張武君，趙云青，劉保財(cái)，陳菁瑛 ，黃穎楨，程遠(yuǎn)航

（1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物資源研究所，福建 福州 350003；2.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院藥用植物研究中心，福建 福州 350003）

0 引言

【研究意義】多花黃精（Polygonatum cyrtonemaHua）為百合科黃精屬多年生草本植物，以干燥根莖入藥，其性甘平，歸脾、肺、腎經(jīng)，具有補(bǔ)氣養(yǎng)陰，健脾，潤肺，益腎之功效，用于治療脾胃氣虛、胃陰不足，肺虛燥咳，精血不足，須發(fā)早白，內(nèi)熱消渴等疾病[1]，是傳統(tǒng)經(jīng)典的藥食兩用植物?，F(xiàn)代研究也表明其含多糖、甾體皂苷類、黃酮類、苯丙素類、生物堿類等多種成分，具有抗氧化、抗骨質(zhì)疏松、抗腫瘤等廣泛藥理作用[2]。近年來，隨著黃精需求量的不斷增加，野生資源銳減，已不能滿足市場(chǎng)需求，因此各地開始對(duì)黃精進(jìn)行人工栽培，目前主要采用塊莖和種子進(jìn)行繁殖。塊莖繁殖應(yīng)用較多，但其繁殖系數(shù)低，且存在多代繁殖后品質(zhì)嚴(yán)重退化的問題[3]；種子繁殖具有繁殖系數(shù)高的優(yōu)點(diǎn)，但其種子休眠周期長、成苗率低，嚴(yán)重影響了多花黃精種子育苗產(chǎn)業(yè)發(fā)展。研究多花黃精種子層積過程的生理變化，從而了解多花黃精種子萌發(fā)調(diào)控，對(duì)多花黃精產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】已有研究表明多花黃精種子休眠由種皮[4]、胚[5]、 胚乳[6]、內(nèi)源抑制物[7]等因素共同作用所致，戶外自然變溫沙藏或4 ℃低溫層積4—5月基本能打破休眠[8-9]，王占紅等[10]研究認(rèn)為去果皮戶外沙藏效果更好，陳松樹等[11]認(rèn)為從育苗質(zhì)量和管理成本考慮，建議多花黃精果實(shí)采摘搓洗后的種子和濕沙混勻放在室外貯藏，待次年2月底播種較好?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】陳怡等[9,12]研究表明黃精 在4 ℃濕沙層積和28 ℃催芽萌發(fā)條件下的內(nèi)源激素吲哚-3-乙酸(IAA)、反式玉米素核苷(tZR)、赤霉素A3(GA3)、脫落酸(ABA)，淀粉酶、抗氧化酶、葡萄糖-6-6磷酸脫氫酶（G-6-PDH）等酶活性，可溶性糖、可溶性蛋白、淀粉等貯藏物質(zhì)的變化。成京晉等[13]研究表明黃精在20℃、4 ℃和20 ℃與4 ℃交替等3種溫度模式下濕沙層積70 d的內(nèi)源激素IAA、CTK、GA3、ABA的變化，在自然變溫條件下濕沙層積至種子大量萌發(fā)過程的生理變化、多花黃精層積過程中茉莉酸類、水楊酸類及乙烯類內(nèi)源激素含量變化左究鮮見報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究采用濕沙層積的方法，探究在自然變溫條件下多花黃精種子從采后到大量萌發(fā)5個(gè)月間的主要貯藏物質(zhì)含量及酶活性變化，并采用超高效液相色譜-三重四極桿離子阱質(zhì)譜聯(lián)用（UHPLC-QTRAP-MS/MS）技術(shù)，測(cè)定7類共17種內(nèi)源激素含量變化，研究自然變溫條件下多花黃精萌發(fā)過程的生理變化，為縮短多花黃精種子萌發(fā)時(shí)間、提高萌發(fā)率的技術(shù)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 儀器 UV-1780分光光度計(jì)(日本SHIMADZU公司)；SCIEX 6500 QTRAP+三重四極桿質(zhì)譜儀（美國SCIEX公司）；ExionLC System超高效液相色譜儀（美國SCIEX公司）；2.1 mm×150 mm， 1.7 μm Acquity UPLC CSH C18色譜柱（美國Waters公司）；JXFSTPRP-24研磨儀（上海凈信科技有限公司）；YM-080S超聲儀（深圳市方奧微電子有限公司）；12 position固相萃取儀（德國 CNW Technologies公司）；Oasis?PRiME HLB 1cc（30 mg）SPE固相萃取小柱（美國Waters公司）。

1.1.2 試劑 植物淀粉含量試劑盒、植物纖維素含量試劑盒、可溶性糖含量試劑盒、BCA法可溶性蛋白含量試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)活性試劑盒、過氧化物酶(POD) 活性試劑盒、過氧化氫酶(CAT)活性試劑盒、α-淀粉酶試劑盒、β-淀粉酶試劑盒、6-磷酸葡萄糖脫氫酶(6-PGDH) 試劑盒、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶（NADK）活性試劑盒（蘇州科銘生物技術(shù)有限公司）；3-吲哚丁酸（批號(hào)G162446，德國DR.E公司）；順式玉米素（批號(hào)001-0321，捷克Olchemim公司）；3-吲哚乙酸、水楊酸（美國Merck-SIGMA公司）；3-吲哚甲醛（梯希愛上海化成工業(yè)發(fā)展有限公司）；吲哚-3-乙酸甲酯、異戊烯基腺苷、反式玉米素核苷、反式-玉米素、激動(dòng)素、赤霉素A1、赤霉素A4、赤霉素A7、（±）-茉莉酸（+）-脫落酸（加拿大TRC公司）；二氫茉莉酸、N6-異戊烯基腺嘌呤（上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司）；二氫玉米素、（±）-茉莉酸-異亮氨酸、茉莉酮酸甲酯、水楊酸甲酯、1-氨基環(huán)丙烷羧酸（上海甄準(zhǔn)生物科技有限公司，試劑純度均大于98%）；赤霉素 A3（捷克Olchemim公司，純度＞90%）；試驗(yàn)用水為超純水；甲醇、乙腈、甲酸均為色譜純（德國CNW Technologies公司），其余試劑均為分析純。

1.1.3 種子材料 試驗(yàn)材料（自然成熟的果實(shí)）于2019年10月15日采自福建省邵武市和平鎮(zhèn)多花黃精種植基地，經(jīng)福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院陳菁瑛研究員鑒定為多花黃精Polygonatum cyrtonemaHua。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 多花黃精種子處理及取樣 果實(shí)發(fā)酵1周后，揉搓去掉果皮、果肉，漂洗干凈，拌5倍體積細(xì)河沙層積，細(xì)河沙濕度約30%左右、以手握成團(tuán)一觸即散為度。層積處理的種子放置于室外避雨處，定時(shí)少量補(bǔ)水以維持沙子的濕度，每隔1個(gè)月取樣15 g，平均分成6份，每份2.5 g，液氮速凍后-80 ℃保存?zhèn)溆?，樣品信息見?，層積期間氣溫變化見圖1。

表1 樣品信息Table 1 Information on specimens

圖1 多花黃精種子層積期間氣溫變化Fig.1 Temperature changes during P.cyrtonema seeds stratification

1.2.2 貯藏物含量及酶活力變化測(cè)定 取每階段多花黃精種子-80 ℃凍存鮮樣3份，研磨粉碎后稱取適量測(cè)定淀粉、纖維素、可溶性糖（SS）、可溶性蛋白（SP）含量，以及超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶 (POD)、過氧化氫酶(CAT)、α-淀粉酶、β-淀粉酶，6-磷酸葡萄糖脫氫酶(6-PGDH)、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶（NADK）活性，按照對(duì)應(yīng)試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.2.3 內(nèi)源激素提取 取每階段多花黃精種子-80 ℃凍存鮮樣3份，加入液氮采用研磨儀60 Hz研磨60 s后，精密稱取25 mg粉碎后的樣品，加入1 000 μL-40 ℃預(yù)冷的含同位素內(nèi)標(biāo)混合物50%乙腈水溶液，渦旋30 s，冰水浴超聲5 min；40 Hz研磨4 min，冰水浴超聲5 min，重復(fù)2次；10 000 r·min-14 ℃離心15 min；采用固相萃取小柱純化收集洗脫液并氮?dú)獯蹈?，?00 μL 10%乙腈水溶液復(fù)溶，60 Hz勻漿 4 min，冰水浴超聲 5 min；12 000 r·min-14 ℃ 離心10 min，取上清液過0.22 μm微孔濾膜，即得供試品溶液。

1.2.4 內(nèi)源激素測(cè)定 使用EXIONLC System超高效液相色譜儀，液相色譜柱為Acquity UPLC CSH C18（150 mm× 2.1 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相水（含0.01%甲酸）（A）-乙腈（含0.01%甲酸）（B）進(jìn)行梯度洗脫（0～2.0 min，95% A；2.0～11.0 min，95%～43%A；11.0～11.1 min，43%～1% A；11.1～12.5 min，1% A；12.5～12.6 min，1%～95% A；12.6～15.0 min 95% A）；柱溫 50°C，流速 0.4 mL·min-1，樣品盤設(shè)為4°C，進(jìn)樣量為 5 μL。使用裝備 IonDrive Turbo V ESI離子源的SCIEX 6500 QTRAP+三重四極桿質(zhì)譜儀，以多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式進(jìn)行質(zhì)譜分析。離子源參數(shù)：離子化電壓=±4 500 V，離子源溫度475 ℃，氣簾氣壓力：40 psi，噴霧氣：30 psi，輔助加熱氣：30 psi。將目標(biāo)化合物標(biāo)準(zhǔn)溶液引入質(zhì)譜中，針對(duì)每個(gè)目標(biāo)化合物，選取信號(hào)強(qiáng)度最高的數(shù)個(gè)母離子-子離子對(duì)（transition），對(duì)其MRM參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，并選取其中響應(yīng)最好的離子對(duì)用于定量分析，具體參數(shù)見表2，使用SCIEX Analyst Work Station Software（Version 1.6.3）和Sciex MultiQuant? 3.0.3進(jìn)行質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集及目標(biāo)化合物定量分析。

表2 23種目標(biāo)成分測(cè)定中優(yōu)化的質(zhì)譜條件參數(shù)Table 2 Optimized MS/MS parameters on 23 components

1.2.5 內(nèi)源激素方法學(xué)考察 參考?imura等[14]的方法，結(jié)果表明，色譜峰峰面積與化合物濃度間呈良好的定量關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（r）均大于0.996。精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性的方法學(xué)考察的標(biāo)準(zhǔn)相對(duì)偏差（RSD）值均小于3.03%；平均回收率為96.78%～113.82%，RSD值均小于10.28%，該方法能夠準(zhǔn)確可靠地檢測(cè)出樣品中的目標(biāo)激素含量。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Excel 2010 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理、繪圖，應(yīng)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行多重比較和雙變量相關(guān)性分析，差異顯著性檢驗(yàn)采用Duncan’s法，相關(guān)性采用Pearson相關(guān)系數(shù)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 貯藏物質(zhì)含量變化

2.1.1 淀粉含量變化 淀粉含量變化是種子代謝狀況的重要指標(biāo)。層積過程多花黃精種子的淀粉含量呈連續(xù)下降的趨勢(shì)（圖2-A），2019-10-23含量為85.4 mg·g-1，2020-03-23 降至 57.5 mg·g-1，較層積初始下降了32.7%，表明層積階段多花黃精種子淀粉持續(xù)分解，為貯藏和萌發(fā)提供能量。

2.1.2 纖維素含量變化 纖維素是植物細(xì)胞壁的主要結(jié)構(gòu)成分。層積過程多花黃精種子的纖維素含量呈持續(xù)下降的趨勢(shì)（圖2-B）。層積第一個(gè)月下降較快，2019-10-23 時(shí)含量為 263.5 mg·g-1，2020-11-23 降至225.2 mg·g-1，下降了14.55%，之后降幅不顯著，2020-03-23較層積初始下降了19.8%，表明層積階段多花黃精細(xì)胞壁發(fā)生降解弱化，并為貯藏和萌發(fā)提供能量。

2.1.3 可溶性糖含量變化 SS在種子萌發(fā)過程中可作為直接能量來源，同時(shí)又參與滲透調(diào)節(jié)，與抗寒性相關(guān)[15]。層積過程多花黃精種子的SS含量呈降-升-降-升的趨勢(shì)（圖2-C），2019-11-23降至18.8 mg·g-1，可能是層積過程呼吸作用消耗所致；之后受環(huán)境低溫影響緩慢上升，2020-01-23升至28.8 mg·g-1；2020-02-23小幅下降；萌發(fā)后由于貯藏的淀粉大量分解，SS含量迅速上升至35.1 mg·g-1，較最低值提高了86.14%，表明SS含量變化與抗寒和萌發(fā)物質(zhì)動(dòng)員有關(guān)。

2.1.4 可溶性蛋白含量變化 SP多數(shù)是參與各種代謝的酶類，也是重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和營養(yǎng)物質(zhì)，SP的積累有利于抗寒性的提高[16]。層積過程多花黃精種子的SP含量呈下降-上升-下降的趨勢(shì)（圖2-D），2019-11-23較2019-10-23下降了13.8%，可能是由于層積過程部分SP轉(zhuǎn)化成貯藏蛋白；之后緩慢上升，2020-01-23 達(dá)到最高值，為 47.9 mg·g-1，2020-01-23至2020-02-23受環(huán)境低溫影響維持在較高水平；萌發(fā)后迅速降至24.1 mg·g-1，較最高值降低了49.8%，這主要是新組織形成和分化的消耗造成，表明SP含量變化與抗寒和萌發(fā)物質(zhì)動(dòng)員有關(guān)。

圖2 多花黃精種子層積過程貯藏物質(zhì)含量變化Fig.2 Changes on accumulated substances in P.cyrtonema seeds during stratification

2.2 酶活力變化

2.2.1 保護(hù)酶活性變化 SOD、POD、CAT是植物細(xì)胞內(nèi)較為重要的保護(hù)酶，它們協(xié)調(diào)作用，防止細(xì)胞內(nèi)活性氧水平過高，低溫脅迫可誘發(fā)酶活性上升[16]。層積過程多花黃精種子的SOD、POD活性變化趨勢(shì)均為降-升-降，CAT活性變化趨勢(shì)為先升后降（圖3-A、B、C）。2019-11-23時(shí)，SOD、POD酶活性較2020-10-23顯著下降，CAT酶活性較2020-10-23略有上升但不顯著，之后3個(gè)保護(hù)酶活性持續(xù)上升，2020-01-23達(dá)到最大值后持續(xù)下降。2020-01-23時(shí)3個(gè)保護(hù)酶活性升高至峰值，很可能受到環(huán)境低溫的影響。

圖3 多花黃精種子層積過程期SOD、POD、CAT活性變化Fig.3 Changes on SOD, POD, and CAT activities in P.cyrtonema seeds during stratification

2.2.2 淀粉酶活性變化 淀粉酶根據(jù)作用的方式可分為α-淀粉酶與β-淀粉酶，二者共同將淀粉分解成麥芽糖、葡萄糖、糊精等可溶性糖類物質(zhì)。后熟過程多花黃精種子的α-淀粉酶活性變化趨勢(shì)為降-升-降-升變化，β-淀粉酶活性呈升-降-升變化，二者均在2020-01-23和2020-03-23活性顯著提高，與SS含量的變化趨勢(shì)相同，表明SS含量變化與淀粉酶作用密切相關(guān)。（圖4-A、B）。

圖4 多花黃精種子層積過程α-淀粉酶、β-淀粉酶活性變化Fig.4 Changes on α- amylase and β-amylase activities in P.cyrtonema seeds during stratification

2.2.3 6-PGDH和NADK活性變化 許多休眠種子的休眠解除都檢測(cè)到與磷酸戊糖途徑（PPP）有關(guān)[17]，6-PGDH是PPP的關(guān)鍵限速酶，能夠催化6-磷酸葡萄糖脫氫，形成6-磷酸葡糖酸，同時(shí)將NADP+還原為NADPH，用于脂肪酸等的還原性生物合成。后熟過程多花黃精種子6-PGDH活性變化趨勢(shì)為升-降-升（圖5-A），2019-11-23活性較2019-10-23顯著升高，表明采后1個(gè)月種子內(nèi)部仍在進(jìn)行較強(qiáng)的還原性生物合成；2019-11-23至2020-02-23活性持續(xù)下降，2020-02-23降至最低，表明萌發(fā)前物質(zhì)合成作用不斷減弱；2020-03-23的升高則表明萌發(fā)后隨著新組織形成，生物成合成作用再次加強(qiáng)。NADK能催化NAD+磷酸化，生成NADP+，其活性增加有利于抑制電子傳遞，降低呼吸作用[18]。多花黃精種子NADK活性變化趨勢(shì)為降-升-降（圖5-B），2019-10-23至2020-01-23變化較為平緩；2020-02-23迅速升高后大幅下降，表明萌發(fā)前的呼吸代謝受到明顯的抑制；萌發(fā)后NAD激酶活性大幅下降，表明萌發(fā)后電子傳遞活躍，呼吸作用增強(qiáng)。

圖5 多花黃精種子層積過程6-PGDH、NADK酶活性變化Fig.5 Changes on 6-PGDH and NADK activities in P.cyrtonema seeds during stratification

2.3 營養(yǎng)物質(zhì)與酶活力含量相關(guān)性

由表3可知，纖維素含量與淀粉含量呈顯著正相關(guān)；SS含量與α-淀粉酶、β-淀粉酶活性之間均呈極顯著正相關(guān)；淀粉含量與SS含量、α-淀粉酶、β-淀粉酶活性呈顯著或極顯著負(fù)相關(guān)；SP含量與SOD、POD酶活性呈極顯著正相關(guān)，與β-淀粉酶、6-PGDH酶活性呈顯著負(fù)相關(guān)；SOD與POD、NADK酶活性呈極顯著正相關(guān)；POD和CAT酶活性呈極顯著正相關(guān)；NADK酶活性與SS含量、α-淀粉酶、β-淀粉酶活性呈顯著或極顯著負(fù)相關(guān)，與SP含量呈極顯著正相關(guān)；6-PGDH與NADK酶活性呈顯著負(fù)相關(guān)。表明纖維素和淀粉的變化趨勢(shì)相同，淀粉在淀粉酶的作用下轉(zhuǎn)化為SS，淀粉酶活性增強(qiáng)分解成SS表明呼吸作用加強(qiáng)，與NADK酶活性的作用相反，3個(gè)保護(hù)酶之間的變化有一定的正相關(guān)性。

表3 多花黃精種子層積過程貯藏物質(zhì)與酶的相關(guān)性Table 3 Correlation between accumulated substances and enzymes of P.cyrtonema seeds during stratification

2.4 17種內(nèi)源激素含量變化

基于UHPLC-QTRAP-MS/MS技術(shù)測(cè)定了多花黃精種子層積過程中6個(gè)不同時(shí)期的7大類23種內(nèi)源激素含量，共測(cè)出17種內(nèi)源激素，包括3種茉莉酸類、7種細(xì)胞分裂素類、3種生長素類，以及GA7、ABA、SA、ACC，結(jié)果見圖6～9。

2.4.1 茉莉酸類物質(zhì)含量變化 茉莉酸類物質(zhì)是參與調(diào)控種子萌發(fā)的一個(gè)重要內(nèi)部因素，其與脫落酸(ABA)協(xié)同抑制種子的萌發(fā)[19]。由圖6可知，層積過程多花黃精種子的JA、JA-Ile含量變化均為先顯著升高后降低，且分別在2019-12-23和2020-01-23含量達(dá)到最高，較層積初始分別提高了6.0倍和9.6倍，H2-JA含量在前、中期較高，后逐漸下降。至萌發(fā)后 JA、JA-Ile已無法測(cè)出，僅能測(cè)出H2-JA。表明茉莉酸類物質(zhì)通過在層積的前中期交替升高來維持種子的休眠狀態(tài)。

圖6 多花黃精種子層積過程茉莉酸類物質(zhì)含量變化Fig.6 Changes on jasmonates content in P.cyrtonema seeds during stratification

2.4.2 細(xì)胞分裂素類物質(zhì)含量變化 細(xì)胞分裂素(CTK)能通過與乙烯、ABA、生長素、赤霉素（GAS）等相互作用影響種子的萌發(fā)和幼苗早期發(fā)育[20-21]。由圖7可知，層積過程多花黃精種子的IPA、K、tZ、cZ、dh-Z含量均呈連續(xù)下降的趨勢(shì)，IP、tZR含量在 2019-10-23分別為 10.3、10.9 nmol·kg-1，之后連續(xù)緩慢下降，2020-02-23分別降至2.6、3.7 nmol·kg-1，萌發(fā)后分別快速升高至 21.3、8.6 nmol·kg-1，分別較2020-02-23上升了7.3、1.3倍，表明IP、tZR促進(jìn)萌發(fā)。

圖7 多花黃精種子層積過程細(xì)胞分裂素類物質(zhì)含量變化Fig.7 Changes on cytokinins content in P.cyrtonema seeds during stratification

2.4.3 生長素類物質(zhì)含量變化 由圖8可知，多花黃精種子的IAA含量在層積一個(gè)月后從1 775.4 nmol·kg-1急劇下降至 263.1 nmol·kg-1，較層積初始下降了85.18%，至萌發(fā)前變化較為平緩；ICA、ME-IAA在采收后同樣呈下降趨勢(shì)，表明生長素類含量在層積過程中降低。萌發(fā)后由于胚的生長，IAA顯著升高至1 211.4 nmol·kg-1，較 2020-02-23 上升了 5.3 倍； ICA顯著升高至 148.4 nmol·kg-1，較 2020-02-23 上升了2.6倍，表明ICA、IAA促進(jìn)萌發(fā)。

圖8 多花黃精種子層積過程生長素類物質(zhì)含量變化Fig.8 Changes on auxins content in P.cyrtonema seeds during stratification

2.4.4 GA7含量變化 GA在種子萌發(fā)過程中起到增加胚的生長勢(shì)和弱化包圍胚根的屏障組織作用[22]。本研究測(cè)定了GA1, GA3, GA4和 GA7，僅測(cè)出GA7含量。由圖9-A可知，層積過程多花黃精種子的GA7含量呈上升趨勢(shì)。2019-10-23時(shí)含量僅為6.0 nmol·kg-1，2020-02-23升至231.7 nmol·kg-1，較層積初始上升了37.4倍，剛萌發(fā)時(shí)升至1 897.1 nmol·kg-1，較2020-02-23提高了7.2倍，表明GA7促進(jìn)休眠解除和萌發(fā)。

圖9 多花黃精種子層積過程赤霉素A7、脫落酸、水楊酸、1-氨基環(huán)丙烷羧酸含量變化Fig.9 Changes on GA7, ABA, SA, and ACC contents in P.cyrtonema seeds during stratification

2.4.5 ABA含量變化 ABA是種子休眠誘導(dǎo)和維持的正調(diào)控因子，萌發(fā)的負(fù)調(diào)控因子[23]。由圖9-B可知，層積過程多花黃精種子的ABA含量呈連續(xù)下降趨勢(shì)。層積第一個(gè)月ABA含量從226.3 nmol·kg-1下降至69.4 nmol·kg-1，較層積初始下降了69.3%，剛萌發(fā)時(shí)降至27.3 nmol·kg-1，較層積初始下降了87.9%，表明ABA含量下降促進(jìn)休眠解除和萌發(fā)。

2.4.6 SA含量變化 SA是一種酚類激素，不僅可以誘導(dǎo)植物抗逆反應(yīng)，還具有促進(jìn)種子萌發(fā)和幼苗生長的作用[24]。由圖9-C可知，的SA含量在萌發(fā)前呈小幅波動(dòng)趨勢(shì)，萌發(fā)后急劇上升，較2/23未萌發(fā)時(shí)上升了12.4倍，表明SA促進(jìn)萌發(fā)。

2.4.7 ACC含量變化 ACC為高等植物內(nèi)源乙烯的前體物質(zhì)，在氧化酶的作用下轉(zhuǎn)化為乙烯[25]。由圖9-D可知，層積過程多花黃精種子的ACC含量呈連續(xù)上升趨勢(shì)。2019-10-23 時(shí)含量為 484.2 μmol·kg-1，2020-02-23 升至 658.3 μmol·kg-1，較層積初始上升了36.0%，剛萌發(fā)時(shí)急劇上升至 6 464.0 μmol·kg-1，較2020-02-23提高了8.8倍，表明ACC促進(jìn)休眠解除和萌發(fā)。

3 討論與結(jié)論

3.1 層積對(duì)多花黃精種子貯藏物質(zhì)含量與酶活性的影響

陳怡[12]測(cè)得剛采摘的多花黃精種子淀粉含量為42.12%，認(rèn)為其種子為淀粉性種子，而本研究測(cè)得多花黃精種子淀粉、纖維素含量最高值分別為8.5%和26.4%，纖維素含量為淀粉的3倍以上。對(duì)于多花黃精同屬植物黃精（Polygonatum sibiricumRed.）的淀粉測(cè)定也有類似差異，張玉翠[26]測(cè)得黃精鮮種子的淀粉含量為30%～40%，而程秋香[27]測(cè)得鮮黃精種子的淀粉8.50%，纖維素含量高達(dá)32.10%，且認(rèn)為纖維素等是胚乳的主要代謝物質(zhì)。本研究測(cè)得多花黃精種子初始層積至萌發(fā)期間，淀粉和纖維素含量分別下降了32.7%和19.8%，認(rèn)為二者均為種子的主要代謝物質(zhì)。陳怡[12]測(cè)得的酶活性及貯藏物質(zhì)的變化趨勢(shì)與本研究有較大不同，可能是層積溫度不同導(dǎo)致，本研究中SS、SP以及3種保護(hù)酶和淀粉酶含量均在2020-01-23的取樣中顯著提高，很可能是植物對(duì)低溫天氣的適應(yīng)性生理反應(yīng)，2019-12-23至2020-01-23期間的最低溫達(dá)到了0 ℃，為全年最低。冷害脅迫可導(dǎo)致植物活性氧的增加[28]，而活性氧在種子萌發(fā)和休眠解除方面發(fā)揮著重要的信號(hào)作用[29]，活性氧參與生長組織的細(xì)胞壁松弛，分解細(xì)胞壁多糖、調(diào)節(jié)激素在細(xì)胞生長中的作用[30]，推測(cè)低溫處理有助于多花黃精種子的休眠解除。

3.2 層積對(duì)多花黃精種子內(nèi)源激素含量的影響

成京晉等[13]測(cè)定了層積前70 d的種子IAA、GA3、CTK和ABA的含量變化，測(cè)定結(jié)果多為波動(dòng)變化，無明顯變化規(guī)律。陳怡等[9]采用HPLC-MS的檢測(cè)方法，測(cè)定了多花黃精種子萌發(fā)過程的IAA、GA3、tZR和ABA含量變化，其中在層積至剛萌發(fā)階段，ABA含量呈連續(xù)下降趨勢(shì)與本研究相同，IAA、tZR含量變化趨勢(shì)為層積中期達(dá)到最高值與本研究不同，GA3含量的變化規(guī)律與本研究測(cè)得的GA7變化規(guī)律相同，但本研究未測(cè)得GA3含量，可能的主要原因是層積溫度以及測(cè)定方式的不同，其在種子洗去外種皮后有一個(gè)晾干水分備用的過程，且采用4 ℃低溫層積，而本研究在洗去外種皮后立即采用自然變溫沙藏，且本研究由于同時(shí)測(cè)定多個(gè)指標(biāo)，具有一定的側(cè)重性和偏向性，無法測(cè)得含量相對(duì)較低的個(gè)別指標(biāo)，但仍可表明多花黃精種子層積至萌發(fā)過程中GA7含量高于GA3含量。

多花黃精種子萌發(fā)過程中的茉莉酸類物質(zhì)含量變化尚未見報(bào)道。茉莉酸可被甲基化為其揮發(fā)性對(duì)應(yīng)物Me-JA，或與各種糖和氨基酸結(jié)合，其中以JAIle含量最為豐富[31]。Pan等[32]發(fā)現(xiàn)一種JA-Ile的結(jié)構(gòu)類似物能顯著增強(qiáng)ABA對(duì)種子萌發(fā)的抑制效應(yīng)，并揭示了擬南芥種子萌發(fā)過程中茉莉酸鹽對(duì)脫落酸信號(hào)協(xié)同作用的分子機(jī)制。Wang等[33]研究發(fā)現(xiàn)ABA促進(jìn)JA的生物合成，協(xié)同抑制水稻種子發(fā)芽。本研究測(cè)得的H2-JA、JA、JA-Ile分別在ABA含量大幅下降后陸續(xù)提高，在萌發(fā)前降至較低值，表明茉莉酸類物質(zhì)同樣協(xié)同ABA抑制多花黃精種子萌發(fā)。有報(bào)道，Me-JA能抑制玉米種子[34]、黃色羽扇豆[35]等種子的萌發(fā)，但本研究并未測(cè)得Me-JA，表明Me-JA不是多花黃精種子休眠中的主要調(diào)控物質(zhì)。

高等植物中的CTK以IP、tZ、cZ、dh-Z、K，以及tZ和IP型糖的結(jié)合物tZR和IPA較為常見，它們?cè)诓煌参锖徒M織發(fā)育階段的分布和作用不同，其中tZ型具有普遍的生物活性，cZ型活性較弱，但二者在植物界中廣泛存在，且cZ型是植物生長受限條件下CTK應(yīng)答的精細(xì)調(diào)節(jié)因子[36-37]。本研究測(cè)得以上常見的7種CTK在多花黃精種子休眠階段含量均呈下降趨勢(shì)，萌發(fā)時(shí)僅IP和tZR含量顯著升高，表明IP和tZR為主要促進(jìn)萌發(fā)的CTK。

植物生長素主要由吲哚類化合物組成，包括IAA、ICA、ME-IAA、IBA等，其中IAA為最主要的代表性成分。在擬南芥中，IAA在休眠過程中起正向調(diào)控作用，是第二類促進(jìn)種子休眠的激素[38]。本研究發(fā)現(xiàn)，層積過程多花黃精種子的生長素類物質(zhì)含量不斷下降，至萌發(fā)時(shí)再次上升，表明在多花黃精種子中生長素同樣有促進(jìn)休眠的作用。

GA是一個(gè)四環(huán)二萜類的植物激素家族，目前已鑒定出136種GA結(jié)構(gòu)，其中大多數(shù)GA是無生物活性的，主要的生物活性GA包括GA1，GA3，GA4和GA7

[22]。馬煥普等[39]發(fā)現(xiàn)，蘋果種子內(nèi)不同種類GA的發(fā)生器官不同，子葉中以GA3為主，胚軸中以GA7為主， GA7可能通過促進(jìn)胚軸中的合成代謝而直接參與胚軸休眠的解除，而GA3的變化受溫度影響較大，低溫處理后顯著升高。因此，陳怡[9]測(cè)得GA3可能與4 ℃低溫層積處理有關(guān)。此外，多花黃精種子萌發(fā)前胚呈棒狀[5]，并未分化出子葉結(jié)構(gòu)，因此推測(cè)在萌發(fā)前起主要活性作用的GA可能是GA7。在美洲商陸種子萌發(fā)中也發(fā)現(xiàn)，外源GA7的刺激作用強(qiáng)于GA3[40]，表明不同赤霉素對(duì)萌發(fā)的促進(jìn)效果不同。已有研究多采用GA3來促進(jìn)多花黃精種子萌發(fā)[8]，而本研究測(cè)得層積過程內(nèi)源GA7含量相對(duì)較高，推測(cè)外源施用GA7對(duì)多花黃精種子萌發(fā)有更好的促進(jìn)效果。ABA和GAs拮抗調(diào)節(jié)種子休眠和萌發(fā)已被多項(xiàng)研究報(bào)道[41-42]，本研究發(fā)現(xiàn)多花黃精層積過程ABA含量下降，GA7含量上升，表明二者同樣起拮抗作用。

外源SA浸種處理能提高種子萌發(fā)后對(duì)寒冷、鹽、重金屬等非生物脅迫的耐受性[43-45]。本研究中SA含量在未萌發(fā)時(shí)變化較小，萌發(fā)后含量顯著升高，與葛娜等[46]對(duì)三七種子的研究結(jié)果相同。有報(bào)道在植物體內(nèi)SA能大量轉(zhuǎn)變?yōu)镸e-SA，二者在一定劑量下對(duì)擬南芥的萌發(fā)和初期生長有促進(jìn)作用[47]。但本研究并未測(cè)得Me-SA，表明Me-SA可能在多花黃精種子的萌發(fā)過程中不是主要調(diào)控物質(zhì)。

種子的萌發(fā)能力與乙烯的產(chǎn)生有關(guān)，ACC為乙烯前體物質(zhì)，外源施用能明顯促進(jìn)種子乙烯的生成及萌發(fā)[48-49]，因此，本研究中內(nèi)源ACC含量的升高很可能伴隨著乙烯形成的增加，對(duì)休眠解除和萌發(fā)有促進(jìn)作用。有研究表明ACC類似物乙烯利對(duì)打破黃精屬種子的休眠有一定效果[50]。

綜上，自然變溫層積期間，淀粉和纖維素均為多花黃精種子的主要代謝物質(zhì)，保護(hù)酶、淀粉酶及SS、SP含量不斷變化，以適應(yīng)溫度等環(huán)境變化、完成萌發(fā)所需的物質(zhì)儲(chǔ)備，GA7、ACC含量不斷增加，ABA、茉莉酸類、生長素類等萌發(fā)抑制物含量下降。3月中下旬氣溫回升，多花黃精種子休眠解除開始大量萌發(fā)，內(nèi)源激素GA7和ACC促進(jìn)休眠解除和萌發(fā)；生長素ICA、IAA，細(xì)胞分裂素IP、tZR以及水楊酸促進(jìn)萌發(fā)。因此，在多花黃精種子收獲后可采用洗去種皮果肉，室外保濕沙藏至2月底進(jìn)行催芽，可采用ACC或GA7進(jìn)行催芽，以加速打破休眠，萌發(fā)后根據(jù)生長情況采用生長素、細(xì)胞分裂素、水楊酸等物質(zhì)進(jìn)行組合調(diào)控，具體效果有待進(jìn)一步研究。