及自由飲水，高糖高脂飼料喂養(yǎng)于糖尿病大鼠專用鐵絲飼養(yǎng)箱，飼養(yǎng)室保持恒溫恒濕(溫度為25 ℃，濕度為40%)。

1.2 藥物與試劑 紅景天苷：99%純度，由南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司提供，產(chǎn)品編號：ZL20130328。根據(jù)《中藥藥理研究方法學(xué)》[4]計(jì)算出人與大鼠等效劑量為30 mg/kg，據(jù)既往文獻(xiàn)，分別給予中、高2種干預(yù)劑量。曲美他嗪：98%純度，由南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司提供，產(chǎn)品編號：ZL20130328QB，計(jì)算出人與大鼠等效劑量，其抗氧化應(yīng)激最大劑量為2 mg/kg。鏈脲佐菌素(Streptozotocin，STZ),購于美國Sigma公司，產(chǎn)品編號: Sigma0130。大鼠內(nèi)皮素-1(ET-1)試劑盒、大鼠醛固酮試劑盒、大鼠缺氧誘導(dǎo)因子1α(HIF-1α)試劑盒、大鼠Ⅰ型膠原(PⅠP)試劑盒均購于上海藍(lán)基生物科技有限公司。

1.3DCM大鼠模型制備 將40只成年雄性SD大鼠在禁食12 h后，一次性腹腔注射STZ(55 mg/kg)后，予高糖高脂飼料喂養(yǎng)72 h后用羅氏血糖儀(德國羅氏診斷有限公司，ACCU-CHEK活力型)檢測大鼠血糖值，空腹血糖值>16.7 mmol/L，則判定糖尿病大鼠模型成功。據(jù)文獻(xiàn)[5]，對糖尿病大鼠繼續(xù)予高糖高脂飼料飼養(yǎng)4周，則糖尿病心肌病大鼠成模。

1.4 分組與給藥 剔除造模期間死亡及造模失敗的大鼠，剩余大鼠36只，對其進(jìn)行編號，利用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為對照組，紅景天苷中、高劑量組及曲美他嗪組，每組9只。紅景天苷中、高劑量組分別給與50 mg/kg及100 mg/kg紅景天苷灌胃，曲美他嗪組給予2 mg/kg曲美他嗪灌胃，對照組給予等量生理鹽水灌胃。連續(xù)給藥12周后，死亡5只，對照組剩余7只，其他各組均剩余8只，對上述大鼠行腹主動(dòng)脈取血并離心后取血清檢測。

1.5 酶聯(lián)免疫法(ELISA法)檢測血清中HIF-1α、ET-1、PⅠP、醛固酮的含量 取出對應(yīng)試劑盒，于室溫(20～25 ℃)放置30 min，取出酶標(biāo)板，按標(biāo)準(zhǔn)品的分別有序加入50 μL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液于空白孔中；空白微孔中加入50 μL樣品，將酶標(biāo)板用封板密封后，37 ℃孵育1 h(在孵育箱中保持恒溫恒濕)，充分洗滌酶標(biāo)板5次，保持各孔有足夠的水壓(濃縮洗滌液以1∶100的比例與蒸餾水混勻)，酶標(biāo)板洗滌后用吸水紙徹底拍干，各孔先后加入顯色劑(上海藍(lán)基生物科技有限公司)A50 μL及B 50 μL；37 ℃避光反應(yīng)10～15 min，然后各孔加入50 μL終止液，終止反應(yīng)。選取波長為580 nm的酶標(biāo)儀(美國Bio Tek,Power Wave XSZ)上讀取相應(yīng)各孔的光密度(OD)值，設(shè)置B=標(biāo)準(zhǔn)品OD值，BO=標(biāo)準(zhǔn)品0點(diǎn)的OD值。設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，B/BO%為縱坐標(biāo)，在對數(shù)坐標(biāo)紙上描繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查找相對應(yīng)濃度范圍(針對不同檢測指標(biāo)的敏感度不同，如HIF-1α敏感度為0.001 pg/mL；ET-1敏感度為0.001 ng/mL；PⅠP敏感度為0.001 pg/mL；醛固酮敏感度為0.001 pg/mL)。

2 結(jié)果

2.1 紅景天苷對DCM大鼠血清中HIF-1α及PⅠP的影響及與曲美他嗪組的對比 統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，對照組血清中HIF-1α及PⅠP含量明顯高于紅景天苷中、高劑量組及曲美他嗪組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但紅景天苷中、高劑量組及曲美他嗪組的組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 紅景天苷對DCM大鼠血清中HIF-1α及PⅠP的影響

2.2 紅景天苷對DCM大鼠血清中ET-1及醛固酮的影響及與曲美他嗪的對比 統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，對照組血清中ET-1及醛固酮水平顯著高于紅景天苷中、高劑量組(P<0.05)，但與曲美他嗪組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；且紅景天苷高劑量組在降低醛固酮方面明顯優(yōu)于曲美他嗪組(P<0.05)；曲美他嗪組與紅景天苷中、高劑量組的組間比較，在降低血清中ET-1方面差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 紅景天苷對DCM大鼠血清中ET-1及醛固酮的影響

3 討論

DCM是糖尿病的重要心血管并發(fā)癥，隨著糖尿病(1型及2型)發(fā)病率的逐年升高，糖尿病人群中心血管系統(tǒng)疾病發(fā)病率為30%～80%[6]。DCM的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前認(rèn)為，鈣平衡調(diào)節(jié)異常、腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RASS系統(tǒng))激活、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、自噬、糖脂代謝紊亂等多重因素相互作用，影響心肌的能量代謝和微循環(huán)，進(jìn)而造成心臟功能及結(jié)構(gòu)的改變[7]。針對糖尿病心肌病，目前以經(jīng)驗(yàn)性控制血糖、預(yù)防靶器官損害、抑制RASS系統(tǒng)過度激活以及抗心肌纖維化等治療為主[8,9]，其治療原理及循證證據(jù)尚不足。

紅景天苷是中藥紅景天的主要有效成分，有研究[10]表明，紅景天苷能通過調(diào)節(jié)血管痙攣及修復(fù)血管損傷的方式，產(chǎn)生血管保護(hù)作用并改善血管功能。ET-1是ET家族中的主要成員，具有強(qiáng)烈的血管收縮作用，持續(xù)升高的ET-1可導(dǎo)致心肌肥厚、心臟異常重構(gòu)進(jìn)而導(dǎo)致心血管惡性事件的發(fā)生[11]。本研究通過紅景天苷干預(yù)DCM大鼠，檢測血清中ET-1的含量提示紅景天苷能明顯降低DCM大鼠血清中ET-1的含量，提示紅景天苷能通過抑制ET-1的生成產(chǎn)生血管內(nèi)皮的保護(hù)作用，從而達(dá)到保護(hù)心肌、改善預(yù)后的目的。醛固酮處于RASS系統(tǒng)的下游，異常增高的醛固酮加重心臟的前、后負(fù)荷，導(dǎo)致心肌肥大、纖維化及壞死，損害心功能。本研究通過與對照組大鼠相比，發(fā)現(xiàn)紅景天苷能明顯降低大鼠血清中醛固酮含量，從而達(dá)到抑制心肌纖維化、延緩心肌重構(gòu)及改善心功能的目的。心肌膠原共有5種，其中以PⅠP、PⅢP為主，PⅠP約占心肌膠原總數(shù)的80%以上，以纖維粗、僵硬度大、抗?fàn)坷?qiáng)為特征，主要用于維持心室壁的強(qiáng)度。心肌纖維化是指過度的心肌膠原組織纖維沉積，膠原含量及膠原容積分?jǐn)?shù)明顯增加，各型膠原比例嚴(yán)重失調(diào)和排列紊亂的一種病理生理狀態(tài)，PⅠP是細(xì)胞外基質(zhì)的主要組成部分，在DCM的發(fā)展過程中，發(fā)生基質(zhì)膠原過度沉積，其中以PⅠP為主，造成心肌纖維化，引起心肌舒張功能障礙[12]。本研究通過紅景天苷干預(yù)DCM大鼠，與對照組相比，提示紅景天苷及曲美他嗪能顯著降低DCM大鼠血清中PⅠP含量，進(jìn)而抑制大鼠心肌纖維化。HIF-1α是一種隨著細(xì)胞內(nèi)氧濃度的變化而調(diào)節(jié)基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄激活因子，在腎臟和心臟組織中的表達(dá)水平最高[13]，可通過激活血管內(nèi)皮生長因子來促進(jìn)血管生成，使機(jī)體的代謝適應(yīng)于缺氧環(huán)境中，通過調(diào)控血紅素加氧酶-1(HO-1)表達(dá)來發(fā)揮其心肌保護(hù)作用。本研究發(fā)現(xiàn)，對照組大鼠血清中HIF-1α含量明顯升高，顯著高于紅景天苷中、高劑量組及曲美他嗪組，故認(rèn)為紅景天苷及曲美他嗪能顯著降低DCM大鼠血清中HIF-1α含量，在改善心肌缺氧致?lián)p傷方面有一定意義。紅景天苷能顯著降低DCM大鼠血清中HIF-1α、ET-1、PⅠP、醛固酮的含量，對DCM的治療及預(yù)后意義重大，有待進(jìn)一步深入研究，為解決臨床實(shí)際問題提供明確證據(jù)。