陳 晗，徐洪國,2，王志剛,2，徐偉慧,2，葛宵啟，祁宏英,2

（1.齊齊哈爾大學(xué)生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006；2.寒區(qū)麻及制品教育部工程研究中心，黑龍江 齊齊哈爾 161006）

0 引言

【研究意義】在生物進(jìn)化中，磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白（Phosphatidylethanolamine-binding Protein, PEBP）是一種十分保守的蛋白質(zhì)，廣泛存在于細(xì)菌、動(dòng)物和植物中。PEBP是一種編碼蛋白，對植物生長發(fā)育起重要調(diào)控作用[1]。PEBP基因家族的成員不僅是植物營養(yǎng)階段向生殖階段過渡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，而且控制芽的生長和花的結(jié)構(gòu)之間的形態(tài)轉(zhuǎn)換以及多種信號(hào)通路的調(diào)節(jié)[2-4]。分析大麻PEBP基因，研究該基因在大麻中的生物功能，為調(diào)控大麻生長發(fā)育及開花奠定基礎(chǔ)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】PEBP基因在許多物種中備受關(guān)注，例如大豆[5]、棉花[6]、茶樹[7]、甜橙[8]、水稻[9]等，而在大麻中僅有關(guān)于FT（FloweringLocus T）同源基因的研究[10]。模式植物擬南芥的開花途徑主要包括光周期促進(jìn)途徑、春化促進(jìn)途徑、自主開花途徑以及赤霉素途徑[11]，而PEBP基因?qū)儆诠庵芷诖龠M(jìn)途徑中主要的控制基因[12]。在擬南芥中，PEBP基因共有3個(gè)亞家族成員，其中FT、TSF（Twin Sister of FT）屬于FT-LIKE，TFL1（Terminal Flower1）、BFT（Brother of FTandTFL1）、ATC（Arabidopsis thaliana CENRADIALIS homologue）屬于TFL1-LIKE，MFT（Mother of FT and TFL1）屬于MFT-LIKE亞家族[1]。FT基因也稱為成花素，主要在葉片中進(jìn)行表達(dá)，同亞家族的TSF基因的過表達(dá)同樣可以促進(jìn)開花[13-16]。FT與同源基因TERMINAL FLOWER1（TFL1）具有拮抗作用，它與TSF在花序分生組織成分的確定中對TFL1起拮抗作用[17-19]。FT和TFL1之間的平衡通過將分生組織從隨機(jī)生長轉(zhuǎn)換為定向生長來調(diào)節(jié)植物結(jié)構(gòu)，它們除開花時(shí)間和植物結(jié)構(gòu)中的作用外，F(xiàn)T與TFL1基因參與植物發(fā)育的各個(gè)方面，如種子萌發(fā)和塊莖形成[20-21]。而MFT在種子中表達(dá)，并響應(yīng)ABA而上調(diào)[22-26]。大麻（Cannabis sativa）又稱火麻、線麻，是大麻科（Cannabinaceae）大麻屬（Cannabis）一年生草本植物，原產(chǎn)于中亞地區(qū)，是我國傳統(tǒng)的經(jīng)濟(jì)作物，具有悠久的栽培歷史[27]。大麻中含有大量精神類物質(zhì)，如四氫大麻（THC），具有致幻作用，根據(jù)THC含量大麻可分為3類，其中工業(yè)大麻（THC＜0.3%）為低毒作物[28]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】隨著工業(yè)大麻應(yīng)用范圍的不斷擴(kuò)大、市場潛力劇增，工業(yè)大麻在分子育種、遺傳育種等方面的發(fā)展刻不容緩。高CBD、低THC含量的大麻品種缺乏、育種難度大，導(dǎo)致工業(yè)大麻發(fā)展緩慢。而調(diào)控工業(yè)大麻的花期可有效地改善工業(yè)大麻育種期限，增加產(chǎn)量提高經(jīng)濟(jì)效益。【擬解決問題】植物開花是由多因素控制，主要包括植物生長環(huán)境（光照、水分、氣體、養(yǎng)分等）與植物內(nèi)源激素（茉莉酸、水楊酸、赤霉素）。在植物生長環(huán)境中光照是主要因素，大麻屬于喜光、短日照植物，光照的改變不僅調(diào)控花期還影響大麻植株形態(tài)、大麻素的合成以及次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成[29]。PEBP基因包括了種子的花芽分化與休眠、促進(jìn)開花與抑制開花的三個(gè)亞族?？刂崎_花期可以控制植物的生長和產(chǎn)量。本研究選取工業(yè)大麻PEBP基因家族進(jìn)行生物信息學(xué)分析，為進(jìn)一步明確其功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 大麻CsPEBP基因家族成員鑒定

從擬南芥TAIR數(shù)據(jù)庫（https://www.arabidopsis.org/）中搜索編碼PEBP家族基因蛋白的6個(gè)序列，以ATFT（AT1G65480）、ATTSF（AT4G20370）、ATTFL1（AT5G03840）、ATBFT（AT5G62040）、ATATC（AT2G 27550）、ATMFT（AT1G18100）作為參考序列篩選大麻目的基因。使用NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）下載大麻（GCA_900 626 175.2）全基因組及注釋文件[30]，利用TBtools軟件進(jìn)行Blast序列比對、并提取候選基因序列，將篩選出的候選基因序列上傳至Pfam（http://pfam.xfam.org/）進(jìn)行結(jié)構(gòu)域比對[31]，保留包含其結(jié)構(gòu)域的基因。

1.2 大麻CsPEBPs基因motif預(yù)測、亞細(xì)胞定位及理化性質(zhì)分析

利用在線工具M(jìn)EME（https://meme-suite.org/meme/tools/meme）預(yù)測大麻CsPEBPs基因的保守結(jié)構(gòu)域[32]，設(shè)置motif數(shù)量為10。利用在線工具Cell-PLoc 2.0（http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/）預(yù)測大麻PEBP基因蛋白的亞細(xì)胞定位[33]。利用Expasy（https://web.expasy.org/protparam/）分析大麻PEBP基因的理化性質(zhì)，其中包括氨基酸數(shù)量、等電點(diǎn)、分子質(zhì)量、不穩(wěn)定指數(shù)、脂溶指數(shù)、總平均疏水指數(shù)等。

1.3 大麻CsPEBPs基因結(jié)構(gòu)、染色體定位及系統(tǒng)進(jìn)化分析

利用TBtools分析大麻CsPEBPs基因結(jié)構(gòu)，顯示其UTR（外顯子）及CDS（內(nèi)含子）區(qū)，并使用TBtools定位基因在染色體上的位置實(shí)現(xiàn)可視化。利用 MEGA7.0軟件對大麻CsPEBPs基因進(jìn)行多序列比對，并使用鄰近算法（NJ，neighbor-joining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹[34]。

1.4 大麻CsPEBP蛋白二、三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測

利用在線軟件SOPMA（https://www.expasy.org/）預(yù)測大麻CsPEBPs基因二級(jí)結(jié)構(gòu)[35]，并分析其α-螺旋、β-折疊、延伸鏈、無規(guī)則卷曲在整體結(jié)構(gòu)中的比例。

利用在線軟件SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/）的同源建模預(yù)測大麻CsPEBPs蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)[36]，并與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果進(jìn)行比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 大麻CsPEBP家族基因的挖掘及motif預(yù)測、亞細(xì)胞定位及理化性質(zhì)分析

通過基因家族分析，從大麻基因組中共篩選出12個(gè)PEBP家族基因，經(jīng)Pfam結(jié)構(gòu)域篩選，12個(gè)大麻PEBP家族基因均含有PBP（PF01161）結(jié)構(gòu)域。編碼基因含有172～190個(gè)氨基酸，平均每條序列含有177個(gè)氨基酸，等電點(diǎn)為6.09～9.41，蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量在19 019.01～21 595.23 Da，其中CsPEBP5不穩(wěn)定指數(shù)高達(dá)56.79，屬于極不穩(wěn)定蛋白，總平均疏水指數(shù)均小于0，說明大麻CsPEBPs基因?yàn)橛H水蛋白（表1）。12個(gè)CsPEBPs基因亞細(xì)胞定位基本分布在細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)中。

表1 大麻CsPEBPs基因的理化性質(zhì)分析Table 1 Physicochemical properties of C.sativa CsPEBPs

利用MEME進(jìn)行motif分析，其結(jié)構(gòu)用TBtools進(jìn)行可視化。如圖1，12個(gè)大麻CsPEBPs基因均含有motif1～5，且排序方式一致，說明大麻CsPEBPs基因具有一定的保守性。其主要區(qū)別是蛋白質(zhì)N-端motif的類型有差異，CsPEBP8、CsPEBP9均含有motif6，CsPEBP3、CsPEBP10均含有motif7，CsPEBP4、CsPEBP12均含有motif8，CsPEBP4含有兩個(gè)motif10，僅有CsPEBP11含有motif 9。

圖1 大麻CsPEBPs基因motif預(yù)測Fig.1 Prediction motifs of C.sativa CsPEBPs

2.2 大麻CsPEBP家族基因結(jié)構(gòu)、染色體定位及系統(tǒng)分析

12個(gè)大麻CsPEBPs基因的內(nèi)含子、外顯子如圖2所示。篩選的全部基因中均含有2個(gè)外顯子，除CsPEBP2、CsPEBP3外，其他基因均含有4個(gè)內(nèi)含子。主要差別位于非編碼區(qū)長度，說明CsPEBPs基因在結(jié)構(gòu)上具有高度的保守性。

圖2 大麻CsPEBPs基因結(jié)構(gòu)Fig.2 Structure of C.sativa CsPEBPs

如圖3所示，大麻CsPEBPs基因主要位于7條染色體上，分別是染色體1、3、5、6、7、8、X，且分布不均。3號(hào)染色體與X染色體上均含有3個(gè)大麻CsPEBPs基因。5號(hào)染色體上含有2個(gè)基因，其余染色體上只含有1個(gè)基因。由圖4預(yù)測CsPEBP8與CsPEBP9、CsPEBP10、CsPEBP11為等位基因，需要進(jìn)行多序列比對、順式作用元件分析、二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測、三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測印證猜想。

圖3 大麻CsPEBPs基因在染色體上的定位Fig.3 Mapping of C.sativa CsPEBPs on chromosome

為確定大麻CsPEBPs基因在進(jìn)化上的保守性，使用MEGA7.0進(jìn)行多序列比對，并使用鄰近算法（NJ，neighbor-joining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹。根據(jù)擬南芥PEBP家族的分類方法，大麻CsPEBPs基因也進(jìn)行了分類（圖4）。FT-LKE亞家族中含有4個(gè)大麻CsPEBPs基因（CsPEBP1、CsPEBP2、CsPEBP4、Cs-PEBP7），TFL1-LKE亞家族中含有5個(gè)大麻CsPEBPs基因（CsPEBP3、CsPEBP6、CsPEBP10、CsPEBP11、CsPEBP12），MFT-LIKE亞家族中含有3個(gè)大麻Cs-PEBPs基因（CsPEBP5、CsPEBP8、CsPEBP9）。其中CsPEBP8、CsPEBP9基因序列相似性為100%。

圖4 大麻與擬南芥、水稻PEBP基因家族系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.4 Phylogenetic trees of PEBP family of hemp, rice, and arabidopsis

2.3 大麻CsPEBP家族基因啟動(dòng)子順式作用元件分析

本研究使用TBtools分析和可視化大麻CsPEBPs基因上游2 000 bp的啟動(dòng)子順式作用元件（圖5）。大麻CsPEBPs基因順式作用元件主要是光反應(yīng)順式調(diào)節(jié)元件、脫落酸反應(yīng)順式作用元件、茉莉酸響應(yīng)元件、厭氧誘導(dǎo)順式作用元件。其中12個(gè)大麻CsPEBPs基因均含有光反應(yīng)順式調(diào)節(jié)元件，共183個(gè)。大麻CsPEBPs基因中分生組織表達(dá)調(diào)控順式作用元件、干旱誘導(dǎo)順式作用元件、低溫響應(yīng)元件、晝夜節(jié)律調(diào)控順式作用元件均含有3個(gè)。

圖5 大麻CsPEBPs基因啟動(dòng)子區(qū)順式作用元件Fig.5 Cis-acting elements in the promoter region of C.sativa CsPEBPs genes

2.4 大麻CsPEBPs蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測

利用SOPMA在線軟件預(yù)測12個(gè)大麻CsPEBPs蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測。從表2可知，大麻CsPEBPs蛋白質(zhì)含有高達(dá)57.47%的無規(guī)則卷曲，而β-折疊占比最高，為7.30%，由此可知大麻CsPEBPs蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)主要是由無規(guī)則卷曲構(gòu)成，α-螺旋、β-折疊、延伸鏈分散于整個(gè)蛋白質(zhì)中。由圖6可知，12個(gè)大麻CsPEBPs蛋白質(zhì)在二級(jí)結(jié)構(gòu)上無明顯差異。

圖6 大麻CsPEBPs蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)在線預(yù)測結(jié)果Fig.6 Online prediction of secondary structure of CsPEBPprotein

表2 大麻CsPEBPs蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測Table 2 Predicted secondary structure of CsPEBP protein (%)

2.5 大麻CsPEBPs蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測

利用在線軟件SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/）中的同源建模預(yù)測蛋白質(zhì)三維空間結(jié)構(gòu)。如圖7所示，蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)主要是由無規(guī)則卷曲構(gòu)成與蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果一致。

圖7 大麻CsPEBPs蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)空間構(gòu)象Fig.7 A spatial conformation of tertiary structure of CsPEBP protein

3 討論與結(jié)論

PEBP基因家族廣泛存在于細(xì)菌、動(dòng)物和植物中，PEBP家族包含在整個(gè)植物界中作為開花時(shí)間的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑的蛋白質(zhì)，它們還調(diào)節(jié)生長和植物結(jié)構(gòu)[37]。本研究運(yùn)用生物信息學(xué)等方法，從已報(bào)道的大麻全基因組中鑒定出12個(gè)PEBPs基因，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)單子葉植物中的PEBPs基因數(shù)量多于雙子葉植物[24]。通過對大麻CsPEBPs基因的理化性質(zhì)分析，僅有CsPEBP5、CsPEBP7等電點(diǎn)小于7，說明該基因具有編碼堿性蛋白質(zhì)的可能，這與染井吉野櫻的PEBP分析結(jié)果一致[38]；12個(gè)大麻PEBPs基因均為親水性蛋白，此結(jié)果從小麥FT基因[39]中得到印證；通過亞細(xì)胞定位得知CsPEBPs分布在細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核中，與金花茶[40]、辣椒[41]定位結(jié)果一致。從基因結(jié)構(gòu)來看，12個(gè)大麻CsPEBPs基因均具備PEBP結(jié)構(gòu)域，均含有2個(gè)外顯子、4個(gè)內(nèi)顯子，說明PEBP基因在進(jìn)化上具有高度的保守性，大麻CsPEBPs基因的保守基序分析結(jié)果也印證了該結(jié)論。

經(jīng)過與擬南芥、水稻的PEBP蛋白構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，將12個(gè)基因分為3個(gè)亞家族；FT-LKE亞家族中含有4個(gè)大麻CsPEBP基因，TFL1-LKE亞家族中含有5個(gè)大麻CsPEBPs基因，MFT-LIKE亞家族中含有3個(gè)大麻CsPEBPs基因。經(jīng)啟動(dòng)子順式作用元件分析，大麻PEBPs基因家族含有光反應(yīng)順式調(diào)節(jié)元件、脫落酸反應(yīng)順式作用元件、茉莉酸響應(yīng)元件、厭氧誘導(dǎo)順式作用元件等順式作用元件，當(dāng)大麻受到相關(guān)環(huán)境脅迫時(shí)，PEBP基因可能會(huì)對大麻生長發(fā)育產(chǎn)生一定影響。蛋白質(zhì)中結(jié)構(gòu)中有規(guī)則的重復(fù)的構(gòu)象稱為蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)[42]，其中包括α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲以及一些特殊結(jié)構(gòu)（π-螺旋，PPII螺旋）[42-43]。蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)是在二級(jí)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上不斷地盤繞折疊而形成特定的構(gòu)象，是多肽鏈的三維空間結(jié)構(gòu)，可以依據(jù)已知的蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)推測位置蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)并預(yù)測其功能[44-45]。大麻CsPEBPs蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果與三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果一致。并從三級(jí)預(yù)測結(jié)構(gòu)中發(fā)現(xiàn)同一亞族的基因擁有相似的三級(jí)結(jié)構(gòu)。根據(jù)以上分析結(jié)果，CsPEBP8與CsPEBP9基因相似度為100%、二級(jí)結(jié)構(gòu)與三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果一致、保守基序相同，但順式作用元件分析結(jié)果略有不同，說明這兩個(gè)基因具有相似的形態(tài)結(jié)構(gòu)并執(zhí)行相同的生理功能。

本研究通過對大麻PEBPs蛋白的全基因組鑒定，對PEBP基因家族進(jìn)行生物信息學(xué)分析，包括序列的理化性質(zhì)、保守基序、基因結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)進(jìn)化分析、順式作用元件分析等。研究結(jié)果為PEBP基因家族調(diào)控大麻的生長發(fā)育及開花奠定基礎(chǔ)。