李小芳，林曉藝，蘇炳茜，張城瑜，羅彬彬，陳裕坤，杜迎剛,2 ，賴(lài)鐘雄

（1.福建農(nóng)林大學(xué)園藝植物生物工程研究所，福建 福州 350002；2.濰坊科技學(xué)院山東省高校設(shè)施園藝實(shí)驗(yàn)室，山東 濰坊 261000）

0 引言

【研究意義】龍眼（Dimocarpus longanLour.）是無(wú)患子科（Sapindaceae）龍眼屬（DimocarpusLour）的熱帶亞熱帶常綠經(jīng)濟(jì)果樹(shù)，別稱(chēng)桂圓和三尺農(nóng)味等，具有降血脂、補(bǔ)腦益智、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤等功效，是一種重要的經(jīng)濟(jì)水果。龍眼胚胎的發(fā)育對(duì)龍眼坐果率及其果實(shí)品質(zhì)有重要影響，因此對(duì)龍眼胚胎發(fā)育的深入研究對(duì)龍眼產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重大意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】光信號(hào)在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用，植物對(duì)光信號(hào)的感知主要是通過(guò)光感受器來(lái)進(jìn)行，而光敏色素（Phytochromes，phy）作為一種可以感知紅光/遠(yuǎn)紅光的植物色素蛋白，以吸收紅光的非活性形式Pr和吸收遠(yuǎn)紅光的活性形式Pfr存在[1]，在植物的生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮重要作用[2]。光敏色素互作基因PIFs（Phytochrome interacting factors，PIFs）作為光敏色素極為重要的一種互作基因和重要的信號(hào)整合因子參與調(diào)節(jié)植物的眾多生理過(guò)程[3]。在光照下，光敏色素通過(guò)快速磷酸化、泛素化和蛋白酶體介導(dǎo)的降解促進(jìn)PIF的周轉(zhuǎn)，從而抑制PIF功能誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄重編程，導(dǎo)致光形態(tài)發(fā)育[4]。PIFs屬于basic helix-loop-helix（bHLH）轉(zhuǎn)錄因子家族的第15亞族，植物PIFs轉(zhuǎn)錄因子具有bHLH結(jié)構(gòu)域，大部分還具有保守的APB（Active phytochrome B-binding domain）結(jié)構(gòu)域，APB結(jié)構(gòu)域是PIFs與具有生物活性光敏色素相結(jié)合的不可或缺的元件[5]。PIF3是第一個(gè)被鑒定出來(lái)的與phyB、phyA互作的bHLH 轉(zhuǎn)錄因子，其他PIFs成員同樣能夠與Pfr形式的phyB發(fā)生互作[6]。PIFs 蛋白序列中保守的 bHLH 結(jié)構(gòu)域能特異性地與啟動(dòng)子中的G-box元件結(jié)合從而調(diào)控靶基因的表達(dá)[7]。通過(guò)ChIP-seq（染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)）和RNA-seq（轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)） 分析發(fā)現(xiàn)，PIF1、PIF3、PIF4和PIF5 都有各自直接的調(diào)控基因，但同時(shí)也發(fā)現(xiàn)有139個(gè)基因能同時(shí)被這4個(gè)PIF蛋白調(diào)控。這些結(jié)果表明 PIF蛋白具有相同和各自不同的DNA結(jié)合特性，從而表現(xiàn)出功能重疊及各自特定功能[8]。研究表明，PIFs可以協(xié)調(diào)光和激素信號(hào)傳遞[9-10]，參與種子萌發(fā)[11]、避蔭反應(yīng)[12]、開(kāi)花[13]等生理活動(dòng)，可以負(fù)調(diào)控花青素、葉綠素的生物合成和光合作用相關(guān)基因的表達(dá)[14-16]，還能響應(yīng)光、蔭、溫度和晝夜條件[17-20]。在非生物脅迫調(diào)控方面，PIFs可以調(diào)控植物對(duì)低溫、高溫的耐性[21-24]，對(duì)干旱和鹽脅迫也有響應(yīng)[25]。總之，PIFs對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育具有極為重要的作用?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】龍眼體胚發(fā)生系統(tǒng)是研究木本植物胚胎發(fā)生的優(yōu)良體系，可以替代合子胚的發(fā)生系統(tǒng)，為研究龍眼體胚發(fā)生的分子調(diào)控機(jī)制和龍眼分子育種奠定基礎(chǔ)[26]。目前國(guó)內(nèi)外缺少對(duì)龍眼中PIFs家族的研究，更缺乏PIFs家族在龍眼體胚和不同組織器官發(fā)育過(guò)程中所發(fā)揮功能的了解?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】基于龍眼基因組數(shù)據(jù)對(duì)DlPIFs家族進(jìn)行鑒定及相關(guān)生物信息學(xué)分析，通過(guò)龍眼不同組織部位轉(zhuǎn)錄組、不同光質(zhì)和不同溫度處理下的轉(zhuǎn)錄組對(duì)DlPIFs家族的FPKM（Reads per kilobase per million mapped reads）值進(jìn)行分析，并且利用qRT-PCR分析DlPIFs在龍眼體胚發(fā)生早期的表達(dá)模式及不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑處理下的表達(dá)模式，為DlPIFs在龍眼體胚發(fā)生過(guò)程中的功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

龍眼體胚發(fā)生早期3個(gè)階段包括EC、ICpEC和GE，參照賴(lài)鐘雄等[27]的方法培養(yǎng)獲得。二代龍眼基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（NCBI登錄號(hào)：BioProject PRJNA 3053370）和三代龍眼基因組和不同溫度處理下EC轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)（另文發(fā)表）、龍眼體胚發(fā)生早期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)、龍眼不同組織部位轉(zhuǎn)錄組、不同光質(zhì)處理下龍眼EC轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)（GenBank登錄號(hào)：SRA050205）為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 方法

1.2.1DlPIFs基因家族成員的鑒定 擬南芥（Arabidopsis thaliana）PIF基因家族序列從擬南芥TAIR數(shù)據(jù)庫(kù)下載（https://www.arabidopsis.org/），采用clustalX2軟件進(jìn)行序列比對(duì)并轉(zhuǎn)換成Stockholm模式的HMM文件，利用HMMER 3.0的HMMbuild建立PIFs隱馬爾科夫模型，利用HMMER 3.0的HMMsearch從龍眼三代基因組數(shù)據(jù)中鑒定出DlPIFs家族成員；使用龍眼蛋白序列構(gòu)建本地Blast數(shù)據(jù)庫(kù)，以擬南芥PIF蛋白序列進(jìn)行Blast搜索，進(jìn)一步篩選DlPIFs家族成員，再 通 過(guò)CDD（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）對(duì)DlPIFs家族成員數(shù)量進(jìn)行最終確認(rèn)，并利用以上方法從龍眼二代基因組數(shù)據(jù)中篩選并確定家族成員，最后對(duì)確定的家族成員進(jìn)行命名。

1.2.2 DlPIFs蛋白序列的基本理化性質(zhì)、二級(jí)結(jié)構(gòu)、亞細(xì)胞定位分析 分別利用在線軟件ProtParam（http://web.expasy.org/protparam/）、SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl）和 Plant-mPLoc server（sjtu.edu.cn）對(duì)DlPIF蛋白序列的基本理化性質(zhì)、二級(jí)結(jié)構(gòu)及亞細(xì)胞定位進(jìn)行分析。

1.2.3DlPIFs家族基因結(jié)構(gòu)和保守基序分析 使用GSDS（http://gsds.cbi.pku.edu.cn/）在線網(wǎng)站對(duì)DlPIFs的基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，運(yùn)用MEME在線軟件（http://meme-suite.org/tools/meme）分析DlPIFs編碼蛋白的保守基序，再使用TBtools進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)和保守基序圖的繪制。

1.2.4DlPIFs染色體定位分析 使用TBtools軟件對(duì)龍眼PIFs染色體定位圖進(jìn)行繪制分析，再通過(guò)Artificial Intelligence 2020軟件對(duì)繪制的染色體定位圖進(jìn)行美化。

1.2.5 植物PIFs 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析 使用 MEGA 5對(duì)龍眼、擬南芥、水稻（Oryza sativa）、甜橙[Citrus sinensis(L.) Osbeck]的PIFs蛋白序列的多重序列進(jìn)行比對(duì)，使用鄰接法（Neighbor-joining，NJ）構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，執(zhí)行參數(shù)為Poission模式、完全刪除和1 000次重復(fù)[28]。水稻蛋白序列下載于https://ricedata.cn/gene/，甜橙蛋白序列下載于http://citrus.hzau.edu.cn/orange/。

1.2.6DlPIFs家族啟動(dòng)子順式作用元件分析 利用獲得的PIFs基因家族各成員起始密碼子ATG上游的2 000 bp 的啟動(dòng)子序列，通過(guò)PlantCare（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）分析啟動(dòng)子順式作用元件，并通過(guò)PlantTFDB（http://planttfdb.gao-lab.org/）對(duì)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行分析。

1.2.7DlPIFs家族成員在龍眼體胚發(fā)生早期、不同組織器官、不同光質(zhì)和不同溫度處理下的FPKM值分析 參照龍眼不同組織器官（供試紅核子龍眼的根、莖、葉、雄花、雌花、幼果、果肉、果皮和果核等不同組織器官的材料均采自福建農(nóng)林大學(xué)創(chuàng)業(yè)園）、不同光質(zhì)[將龍眼EC置于均光培養(yǎng)箱內(nèi)，以黑暗處理作為對(duì)照，分別對(duì)其進(jìn)行黑暗、藍(lán)光、紅光和白光處理，濕度55%～60%，溫度為（25±2） ℃][29]及不同溫度[將龍眼EC材料在25 ℃條件下培養(yǎng)兩天后，再放入不同溫度（15 ℃、25 ℃和35 ℃）培養(yǎng)箱中處理24 h]處理下轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中DlPIFs的基因表達(dá)水平，對(duì)各成員的表達(dá)趨勢(shì)進(jìn)行分析，使用TBtools繪制熱圖。

1.2.8DlPIFs家族成員在體胚發(fā)生早期和不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑處理下的表達(dá)模式分析 首先采用TransZol Up試劑盒提取龍眼體胚發(fā)生過(guò)程中3個(gè)階段的龍眼愈傷和5種生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑處理的龍眼EC的RNA，參照 PrimeScript? IV 1st Strand cDNA Synthesis Mix 試劑盒進(jìn)行cDNA合成。

再使用DNAMAN 7.0軟件對(duì)DlPIF家族成員序列進(jìn)行qRT-PCR引物設(shè)計(jì)（表1），以FSD-Q作為內(nèi)參基因[30]，對(duì)DlPIFs在龍眼體胚發(fā)生早期不同階段和龍眼EC在不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑處理下的表達(dá)水平進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)，采用2-△△Ct法進(jìn)行相對(duì)表達(dá)量的計(jì)算，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。利用Excel軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，利用Graphpad prism軟件進(jìn)行折線圖和柱狀圖的繪制，并使用SPSS 26軟件中單因素ANOVA的鄧肯法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析（P＜0.05）。

表1 DlGRF基因家族qRT-PCR引物Table 1 qRT-PCR primers of DlPIFs

2 結(jié)果與分析

2.1 DlPIFs家族成員的鑒定

基于龍眼基因組三代測(cè)序數(shù)據(jù)，共鑒定出8個(gè)DlPIFs基 因 家 族 成 員（Dlo12584、Dlo015892、Dlo034359、Dlo028134 、Dlo014068 、Dlo011892、Dlo31044、Dlo012986），它們都具有bHLH保守結(jié)構(gòu)域（圖1），根據(jù)與擬南芥PIFs序列比對(duì)的分析結(jié)果，將DlPIFs各成員分別命名為DlPIF1-1、DlPIF1-2、DlPIF3、DlPIF4、DlPIF5、DlPIF6、DlPIF7、DlPIF8。經(jīng)DNAMAN7.0軟件分析發(fā)現(xiàn)，其CDS序列長(zhǎng)度依次為 1 605、1 197、2 298、1 617、975、1 695、1 362 和1 431 bp（表2）?；邶堁刍蚪M二代測(cè)序數(shù)據(jù)，共鑒定出6個(gè)DlPIFs基因家族成員（Dlo_000274.1、Dlo_031800.1、Dlo_000977.1、Dlo_018063.1、Dlo_012166.1、Dlo_028817.1）。利用 DNAMAN 7.0進(jìn)行序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)龍眼基因組二代測(cè)序數(shù)據(jù)中所確定成員均與龍眼基因組三代測(cè)序數(shù)據(jù)中所確定成員一致。

圖1 龍眼PIFs保守結(jié)構(gòu)域Fig.1 Conserved domain of DlPIFs

2.2 DlPIFs蛋白序列的基本理化性質(zhì)、二級(jí)結(jié)構(gòu)及亞細(xì)胞定位分析

理化性質(zhì)分析表明DlPIF1～DlPIF8編碼的氨基酸殘基數(shù)分別為534、398、765、538、324、540、453和476個(gè)，分子量分別為59 036.32、43 473.33、82 158.84、58 258.97、35 089.75、62 892.14、49 786.89和50 818.37 Da，等電點(diǎn)（pI）分別為6.39、5.44、6.10、6.73、5.48、9.21、8.39 和 8.55，DlPIFs均為不穩(wěn)定、親水性蛋白（表2）。

表2 龍眼PIFs成員基本理化性質(zhì)Table 2 Basic physicochemical properties of DlPIFs

亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果表明DlPIFs定位于細(xì)胞核。二級(jí)結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)無(wú)規(guī)卷曲所占比例最高，α-螺旋次之，延伸鏈較低，β-轉(zhuǎn)角最低（表3）。

表3 龍眼PIFs家族二級(jí)結(jié)構(gòu)及亞細(xì)胞定位Table 3 Secondary structure and subcellular localization of DlPIFs

2.3 DlPIFs家族基因結(jié)構(gòu)、保守基序及染色體定位分析

通過(guò)對(duì)DlPIFs家族成員的基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，DlPIF1-1和DlPIF5有4個(gè)內(nèi)含子和5個(gè)外顯子；DlPIF1-2和DlPIF4有6個(gè)內(nèi)含子和7個(gè)外顯子；DlPIF3、DlPIF6和DlPIF7有5個(gè)內(nèi)含子和6個(gè)外顯子；DlPIF8有7個(gè)內(nèi)含子和8個(gè)外顯子（圖2）。

圖2 龍眼PIFs家族基因結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)保守基序分布Fig.2 Gene structure and protein conserved motifs of DlPIFs

使用MEME對(duì)DlPIFs的蛋白序列進(jìn)行保守基序分析，共獲得6個(gè)保守基序，8個(gè)DlPIF家族成員均含有這6個(gè)保守基序。

DlPIFs染色體定位結(jié)果見(jiàn)圖3，結(jié)果表明7個(gè)家族成員定位在染色體上。其中DlPIF1-1、DlPIF6和DlPIF8均定位在chr5染色體上，DlPIF5、DlPIF1-2、DlPIF4和DlPIF7分別定位在chr6、chr7、chr13和chr15上。DlPIF3并未定位在染色體上，推測(cè)其為葉綠體或線粒體基因。

圖3 DlPIFs染色體定位Fig.3 Chromosome distribution of DlPIFs

2.4 DlPIFs家族啟動(dòng)子順式作用元件分析

利用PlantCARE在線預(yù)測(cè)分析DlPIF基因家族的啟動(dòng)子順式作用元件發(fā)現(xiàn)，DlPIFs家族成員啟動(dòng)子區(qū)均包含TATA-box和CAAT-box兩個(gè)核心元件（圖4）。DlPIFs家族的啟動(dòng)子區(qū)還包含多種作用元件，且家族成員間的作用元件的數(shù)量和種類(lèi)存在一定差異。

圖4 DlPIFs家族啟動(dòng)子順式作用元件分析Fig.4 Cis-acting elements of DlPIFs

DlPIFs基因家族成員均包含光響應(yīng)相關(guān)的作用元件，數(shù)量相似，DlPIF1-2、DlPIF3和DlPIF7還含有MYB結(jié)合位點(diǎn)參與光反應(yīng)（MRE）相關(guān)的作用元件。DlPIF基因家族啟動(dòng)子區(qū)包含5種激素響應(yīng)相關(guān)的作用元件。DlPIFs家族成員均包含茉莉酸甲酯（CGTCA-motif、TGACG-motif）響應(yīng)元件和脫落酸（ABRE）響應(yīng)元件；DlPIF1-1、DlPIF1-2、DlPIF3、DlPIF5、DlPIF7和DlPIF8含有生長(zhǎng)素（TGA-element、AuxRR-core）響應(yīng)元件；DlPIF1-1、DlPIF3、DlPIF5和DlPIF7含有水楊酸（TCA-element）響應(yīng)元件；DlPIF3、DlPIF4、DlPIF5、DlPIF7還含有赤霉素（GARE-motif、P-box、TATC-box）響應(yīng)元件。

DlPIFs基因家族還含有種子特異性（RY-element）、胚乳特異性（GCN4_motif）、生物鐘（Circadian）、分生組織表達(dá)（CAT-box）、玉米蛋白代謝（O2-site）、α-淀粉酶等相關(guān)的作用元件和低溫脅迫（MBS）、防御和應(yīng)激（TC-rich repeats）、MYB轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)相關(guān)的作用元件，并含有參與干旱誘導(dǎo)（MBS）、厭氧誘導(dǎo)（ARE）、缺氧特異性誘導(dǎo)（GC-motif）等與非生物脅迫相關(guān)的作用元件。

由上述結(jié)果推測(cè)，DlPIFs家族最主要的功能為光響應(yīng)功能，同時(shí)在激素響應(yīng)、生物鐘調(diào)控和非生物脅迫等方面起重要作用。

2.5 DlPIFs家族的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

使用龍眼、擬南芥、水稻和甜橙4個(gè)物種的PIF蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖5）。根據(jù)其進(jìn)化親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近，將PIFs家族初步分為6大類(lèi)（Class Ⅰ～VI），DlPIF6屬于 Class Ⅱ，DlPIF7和DlPIF8屬于 Class Ⅲ，DlPIF1-1和DlPIF4屬于Class V，DlPIF1-2、DlPIF3和DlPIF5屬于Class VI。DlPIFs家族與擬南芥和甜橙親緣關(guān)系較近。

圖5 龍眼、擬南芥、水稻、甜橙PIFs家族系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.5 Phylogenetic tree of PIF families in Arabidopsis thaliana, Oryza sativa L., Citrus sinensis, and D.longan

2.6 DlPIFs家族在不同組織器官的轉(zhuǎn)錄組基因表達(dá)水平分析

轉(zhuǎn)錄組基因表達(dá)水平結(jié)果（圖6）顯示，從整體上看DlPIFs在不同組織器官的表達(dá)水平在龍眼葉中最高，遠(yuǎn)高于莖、花蕾、果肉、果皮、種子、幼果和花，在根中最低。DlPIF1-1的表達(dá)量在種子中最高，推測(cè)DlPIF1-1對(duì)種子的發(fā)育過(guò)程具有重要作用；DlPIF1-2的表達(dá)量在果肉中最高，推測(cè)DlPIF1-2對(duì)果肉的發(fā)育過(guò)程具有重要作用；DlPIF4的表達(dá)量在莖中最高，推測(cè)DlPIF4對(duì)莖的發(fā)育具有重要作用；DlPIF5的表達(dá)量在花蕾中最高，推測(cè)DlPIF5對(duì)花蕾的發(fā)育具有重要作用；DlPIF7和DlPIF8的表達(dá)量在葉中最高，推測(cè)DlPIF7和DlPIF8對(duì)葉的發(fā)育均具有重要作用。由上述結(jié)果可知，DlPIFs家族成員與龍眼不同組織器官的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程有著重要的聯(lián)系，在其中發(fā)揮著重要的功能。

圖6 DlPIFs家族在非胚性和胚性培養(yǎng)物和不同組織器官的表達(dá)量熱圖Fig.6 Heat map of expressions of DlPIFs in non-embryogenic and embryogenic cultures and various tissues and organs

2.7 DlPIFs家族在不同光質(zhì)和不同溫度處理下的轉(zhuǎn)錄組基因表達(dá)水平分析

不同光質(zhì)處理下的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析得出（圖7），除DlPIF7以外，其他DlPIFs家族成員均在不同光質(zhì)處理下有不同程度的表達(dá)；DlPIF1-1、DlPIF5和DlPIF8在藍(lán)光處理下的表達(dá)量明顯高于對(duì)照，推測(cè)DlPIF1-1、DlPIF5和DlPIF8能夠響應(yīng)藍(lán)光的調(diào)控；DlPIF4在白光和藍(lán)光處理下的表達(dá)量均明顯高于對(duì)照，推測(cè)DlPIF4能夠響應(yīng)藍(lán)光和白光的調(diào)控；DlPIF1-2在3種光質(zhì)處理下的表達(dá)量差別不明顯，推斷DlPIF1-2對(duì)不同光質(zhì)的響應(yīng)程度差別不明顯。DlPIFs成員在不同光質(zhì)處理下呈現(xiàn)不同的表達(dá)模式，推測(cè)DlPIFs成員能響應(yīng)光信號(hào)。

圖7 DlPIFs家族在不同光質(zhì)條件下的表達(dá)量熱圖Fig.7 Heat map of expressions of DlPIFs exposed to varied light

不同溫度處理下的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析得出（圖8），相對(duì)高溫（35 ℃）促進(jìn)DlPIF4和DlPIF6的表達(dá)，抑制DlPIF1-1、DlPIF1-2、DlPIF3和DlPIF8的表達(dá)；相對(duì)低溫（15 ℃）促進(jìn)DlPIF1-1、DlPIF3和DlPIF5的表達(dá)，抑制DlPIF1-2、DlPIF4、DlPIF6和DlPIF8的表達(dá)。綜上所述，DlPIFs成員在不同溫度處理下有著不同的表達(dá)模式，說(shuō)明DlPIFs大多數(shù)成員可能參與溫度的調(diào)控，并且對(duì)溫度的調(diào)控存在不同的作用。

圖8 DlPIFs家族在不同溫度條件下的表達(dá)量熱圖Fig.8 Heat map of expressions of DlPIFs under different temperatures

2.8 DlPIFs家族在龍眼體胚發(fā)生早期的表達(dá)分析

龍眼體胚發(fā)生早期的qRT-PCR結(jié)果（圖9）顯示，DlPIF1-1、DlPIF5、DlPIF6和DlPIF8的表達(dá)量隨著龍眼體胚早期的發(fā)育不斷下降，推測(cè)DlPIF5、DlPIF6和DlPIF8DlPIF1-1、DlPIF5、DlPIF6和DlPIF8在龍眼體胚發(fā)育進(jìn)程中具有相似的功能。DlPIF1-2和DlPIF3的表達(dá)量在EC到ICpEC階段下降，在ICpEC到GE階段上升，DlPIF4和DlPIF7的表達(dá)模式與之相反，推測(cè)DlPIF1-2和DlPIF3與DPIF4和DlPIF7對(duì)龍眼體胚發(fā)育進(jìn)程具有相反的作用。綜上所述，DlPIFs家族不同成員在龍眼體胚發(fā)生早期具有不同的表達(dá)模式，可能通過(guò)相同或者不同的分子調(diào)控機(jī)制調(diào)節(jié)龍眼體胚的早期發(fā)育過(guò)程。

圖9 龍眼PIFs家族體胚發(fā)生階段表達(dá)分析Fig.9 Expressions of DlPIFs during somatic embryogenesis

2.9 DlPIFs家族在不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑處理下的表達(dá)分析

利用qRT-PCR技術(shù)對(duì)不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑處理下的龍眼愈傷組織中DlPIFs基因的表達(dá)水平進(jìn)行分析（圖10），結(jié)果顯示，在GA3和ABA處理下，DlPIF3、DlPIF5和DlPIF7的表達(dá)量與對(duì)照相比有明顯提高，推測(cè)DlPIF3、DlPIF5和DlPIF7能響應(yīng)GA3和ABA的調(diào)控；2,4-D和SA處理下，DlPIF5和DlPIF7的表達(dá)量與對(duì)照相比有明顯提高，推測(cè)DlPIF5和DlPIF7能響應(yīng)2,4-D和SA的調(diào)控；在MeJA處理下，DlPIF1-2、DlPIF5和DlPIF7的表達(dá)量與對(duì)照相比有明顯提高，推測(cè)DlPIF1-2、DlPIF5和DlPIF7能響應(yīng)MeJA的調(diào)控。綜上所述，DlPIF5和DlPIF7的表達(dá)量在5種生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑處理下都具有明顯變化，推測(cè)DlPIF5和DlPIF7是響應(yīng)激素調(diào)控的主要成員。

圖10 生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑處理下DlPIFs基因的相對(duì)表達(dá)量Fig.10 Expressions of DlPIFs in response to exogenous hormones

顯著性差異分析發(fā)現(xiàn)，在5種生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑處理下，DlPIFs家族的大多數(shù)成員在不同時(shí)間處理下的表達(dá)量具有顯著性差異。

3 討論

3.1 DlPIFs家族的鑒定和功能的多樣性

近幾年，隨著對(duì)PIF基因家族研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)PIFs基因家族轉(zhuǎn)錄因子不僅在光信號(hào)中具有重要作用，在植物生長(zhǎng)發(fā)育的多個(gè)方面都起到關(guān)鍵信號(hào)節(jié)點(diǎn)作用。目前研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥（Arabidopsis thaliana）中有7個(gè)PIFs家族成員（PIF1，PIF3～PIF8）；水稻中有6個(gè)PIFs家族成員（OsPIL11～OsPIL16）；玉米（Zea maysL.）中有7個(gè)PIFs家族成員（ZmPIF1～ZmPIF7）[31-32]；香蕉（Musa nanaLour.）中有7個(gè)PIFs家族成員（MaPIF1、MaPIF1-1、MaPIF3、MaPIF3-1、MaPIF4、MaPIF4-1、MaPIF）[33]；馬鈴薯（Solanum tuberosumL.）中有7個(gè)PIFs家族成員（St PIF1a、St PIF1b、StPIF3、St PIF4、St PIF7a、St PIF7b、St PIF8）[34]；白菜（Brassica rapa）中有10個(gè)PIFs家族成員（BrPIF1-BrPIF10）[34]。本研究鑒定出龍眼PIFs家族8個(gè)具有bHLH結(jié)構(gòu)域的成員。基因結(jié)構(gòu)和保守基序分析發(fā)現(xiàn)，部分成員之間具有相似的基因結(jié)構(gòu)和保守基序，推測(cè)成員的功能存在一定的保守性。亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn)DlPIFs成員均位于細(xì)胞核，這與袁凌云等[35]在白菜和吳廣霞[36]在玉米中的研究一致。植物細(xì)胞內(nèi)擁有3套獨(dú)立的基因組，即細(xì)胞核基因組、線粒體基因組和葉綠體基因組。除去擁有巨大遺傳信息的細(xì)胞核之外，線粒體和葉綠體是植物細(xì)胞中具有雙膜系統(tǒng)的細(xì)胞器，它們的發(fā)育和增殖是受細(xì)胞核基因組及其自身基因兩套遺傳系統(tǒng)的控制，稱(chēng)為半自主性細(xì)胞器[37]。染色體定位發(fā)現(xiàn)，大部分DlPIFs成員定位于染色體上，而DlPIF3未定位于染色體，推測(cè)該基因?yàn)槿~綠體或線粒體基因。啟動(dòng)子順式作用元件分析有助于預(yù)測(cè)基因潛在的功能，進(jìn)化樹(shù)和啟動(dòng)子順式作用元件分析發(fā)現(xiàn)，親緣關(guān)系較近的成員所含有的順式作用元件種類(lèi)相似，不同成員之前包含的順式作用元件數(shù)量和種類(lèi)有所差別，說(shuō)明DlPIFs成員之間具有相同或者不同的生物學(xué)功能。

PIFs通過(guò)介導(dǎo)光信號(hào)，參與植物的光形態(tài)建成[38]。在擬南芥中PIF3負(fù)調(diào)控或者正調(diào)控植物幼苗的光反應(yīng)[6,39-40]，PIF1、PIF4和PIF5可以負(fù)調(diào)控幼苗的各種光反應(yīng)[11,15,41]，PIF7是紅光下幼苗去黃化的負(fù)調(diào)控因子[42]，PIF6是植物光反應(yīng)的正調(diào)控因子[43]。與前人研究相同，本研究對(duì)DlPIFs家族進(jìn)行順式作用元件分析得出DlPIFs家族各成員均含有與光響應(yīng)有關(guān)的作用元件且對(duì)不同光質(zhì)處理下DlPIFs轉(zhuǎn)錄組基因表達(dá)水平進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)DlPIFs成員普遍在藍(lán)光下表達(dá)量最高，在白光和黑暗處理下表達(dá)量較低。

PIFs不僅能夠響應(yīng)光信號(hào)，影響植物的光形態(tài)建成，還響應(yīng)非生物脅迫。前人研究表明光敏色素在參與調(diào)控植物對(duì)干旱脅迫的耐受性的過(guò)程中，phyB是主要的調(diào)控因子，在擬南芥中，PIF3和PIF4可能在phyB下游調(diào)控氣孔的開(kāi)合中起作用[44]；在玉米中，ZmPIFs均受到干旱脅迫的誘導(dǎo)，而且其中起主要作用的是ZmPIF1和ZmPIF3[45]。本研究對(duì)DlPIFs家族進(jìn)行順式作用元件分析得出PIF1-1、PIF1-2、PIF3、PIF4、PIF5、PIF6和PIF8含有與干旱響應(yīng)相關(guān)作用元件。有研究發(fā)現(xiàn)在高溫條件下，PIF4 能通過(guò)激活生長(zhǎng)素的合成基因YUC8和TAA1促進(jìn)生長(zhǎng)素應(yīng)答基因IAA19和IAA29的表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)植物下胚軸和葉柄伸長(zhǎng)[46]，并有研究發(fā)現(xiàn)高溫下phyB可以促進(jìn)HMR（phyB的互作蛋白）的積累，HMR進(jìn)一步與PIF4相互作用，從而促進(jìn)高溫響應(yīng)基因的表達(dá)[47]。低溫條件下，植物低溫脅迫響應(yīng)路徑的調(diào)控因子EBF1和 EBF2蛋白（能夠通過(guò)26S蛋白酶體直接靶向降解PIF3）降解使PIF3蛋白更加穩(wěn)定從而 抑制CBFs及其下游低溫響應(yīng)基因表達(dá)。此外，擬南芥PIF4和PIF7也能通過(guò)光周期依賴(lài)方式下調(diào)CBFs基因的表達(dá)來(lái)降低植物抵抗低溫的能力[48]。本研究發(fā)現(xiàn)DlPIFs家族中PIF1-1、PIF1-2、PIF5、PIF6和PIF8含有與低溫響應(yīng)相關(guān)的作用元件，并且對(duì)溫度處理的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析得出，相對(duì)高溫（35 ℃）促進(jìn)DlPIF4和DlPIF6的表達(dá)，抑制DlPIF1-1、DlPIF1-2、DlPIF3和DlPIF8的表達(dá)；相對(duì)低溫（15 ℃）促進(jìn)DlPIF1-1、DlPIF3和DlPIF5的表達(dá)，抑制DlPIF1-2、DlPIF4、DlPIF6和DlPIF8的表達(dá)，此研究結(jié)果與前人研究相符。還有研究發(fā)現(xiàn)CCA1/LHY屬于MYB家族轉(zhuǎn)錄因子，是生物鐘的核心組件，PIFs能夠結(jié)合CCA1/LHY啟動(dòng)子的G-box區(qū)域，參與生物鐘的調(diào)控[49]。本研究結(jié)果表明DlPIF1-1、DlPIF3和DlPIF4存在與生物鐘響應(yīng)相關(guān)的作用元件，與前人研究相符。

3.2 DlPIFs家族可能參與龍眼激素信號(hào)途徑

植物激素能以微小的含量調(diào)控植物的生命活動(dòng)，是植物感受外部環(huán)境變化、調(diào)節(jié)自身生長(zhǎng)狀態(tài)、抵御不良環(huán)境及維持生存必不可或缺的信號(hào)分子。在擬南芥中，脫落酸（ABA）激活PIF3和PIF6的表達(dá)，但抑制PIF1的表達(dá)，生長(zhǎng)素（IAA）和茉莉酸甲酯（MeJA）分別抑制PIF5、PIF4和PIF8[8]。在玉米中，外源施加GA能顯著誘導(dǎo)ZmPIF5和ZmPIF6表達(dá)，與在ABA脅迫下的反應(yīng)相反，兩者可能作為ABA與GA信號(hào)的連結(jié)點(diǎn)[44]。有研究表明，在番茄（Lycopersicon esculentum）植株中，PIF4可以通過(guò)誘導(dǎo)JA和ABA合成基因的表達(dá)，從而促進(jìn)JA和ABA積累，抑制GA合成基因的表達(dá)，降低GA含量[50]。本研究發(fā)現(xiàn)，PIFs具有多種激素響應(yīng)元件，如生長(zhǎng)素、赤霉素、脫落酸、水楊酸、茉莉酸甲酯，且對(duì)不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑下表達(dá)量水平進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，DlPIF5和DlPIF7的表達(dá)量在5種生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑處理下都具有明顯變化，與前人研究相符。因此，推測(cè)DlPIFs參與龍眼激素信號(hào)途徑。

3.3 DlPIFs家族可能參與龍眼不同組織部位生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控

PIFs家族在不同植物的不同組織部位存在不同水平的表達(dá)。在擬南芥中，PIF1、PIF3和PIF4在幼苗和葉片中的表達(dá)量較高，PIF6在花和果實(shí)中的表達(dá)量較高，在嫩芽中，PIF5的表達(dá)量高于其他成員，PIF3在不同器官中的表達(dá)水平相似，而PIF8在所有地上器官中的表達(dá)水平相對(duì)較高[8]。在楊樹(shù)中，PtPIF1、PtPIF3和PtPIF8a在成熟葉中的表達(dá)水平較高，PtPIF3、PtPIF8a和PtPIF9b在幼葉中表達(dá)水平較高，PtPIF3b、PtPIF4、PtPIF5a、PtPIF9a和PtPIF10在各組織中的表達(dá)水平較低，PtPIF4和PtPIF5b只在成熟葉中表達(dá)[23]。與上述研究相似，DlPIFs成員在龍眼不同組織部位具有不同程度的表達(dá)水平，其中，DlPIF1-1在龍眼不同組織部位均具有較高的表達(dá)量，DlPIF4、DlPIF7和DlPIF8 在莖和葉中高表達(dá)，DlPIF5和DlPIF8 在花中高表達(dá)，在花蕾中6個(gè)DlPIFs成員的表達(dá)量均具有較高表達(dá)，DlPIF4和DlPIF8 在幼果和果皮中高表達(dá)，DlPIF1-2在果肉中高表達(dá)，DlPIF1-2在種子中有較高的表達(dá)。整體來(lái)看，在葉中的表達(dá)水平最高，在根中的表達(dá)水平最低，這與Gao等[32]在玉米中的發(fā)現(xiàn)一致。因此，表明DlPIFs是龍眼生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程不可或缺的調(diào)控因子。

3.4 DlPIFs家族可能參與龍眼胚胎早期發(fā)育的調(diào)控

溫度和光照時(shí)間是影響棉花離體胚成苗的關(guān)鍵因素，適宜溫度和光照時(shí)間有利于離體胚的成苗和根系發(fā)育，溫度30 ℃、光照時(shí)間24 h的培養(yǎng)條件下，離體胚的水培成苗效果好，可作為早熟陸地棉離體胚成苗培養(yǎng)的適宜條件[51]。蜜瓜外植體培養(yǎng)中，在不同的光質(zhì)條件下愈傷組織的形成率有明顯的差異，其中，藍(lán)光對(duì)愈傷組織的形成有明顯的促進(jìn)作用[52]。還有研究發(fā)現(xiàn)，溫度對(duì)山核桃體胚發(fā)生具有一定影響，當(dāng)培養(yǎng)溫度在30 ℃時(shí)誘導(dǎo)率最高，當(dāng)培養(yǎng)溫度高于30 ℃或低于24 ℃時(shí)，誘導(dǎo)率均較低，并且出現(xiàn)較多畸形胚[53]。本研究得出，DlPIFs家族對(duì)溫度和光照等條件均有不同程度的表達(dá)，可能參與光照和溫度的調(diào)控，并且DlPIFs家族不同成員在龍眼體胚發(fā)生早期具有不同的表達(dá)模式。所以，推測(cè)DlPIFs家族可能通過(guò)不同的分子調(diào)控機(jī)制調(diào)節(jié)龍眼體胚的早期發(fā)育過(guò)程。