梁麗娜，李曉宇

疾病動物模型，簡而言之是指具有人類疾病模擬性表現(xiàn)的實驗動物。在人類醫(yī)學(xué)漫長曲折的發(fā)展歷程中，實驗動物做出了不可磨滅的貢獻。巴浦洛夫在犬身上發(fā)現(xiàn)的條件反射奠定了人們對大腦認知行為研究的基礎(chǔ)，HANS SELYE 通過一系列的動物有害刺激實驗創(chuàng)立了“應(yīng)激學(xué)說”，小鼠組織相容性抗原實驗對輸血及器官移植產(chǎn)生了巨大推動作用[1]。目前，動物模型已廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)、食品安全和軍事醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的探索，以及生物醫(yī)藥和健康產(chǎn)品的研發(fā)[2]。在Pubmed 網(wǎng)站（https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/）上檢索近30 年的科研論文中約有2,000 多萬篇是建立于動物模型的研究上，幾乎涵蓋生命科學(xué)與醫(yī)學(xué)的所有領(lǐng)域，實驗動物已成為醫(yī)藥科技創(chuàng)新發(fā)展的重要工具[3]。

隨著中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究的不斷深入，中醫(yī)學(xué)研究已經(jīng)不再局限于經(jīng)典校注、理論思辨和臨床觀察為主的傳統(tǒng)模式，設(shè)計良好的動物實驗和臨床試驗已成為中醫(yī)科研體系的重要組成部分[4]。20世紀60年代，鄺安堃教授首次研制出中醫(yī)陽虛證動物模型，拉開證候動物模型研究的序幕，其后學(xué)者們經(jīng)過不斷地努力及嘗試，逐步將氣血津液辨證、八綱辨證、臟腑辨證、六經(jīng)辨證等融入動物模型的建立，使中醫(yī)證候動物模型得到了很大的充實和發(fā)展[5]?，F(xiàn)已有百余種可以復(fù)制的證候動物模型，并且部分與西醫(yī)疾病模型相結(jié)合，建立了更加符合中醫(yī)臨床實踐的病證結(jié)合模型。中醫(yī)眼科是中醫(yī)學(xué)的重要分支，動物模型對中醫(yī)眼科的研究和發(fā)展有何意義？目前用于中醫(yī)眼科研究的動物模型現(xiàn)狀如何？如何建立具有中醫(yī)眼科特色的動物模型？筆者就上述問題進行了梳理和思考，與大家分享討論，期望對今后相關(guān)領(lǐng)域的研究有所借鑒和幫助。

1 動物模型對中醫(yī)眼科研究的意義

1.1 推動中醫(yī)眼科傳承和發(fā)展

縱觀中醫(yī)發(fā)展史，醫(yī)者主要是通過臨床觀察來認識疾病的發(fā)生、發(fā)展及變化規(guī)律，并從中總結(jié)有效的防治方法。源于實踐是中醫(yī)最大的特征，但歷史證明，僅僅局限于臨床觀察的研究方法亦制約了其本身的發(fā)展。五輪學(xué)說、八廓學(xué)說、肝竅學(xué)說、玄府學(xué)說是中醫(yī)眼科傳統(tǒng)理論的支柱，在臨床實踐中發(fā)揮了重要的指導(dǎo)作用。但由于部分學(xué)說的內(nèi)容籠統(tǒng)而抽象，缺乏堅實的客觀依據(jù)支撐，已逐漸失去實際的指導(dǎo)意義。相比較而言，玄府學(xué)說在中醫(yī)眼科的應(yīng)用得到越來越多的關(guān)注[6-8]，且該學(xué)說的研究在其他專業(yè)領(lǐng)域也有諸多報道，人們發(fā)現(xiàn)“開通玄府”治療可減輕大鼠腦出血模型血腦屏障損害，降低其通透性，改善腦水腫，促進神經(jīng)功能恢復(fù)，且這種調(diào)節(jié)作用呈雙向性[9]；另有動物實驗顯示“利水開玄”治法可以改善中風(fēng)急性期缺血再灌注損傷，減輕腦水腫的發(fā)生[10]。這些借助于動物模型對玄府實質(zhì)的研究探討，在一定程度上闡釋了該理論的內(nèi)涵，也將促進玄府學(xué)說在眼科的應(yīng)用和發(fā)展。

1.2 加速中醫(yī)眼科新藥的研發(fā)

人與動物之間的差異性不只表現(xiàn)在生理、病理方面，還有心理和社會環(huán)境的差異，而這些差異性有時會導(dǎo)致在藥物研發(fā)過程中出現(xiàn)“動物點頭人不點頭，人點頭動物不點頭”的現(xiàn)象[11]。2021 年由國務(wù)院頒布印發(fā)《“十四五”市場監(jiān)管現(xiàn)代化規(guī)劃》中指出要建立中醫(yī)藥理論、人用經(jīng)驗、臨床試驗相結(jié)合的中藥特色審評證據(jù)體系[12]。但這不意味著中醫(yī)藥研究不需要動物實驗，對絕大多數(shù)創(chuàng)新藥物來講，動物實驗是必經(jīng)之路，也是一條捷徑。例如藥物的安全性評價，既往有“神農(nóng)嘗百草，一日而遇七十毒”的記載，現(xiàn)在可以通過動物實驗預(yù)測中藥的不良反應(yīng)，而不是通過漫長的人用經(jīng)驗總結(jié)。另外，借助于動物模型的藥理學(xué)研究則為新藥的研發(fā)奠定了重要的前期基礎(chǔ)。青蒿抗瘧疾源自臨床實踐，而特效抗瘧疾新藥青蒿素的作用則首先在細胞及動物實驗中得到證實；黃連素在臨床的廣泛應(yīng)用亦離不開動物實驗的證據(jù)支持；而天然抗癌藥紫杉醇的發(fā)現(xiàn)則完全起于細胞實驗和動物實驗的篩選和證實。

1.3 促進人們對中醫(yī)眼科的理解、接受和應(yīng)用

臨床療效是中醫(yī)賴以生存的基石，但有時會被錯誤地認為是“貪天之功”或者是“信則靈”的安慰劑作用，這種局面的形成，一方面因中醫(yī)藥療效很難用目前現(xiàn)代醫(yī)學(xué)公認的方法進行全面評價，另一方面也與作用機制未予明確闡釋有關(guān)，一旦“知其然，又知其所以然”，人們對中醫(yī)藥的理解與信任度會有明顯的提升。筆者曾受邀在美國加州大學(xué)洛杉磯分院Jules Stein 眼科研究所做“中醫(yī)治療疑難性眼病”報告，會后收到很多眼科專家的邀請期望進一步合作；也曾在挪威“St Olav Clinic”針灸診所做中醫(yī)治療眼病的專題講座，參加人員除針灸執(zhí)業(yè)醫(yī)師外，還有當(dāng)?shù)氐难劭漆t(yī)生、視光學(xué)醫(yī)師?；貒蟛痪镁褪盏絹碜栽\所的好消息：參會的眼科醫(yī)生及視光學(xué)醫(yī)師開始給診所推薦患者，而之前多是斥責(zé)他們?yōu)槭裁唇o患者實施沒有證據(jù)的治療。人們的態(tài)度由排斥轉(zhuǎn)為認可，其原因是由于對中醫(yī)藥的作用及機制有了認識，這些認識不能只建立在中醫(yī)理論的自圓其說，也要有現(xiàn)代研究提供的理論支撐。

2 中醫(yī)眼科動物模型現(xiàn)狀

2.1 模型動物的選擇

目前用于眼科疾病研究的實驗動物主要有小鼠、大鼠、家兔、豚鼠、小型豬、斑馬魚以及靈長目動物恒河猴、獼猴等，選擇何種動物進行實驗取決于所研究疾病的種類及實驗條件。比如：大、小鼠與人類生理特性有相似性，體型小易控制，而且研究背景資料豐富，被用于多種眼病的研究。但由于小鼠眼球很小，眼軸測量困難，而且無調(diào)節(jié)功能，故限制了其在近視研究中的應(yīng)用；同為哺乳動物的豚鼠眼球結(jié)構(gòu)和人類很相似，鞏膜組織在近視發(fā)生發(fā)展過程中出現(xiàn)細胞外基質(zhì)降解，因此被近視研究人員所青睞[13]；家兔眼球較大，易于眼部的觀察及操作，多應(yīng)用于角膜疾病的研究；斑馬魚的葡萄糖代謝途徑與人類非常相似，是近年研究糖尿病的一種新興模型動物，在斑馬魚上可以進行高通量的藥物篩選實驗，以及各種復(fù)雜的影像學(xué)檢查，因此，斑馬魚在糖尿病視網(wǎng)膜病變的研究中亦越來越受歡迎[14]；獼猴、豬、大鼠、小鼠的視網(wǎng)膜毛細血管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)發(fā)育良好，適于人類視網(wǎng)膜毛細血管相關(guān)疾病的研究，其中大、小鼠獲取容易，操作相對簡便，成本較低，但如果是針對黃斑區(qū)視網(wǎng)膜毛細血管尤其是拱環(huán)結(jié)構(gòu)的研究，獼猴則是不二選擇[15]。

2.2 中醫(yī)眼科動物模型的種類

目前，用于中醫(yī)藥研究的動物模型主要有3類：疾病動物模型，證候動物模型以及病證結(jié)合動物模型。（1）疾病動物模型：將西醫(yī)病因病理因素施加于實驗動物，建立符合西醫(yī)或中醫(yī)疾病的動物模型；（2）證候動物模型：采用物理、化學(xué)、生物等因素，或依據(jù)中醫(yī)病因病機理論，將六淫、七情、痰飲、勞倦等致病因素施予實驗動物，復(fù)制出類似于中醫(yī)臨床證候的動物模型。如大鼠皮下注射腎上腺素所致的“血瘀”證模型，將大鼠置于冰水所建立的“寒凝血瘀”模型等；（3）病證結(jié)合模型：指在中醫(yī)理論指導(dǎo)下，結(jié)合現(xiàn)代醫(yī)學(xué)理論與實驗動物學(xué)知識，采用現(xiàn)代醫(yī)學(xué)病因和/或傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)病因復(fù)制動物模型，使之同時具備疾病和證候的特征[16]。例如，劉建勛團隊[17-18]在小型豬高脂血癥的基礎(chǔ)上，采用心導(dǎo)管介入造成冠狀動脈前降支血管內(nèi)皮損傷，促使內(nèi)膜下的脂質(zhì)沉積和動脈粥樣硬化形成，通過心肌缺血面積測量、病理學(xué)等客觀指標分析，以及體重指數(shù)、舌象、脈象等證侯指標評價，發(fā)現(xiàn)建立的動物模型與臨床上冠心病痰瘀互結(jié)證非常吻合。病證結(jié)合動物模型符合中醫(yī)理論，能更好體現(xiàn)疾病的特點，已成為目前中醫(yī)藥動物模型研究的熱點和重點[19]。

相較其他專業(yè)而言，中醫(yī)眼科關(guān)于動物模型研究相對缺乏，病證結(jié)合眼科模型更是鮮有報道。目前所用的模型主要是基于西醫(yī)病因、病理所建立的疾病模型。以干眼動物模型為例，或通過摘除淚腺及哈氏腺、燒灼淚腺導(dǎo)管破壞結(jié)構(gòu)及功能，或采用阿托品等膽堿能受體阻斷劑抑制副交感神經(jīng)興奮，導(dǎo)致淚液分泌減少，建立淚液缺乏型干眼模型[20-21]；或從病因角度，以完全缺乏維生素A 的飼料干酪素為主喂養(yǎng)家兔，導(dǎo)致上皮細胞過度角化、淚腺分泌減少、角膜上皮及結(jié)膜干燥而引起干眼[22]；亦或通過去勢方法使雄激素降低，繼而引起結(jié)膜杯狀細胞數(shù)量減少及瞼板腺分泌功能下降，以此建立蒸發(fā)過強型干眼模型等[23]。又如糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy,DR)模型，常用的是通過鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)選擇性破壞胰島β 細胞建立糖尿病模型，在一定的病程基礎(chǔ)上形成DR 模型，觀察中藥對DR 的干預(yù)作用[24]；亦有將幼鼠連續(xù)5 d 置于密閉的高氧環(huán)境，以視網(wǎng)膜新生血管及炎癥相關(guān)因子為評價指標，構(gòu)建DR病理模型[25]；db/db小鼠具備人類糖尿病視網(wǎng)膜神經(jīng)退行性特征，因此該小鼠被用來研究中醫(yī)藥對DR的神經(jīng)保護作用[26]。同樣，青光眼模型也多是采用疾病模型的建模方法，根據(jù)眼壓是否增高分為高眼壓型青光眼動物模型和非高眼壓視神經(jīng)損傷型青光眼模型，前者構(gòu)建方法包括前房注射特定物質(zhì)、激光光凝、鞏膜上靜脈高滲鹽水注射、鞏膜上靜脈烙閉等，后者包括視網(wǎng)膜缺血再灌注、機械損傷與視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞興奮性毒性化學(xué)物質(zhì)損傷等[27-28]。

2.3 中醫(yī)眼科模型存在的問題

理想的疾病動物模型應(yīng)盡可能滿足與人類疾病相符合的“三性”特征，即發(fā)病機理同源性、行為表象一致性、藥物治療預(yù)見性。同時具有創(chuàng)建易行性、重現(xiàn)性與經(jīng)濟性的特點[29]。目前中醫(yī)眼科模型存在的問題包括：（1）模型與臨床表現(xiàn)不一致，這也是西醫(yī)疾病模型的共性問題。大多數(shù)疾病的發(fā)生是由多因素參與的復(fù)雜過程，而目前采用的單因素造模往往不能模擬真實的病變過程。例如，采用各種方法誘導(dǎo)的年齡相關(guān)性黃斑變性（age-related macular degeneration，AMD）動物模型，僅能模擬一個或少數(shù)幾個AMD病理特點，極少有模型能夠呈現(xiàn)從早期進展為晚期的病變過程[30-31]。人類AMD 是一個多因素共同作用，光感受器細胞、視網(wǎng)膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）細胞和脈絡(luò)膜毛細血管之間相互影響而形成的復(fù)雜“系統(tǒng)”的表現(xiàn)。張晶等[32]根據(jù)AMD 發(fā)病的高風(fēng)險因素，以煙草中的主要成分氫醌喂食聯(lián)合慢性光照誘導(dǎo)小鼠AMD 模型，發(fā)現(xiàn)模型組小鼠視網(wǎng)膜功能較正常組下降，感光細胞計數(shù)減少，膜盤結(jié)構(gòu)松散變形，RPE 層萎縮，Bruch 膜的結(jié)構(gòu)破壞、外膠原層出現(xiàn)層狀沉積物，并可見血管內(nèi)皮細胞突入Bruch 膜內(nèi)，免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)RPE 層血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）及CD31 的表達增強，提示視網(wǎng)膜下新生血管發(fā)生，上述表現(xiàn)與人AMD 的發(fā)病進程和特點非常接近，但造模時間過長是該模型一個明顯的缺點。（2）目前現(xiàn)有的模型制作多采用病理模型方法，評價指標缺少中醫(yī)藥特色。例如，鞏膜上靜脈烙閉建立的慢性高眼壓模型是中醫(yī)學(xué)者們常用的青光眼模型[33-35]，該方法是通過烙閉大鼠2 條及以上的鞏膜上靜脈，使鞏膜上靜脈壓力升高，阻礙房水從Schlemm管排出，從而引起眼壓增高。學(xué)者們研究的治則方藥不同，但觀察指標基本一致，多采用眼壓、視網(wǎng)膜組織病理改變、視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的凋亡率等反映病理特征的指標。目前已經(jīng)公認青光眼發(fā)病機制復(fù)雜，除了解剖結(jié)構(gòu)之外，還與情緒等因素有關(guān)，如何構(gòu)建七情致病模型？烙閉鞏膜上靜脈除引起眼部表現(xiàn)外，是否會引起大鼠全身癥狀、體征改變，表現(xiàn)出某種證候特征？不同的治法方藥作用于同一個模型，是否有不同的治療效果？對上述問題的解答有助于更深入地闡釋中醫(yī)藥防治青光眼的作用及機制。

3 中醫(yī)眼科動物模型展望

與西醫(yī)眼科相比，中醫(yī)眼科最大的特點及優(yōu)勢是整體觀。中醫(yī)理論認為眼與臟腑、經(jīng)絡(luò)、氣血、津液密切相關(guān)，眼部疾病是機體失調(diào)的局部反應(yīng)，診斷方面強調(diào)辨病與辨證相結(jié)合，治療方面注重通過全身調(diào)理達到治療眼病的目的。因此，在應(yīng)用動物模型研究中醫(yī)藥的作用及機制時應(yīng)該將證候因素考慮在內(nèi)，這樣才能全面詮釋中醫(yī)藥的作用特點。有學(xué)者認為動物不能開口講話，無法切脈，難以采集四診資料，對病證結(jié)合動物模型持懷疑和否認態(tài)度。但是，隨著科技的發(fā)展以及研究手段的不斷更新，建立富有中醫(yī)藥特色的動物模型已逐漸可行并成為未來研究的趨勢。

3.1 建立病證結(jié)合中醫(yī)眼科動物模型

目前常見的病證結(jié)合動物模型制備思路有2種：單純西醫(yī)疾病動物模型觀測法及西醫(yī)病理機制復(fù)合中醫(yī)病因病機造模法[36]。前者是采用疾病模型的建立方法，在觀察內(nèi)容上增加證候相關(guān)指標。苗明三等[37]分析了過敏性結(jié)膜炎（allergic conjunctivitis,AC）動物模型，認為可以根據(jù)AC 的中醫(yī)診斷，先主證，后次證，找到AC 外感風(fēng)熱證、脾胃濕熱證和肝血不足證對應(yīng)的中醫(yī)指標。彭清華等[38]基于中西醫(yī)臨床病癥特點對現(xiàn)有的的葡萄膜炎動物模型進行了歸納總結(jié)，建議在目前的評價指標體系中，增加生化指標、動物四診資料并予以量化評價，通過積分標準進行中醫(yī)證型診斷，建立病證結(jié)合葡萄膜炎動物模型。而第2種病證結(jié)合動物模型的建立方法則是將西醫(yī)病理與中醫(yī)病因聯(lián)合起來建模，根據(jù)“病”“證”因素施加順序可分為：先證后病、先病后證及病證同步。孫河團隊[39]采用行為束縛、冰水中游泳、45℃烘箱中熱烘、夾尾、禁食等慢性不可預(yù)知性溫和應(yīng)激刺激等方法制作大鼠肝郁模型，并在此基礎(chǔ)上給予鞏膜上靜脈高滲鹽水注射制作大鼠青光眼模型，通過曠場試驗及眼壓檢測評價，成功建立了富有中醫(yī)特色的肝郁證青光眼模型。在今后的研究中這2 種方法都可以采用，第1種疾病建模方法具有較好的確認性、可控性和重復(fù)性，如果能通過宏觀表征、微觀指標、以方測證等方法驗證某些眼科疾病模型已確實存在“證”的特征，則無需再施加證因建模。筆者在觀察含氫醌飼料聯(lián)合慢性光照建立的小鼠AMD模型時發(fā)現(xiàn)，除了眼部的病理改變外，小鼠出現(xiàn)食欲減退、飲水量減少，被毛無光澤，精神欠佳，活動度減少，大便稀軟等全身癥狀，因此，推測這種小鼠模型可能同時具有脾虛痰濕證候，目前課題組正在做進一步的研究驗證。第2 種建模方法吸收了中、西醫(yī)在造模方面的成功經(jīng)驗，發(fā)揮了各自學(xué)科對病證產(chǎn)生的致病特點，有利于中西醫(yī)結(jié)合理論研究的發(fā)展。但需要注意的是，中醫(yī)證候是疾病某一階段病因、病位、病性、病勢及機體邪正盛衰的概括，如果缺乏邏輯關(guān)系將中醫(yī)病因因素與西醫(yī)病理因素強行疊加，則所建立的證候與期待建立的模型證候可能存在階段性不一致的問題[40]。因此，在建模過程中要與臨床實際密切結(jié)合，找準病證結(jié)合的切入點，不要將“證”游離于“病”之外。

3.2 建立病證結(jié)合眼科動物模型的評價方法

中醫(yī)動物模型的評價方法隨著“證”的研究進展，歷經(jīng)了單純“證”的評價、“證”結(jié)合西醫(yī)指標的評價、“以藥（方）測證”評價、基于“組學(xué)”技術(shù)以及臨床中西醫(yī)病癥特點的評價等[41]。雖然目前針對病證結(jié)合模型的評價還沒有理想和成熟的方案，但眼科模型可以借鑒其他學(xué)科的經(jīng)驗并在實踐中進行完善?；谂R床中西醫(yī)病癥特點的評價方法，近幾年報告較多，該方法將疾病的中西醫(yī)診斷依據(jù)用于模型的評價，參考中醫(yī)四診、生化和病理等指標，既有對中醫(yī)“證”的衡量，又將西醫(yī)各方面指標納入評判標準；依據(jù)中西醫(yī)對疾病主次癥狀（指標）的認識，將評判標準分為不同的級別；同時，根據(jù)病種具體情況對不同級別的各個項進行再次分級；最終依據(jù)指標累加積分評價模型與臨床的吻合度[42]。該方法已被嘗試用于中醫(yī)眼科模型的研究[37]。在評價過程中辨證規(guī)范化是重點和難點，大、小鼠四診工作站的建立初步實現(xiàn)了大小鼠診法的標準化與定量化[43]，動物癥狀信息的局限性可借助現(xiàn)代檢測技術(shù)獲取的客觀指標來彌補。此外，必要時亦可基于“方證相應(yīng)”的理論，運用經(jīng)典方劑對病證結(jié)合動物模型進行干預(yù)，分析模型動物對不同治則方劑的反應(yīng)性及特異性指標的改變，進而反測其證候?qū)傩訹44]。

4 小結(jié)

中醫(yī)藥動物實驗研究是溝通傳統(tǒng)中醫(yī)與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的橋梁，病證結(jié)合眼科動物模型是現(xiàn)代中醫(yī)眼科學(xué)實驗研究的基石，可以幫助人們更深入地認識疾病，明確中醫(yī)藥的作用機制，對中醫(yī)眼科學(xué)理論的傳承創(chuàng)新，擴大中醫(yī)藥的國際認可度，新藥、新技術(shù)的研發(fā)具有重要的作用及意義。相信隨著中醫(yī)眼科病證結(jié)合動物模型研究的逐漸深入，模型建立方法及其評價體系將會得到不斷地修正與完善，并通過實踐的驗證，為中醫(yī)眼科學(xué)的發(fā)展注入強大的生命力。最后，需要提及的是每一個生命都是有尊嚴的，動物為人類戰(zhàn)勝疾病做出了重大貢獻，感謝它們?yōu)槿祟惤】邓峁┑囊磺?