朱梓維，白宇新，李云霞，孫冶，劉光焱，楊彪*

（1.沈陽醫(yī)學院基礎醫(yī)學院2018級臨床醫(yī)學專業(yè)本科生，遼寧 沈陽 110034；2.沈陽醫(yī)學院基礎醫(yī)學院病原生物學教研室；3.沈陽醫(yī)學院附屬中心醫(yī)院呼吸內科）

中國國家癌癥中心發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示，我國2018年有393萬人被確診患有癌癥，其中死亡率前五位的癌癥分別為肺癌、胃癌、結直腸癌、肝癌和乳腺癌［1］。我國結直腸癌的發(fā)病率和死亡率均保持上升趨勢［2-3］。因此，探索結直腸癌的發(fā)生、發(fā)展機制，尋找特異性的早期診斷標志物及潛在的治療靶點對于提高患者健康，提升患者生活質量具有重要意義。

結直腸癌的發(fā)生發(fā)展是一個多因素、多階段、多環(huán)節(jié)參與的復雜過程，在此過程中腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment，TME）中各種成分之間的相互作用起重要作用。缺氧微環(huán)境是腫瘤生長所必需的，這個過程中缺氧誘導因子（hypoxia inducible factor，HIF）發(fā)揮了關鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1α與VEGF表達呈正相關，而且在結直腸癌中的表達差異有統(tǒng)計學意義［4］。在低氧條件下，癌癥相關成纖維細胞通過HIF-1α和轉化生長因子β的協(xié)同作用，可誘導結直腸癌化療耐藥［5］。

腫瘤耐藥的發(fā)生機制非常復雜，是當前臨床治療所面臨的最主要問題之一。本研究通過沉默轉錄應激轉錄因子HIF1α的表達，轉錄組分析差異表達基因，預測可能的腫瘤耐藥分子機制，為全面了解和應對癌癥的耐藥提供線索。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng) 人結直腸癌細胞系SW480購置于中國科學院，RPMI 1640培養(yǎng)基（含10%FBS，1%青霉素和鏈霉素）5 ml，吹勻后轉入25 cm2螺口培養(yǎng)瓶，37℃，5%CO2孵箱培養(yǎng)。

1.2 細胞轉染 細胞計數(shù)，1×106/孔，接種到6孔細胞培養(yǎng)板（康寧公司），當細胞密度達75%時進行轉染。實驗所用的siRNA-HIF1α引物從上海吉瑪公司購得。RNA Oligo序列如下：siRNA-HIF1α-830：上游引物：5′-GGAAAUGAGAGAAAUGCUU TT-3′；下游引物：5′-AAGCAUUUCUCUCAUUUC CTT-3′。siRNA-HIF1α-934：上游引物：5′-GGAA AUGAGAGAAAUGCUUTT-3′；下游引物：5′-AAGC AUUUCUCUCAUUUCCTT-3′。siRNA-HIF1α-1067：上游引物：5′-GCUGAUUUGUGAACCCAUUTT-3′；下游引物：5′-AAUGGGUUCACAAAUCAGCTT-3′。陰性對照：上游引物：5′-UUCUCCGAACGUGUCAC GUTT-3′；下游引物：5′-ACGUGACACGUUCGGA GAATT-3′。siRNA細胞轉染步驟如下：（1）將GPtransfect-Mate轉染試劑5μl與195μl的RPMI 1640無血清培養(yǎng)基混勻于1.5 ml的離心管中，靜置5 min。（2）將10μl siRNA與190μl RPMI 1640無血清培養(yǎng)基混勻于1.5 ml的離心管中，靜置5 min。（3）將上述（1）步驟混勻靜置的轉染試劑和（2）步驟混勻靜置的siRNA再次混勻，靜置20 min。（4）將6孔板培養(yǎng)的細胞更換RPMI 1640無血清培養(yǎng)基1.8 ml。（5）將各組的孵育試劑加入到更換無血清培養(yǎng)基的細胞中，37℃，5%CO2孵箱培養(yǎng)6 h，更換完全培養(yǎng)基。（6）48 h后提取總RNA。

1.3 總RNA提取，電泳質檢，逆轉錄cDNA及Real-time PCR（qPCR）驗證轉染siRNA結果。

1.3.1 Trizol法提取總RNA 采用Trizol Reagent試劑盒（美國Thermo Fisher Scientific公司）提取細胞總RNA。（1）消化收集約有100μl體積的SW480細胞株，加入1ml Trizol反復吹勻，室溫靜置5 min；（2）加五分之一體積氯仿進行分離，混勻15 s，室溫5 min。4℃，12 000×g離心15 min；（3）轉水相到EP管，加入等體積異丙醇，混勻10 min，進行RNA沉淀。4℃，12 000×g離心10 min；（4）棄上清，加1 ml冰預冷75%乙醇（DEPC水配制）。4℃，7 500×g，5 min（2次）。棄上清，室溫干燥5~10 min；（5）DEPC水50μl在55~60℃水中溶解RNA。

1.3.2 RNA質量鑒定（1）2%瓊脂糖凝膠配制：稱取瓊脂粉1 g，倒入錐形瓶中，加50 ml 1×TAE電泳緩沖液，搖勻后微波爐加熱1 min取出放涼至約50℃，加入2.5μl核酸染料，充分混勻，倒入電泳槽中，膠完全凝固后備用。（2）將凝膠放入電泳槽中，加入足量1×TAE電泳緩沖液，沒過凝膠，取一定量RNA與10×Loading buffer按10∶1比例混勻后加入凝膠孔。（3）電壓80 V，電泳約15 min，于凝膠成像儀紫外光下成像，觀察條帶邊緣情況、28S和18S條帶亮度以及有無DNA污染。

1.3.3 逆轉錄cDNA 將提取的2μl總RNA逆轉錄為cDNA，使用逆轉錄試劑盒。應用GoScript Reverse Transcription System試劑盒（Promega），獲得cDNA。

1.3.4 qPCR驗證siRNA-HIF1α轉染結果 通過ABI 7500 real time PCR擴增儀檢測驗證測序得到的篩選基因。qPCR引物序列如下：HIF1α，上游引物：5′-CCACAGAAACTACCTTCAACTCC-3′，下游引物：5′-GTGATCTCCTTCTGCATCCTGT-3′；GAPDH，上游引物：5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′，下游引 物：5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′。通過ΔΔCT法進行樣品間相對量的比較。

1.4 細胞形態(tài)觀察 在普通光學顯微鏡下觀察細胞的形態(tài)特征改變。

1.5 RNA-Seq 轉錄組高通量測序由華大基因公司完成。DNBSEQ平臺一共測了6個樣品（siRNA干擾實驗組3個樣品重復，對照組3個樣品重復）。測序文庫構建、簇生成、上機測序、數(shù)據(jù)分析。依據(jù)結果對siRNA-HIF1α-934干擾的結直腸癌SW480細胞株的差異表達基因的GO（Gene ontology）聚類、KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）等Pathway分析，獲得篩選基因。

1.6 qPCR驗證篩選基因 在轉錄水平對RNA-Seq結果的Pathway分析及篩選基因進行實驗驗證。通過ABI 7500 real time PCR擴增儀檢測，驗證測序得到的篩選基因，6個上調基因（H2AC19、SULT1A4、GALNT4、H3C14、EIF3CL和CT45A6）和3個下調基因（OR2A4、CSNK2A3和MIOX）。引物序列見表1。

表1 qPCR的引物序列

1.7 統(tǒng)計學方法 使用GraphPad Prism 6（GraphPad Software，CA，USA）對實驗數(shù)據(jù)進行分析。數(shù)據(jù)報告為3個獨立實驗的均數(shù)±標準差。使用2組的非配對雙尾Student′st檢驗進行統(tǒng)計比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 qPCR驗證siRNA-HIF1α的敲除結果 將siRNA-HIF1α-830、siRNA-HIF1α-934、siRNAHIF1α-1067分別轉染人結直腸癌細胞系SW480，提取siRNA-HIF1α和對照組細胞株的4種細胞的總RNA，逆轉錄為cDNA，通過qPCR驗證3種siRNAHIF1α的敲除結果。通過分析HIF1α的基因表達水平，發(fā)現(xiàn)siRNA-HIF1α-934敲除效果最為顯著，即mRNA的表達水平下調1倍以上，見圖1。

圖1 qPCR檢測3種siRNA-HIF1α的敲除結果

2.2 轉染后細胞形態(tài) 與轉染陰性對照引物相比較，轉染siRNA-HIF1α-934組細胞，其形態(tài)與對照組基本無太大的變化，但是通過計數(shù)發(fā)現(xiàn)SW480細胞的偽足較對照組有所減少，但細胞的體積無顯著改變，見圖2。

圖2 siRNA-HIF1α轉染SW480細胞的形態(tài)觀察（100×）

2.3 RNA-Seq結果

2.3.1 差異表達基因分析 通過對6個樣品（siRNA干擾實驗組3個樣品重復，對照組3個樣品重復）RNA-Seq結果分析，每個樣品平均產出7.25 G數(shù)據(jù)，一共檢測到17 230個基因。如圖3，得到了差異表達基因共計3 900個，其中上調表達1 292個，下調表達1 608個。為了驗證差異表達基因的mRNA表達水平，從RNA-Seq的結果中隨機選擇9個顯著差異基因進行qPCR檢測，包括6個上調基因（H2AC19、SULT1A4、GALNT4、H3C14、EIF3CL和CT45A6）和3個下調基因（OR2A4、CSNK2A3和MIOX）。通過實驗證實了RNA-Seq的分析結果，且趨勢與高通量測序數(shù)據(jù)一致，見表2。

圖3 RNA-Seq分析的差異表達基因火山圖

表2 siRNA-HIF1α-934干擾SW480細胞后的差異基因表達情況

2.3.2 差異基因表達富集分析 通過Pathway分析表明，20種通路受這些差異表達基因的調控影響，主要包括內質網蛋白加工通路、肌動蛋白細胞骨架及黏附調節(jié)通路和叉頭狀轉錄因子（FoxO）信號通路等通路（圖4A）。差異表達基因的功能如圖4B所示，這些差異基因的轉錄物最常見的功能是調控細胞內液、細胞質、黏附作用、核糖體、細胞骨架和線粒體基質等。

圖4 差異基因表達富集分析圖

3 討論

結直腸癌在全球最常見癌癥中排名第三，每年報告的新病例超過100萬，約有600 000例患者死于該病［6］?；颊吣退幮缘漠a生仍然是結直腸癌患者生存率低的重要原因。由于耐藥的發(fā)生及多重耐藥的出現(xiàn)，經常導致化療的失敗，從而導致腫瘤的復發(fā)和轉移，嚴重影響人民群眾的健康。腫瘤耐藥機制是一個復雜的過程，其影響因素較多，主要包括個體遺傳差異、腫瘤微環(huán)境、腫瘤干細胞、藥物失活、藥物吸收減少、抗腫瘤藥物代謝改變等。惡性腫瘤的重要特征就是缺氧微環(huán)境，在缺氧環(huán)境下HIF-1α起到了重要的作用，與腫瘤的生長情況以及侵襲能力密切相關。因此，HIF-1α在結直腸癌中參與了多種與腫瘤相關的途徑的調節(jié)，促進了腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及侵襲遷移過程，導致了患者的不良預后［7］。

缺氧微環(huán)境是惡性腫瘤的重要特征，實體瘤中的腫瘤細胞會表達HIF-1轉錄因子，而HIF-1在缺氧環(huán)境下起到了重要的作用，與腫瘤的生長以及侵襲能力密切相關。研究證明，腫瘤的發(fā)生和轉移與多種機制有關，包括血管生成、糖酵解、細胞侵襲和細胞存活等，腫瘤細胞內的低氧環(huán)境促進了這些環(huán)節(jié)的發(fā)展［8-10］。本研究中，我們使用siRNA技術獲得了HIF1α低表達的細胞株，以期研究腫瘤細胞在引發(fā)HIF-1α這類治療藥物耐藥后，腫瘤發(fā)展的調控通路改變情況，解析其可能的腫瘤耐藥分子機制。研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，siRNA-HIF1α-934組細胞的偽足明顯減少，同時腫瘤細胞在面對HIF1α低表達調整了其部分的調控通路，如上調了內質網加工蛋白通路、激動蛋白細胞骨架及黏附調節(jié)通路和叉頭狀轉錄因子信號通路等通路基因的表達。所以，通過本研究了解和應對癌癥的耐藥，能夠有效提高患者健康、提升患者生活質量，對于癌癥患者和所屬家庭來說意義重大。

低表達HIF1α后，內質網蛋白質加工通路調控活性增強。細胞合成的蛋白質經過內質網的修飾后，參與細胞功能和命運的調控過程。當內質網無法完成功能蛋白的修飾時，細胞就會受到內質網應激［11］。引發(fā)范圍廣泛的細胞紊亂，破壞內質網中蛋白質修飾的效率，并導致錯誤折疊蛋白質的積累，從而觸發(fā)未折疊蛋白質反應（unfolded protein response，UPR）。內質網應激發(fā)生的同時，UPR最初發(fā)出適應性輸出，減少負荷并增加內質網分泌途徑的能力，以恢復內質網穩(wěn)態(tài)。面對更為強烈的內質網壓力，UPR會發(fā)出促炎和死亡信號，導致細胞死亡［12］。腫瘤塊內的惡劣微環(huán)境條件，如營養(yǎng)缺乏、氧限制、高代謝需求和氧化應激，會干擾內質網的蛋白質折疊能力，這些條件可以促進內質網中錯誤折疊蛋白的積累從而引發(fā)“內質網應激”的狀態(tài)［13］。內質網應激傳感器的持續(xù)激活賦予惡性細胞更大的致瘤性、轉移性和耐藥性。研究中我們發(fā)現(xiàn)，siRNA-HIF1α-934組細胞的KEGG分析，分值最高就是內質網蛋白通路的改變。說明當SW480細胞面對低HIF1α表達的情況，將啟動新一輪的蛋白修飾程序，通過加強對內質網的調控，編輯新的修飾蛋白，從而在轉錄水平實現(xiàn)新的微環(huán)境的適應。

低表達HIF1α后，肌動蛋白細胞骨架及黏附調節(jié)通路發(fā)生顯著的改變。上皮-間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是癌癥進展過程中重要的細胞程序。肌動蛋白調控細胞骨架介導了細胞形狀和極性所必需的結構框架等生物學功能。研究表明，肌動蛋白重塑是轉移性癌細胞中EMT的加速劑［14］。當敲低HIF1α表達使得肌動蛋白細胞骨架發(fā)生重塑，說明抑制HIF1α表達可以增加肌動蛋白細胞骨架的動力調控的異常，同時腫瘤細胞通過相應轉錄通路調節(jié)肌動蛋白細胞骨架，導致了惡性腫瘤的遷移能力增強。轉移的早期步驟涉及細胞內信號和微環(huán)境的協(xié)調，通過細胞形態(tài)的變化，以允許細胞從原發(fā)部位分離。黏著斑在細胞成熟過程中通過黏附作用及改變分子組合來產生牽引并轉換信號驅動細胞遷移，細胞的黏附能力下降是腫瘤轉移的重要因素之一［15］。實驗中，我們敲低了HIF1α表達，同時發(fā)現(xiàn)該組細胞的定植能力減弱，即細胞間彼此交流的偽足開始減少，說明細胞已經開啟了一種新的遷移模式。惡性腫瘤細胞利用這種低的遷移阻力侵入鄰近組織和血管系統(tǒng)，并最終轉移。

低表達HIF1α后，F(xiàn)oxO信號通路活性上調。Fox蛋白家族是一大類在化療耐藥和EMT中起重要作用的轉錄因子。當細胞發(fā)生氧化應激時，F(xiàn)oxO轉錄因子可大量激活，能夠控制多種特定的基因表達程序。FoxO可通過磷酸化、乙?；?、泛素化和甲基化等多種修飾方式，同時參與PI3K/Akt、Wnt/β-catenin等信號通路的作用，調控腫瘤細胞的增殖、凋亡、EMT及能量代謝等多種生物學行為。研究發(fā)現(xiàn)FOXC1和FOXQ1通過調節(jié)關鍵EMT相關分子促進肝細胞癌轉移［16-17］。FOXD1在包括胃癌在內的幾種實體瘤中被發(fā)現(xiàn)失調，并抑制NF-κB活化，特別是p65亞單位的活化。據(jù)報道，F(xiàn)OXM1可調節(jié)卵巢癌的EMT、細胞干性和化療耐藥性［18］。FOXL2是FOX蛋白家族的另一成員，F(xiàn)OXL2在對常規(guī)化療耐藥的進行性和復發(fā)性顆粒細胞腫瘤中也被發(fā)現(xiàn)上調［19-20］。本研究沉默轉錄應激轉錄因子HIF1α的表達，發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞開啟了FOX的調控，通過激活FOX轉錄因子調控的信號通路，使得腫瘤細胞發(fā)生增殖和轉移，從而發(fā)展成為新一輪的耐藥細胞株。所以，在腫瘤藥物的研發(fā)過程中應加入伴侶藥物的協(xié)同作用的研究，預測抗腫瘤藥物耐藥株的出現(xiàn)，同時加入另外一種協(xié)同成分，以期更好地抑制腫瘤的增殖和轉移。

腫瘤耐藥的發(fā)生機制非常復雜，其仍然是當前臨床治療所面臨的最主要問題之一。通過生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，沉默轉錄因子HIF1α的表達，可通過激活FoxO轉錄因子等信號通路，促進腫瘤細胞發(fā)生增殖和轉移。我們接下來將針對HIF-1α這類治療藥物進行腫瘤耐藥性分析，解釋其可能的腫瘤耐藥分子機制，以全面了解和應對癌癥的耐藥，此途徑將有效提高患者健康、提升患者生活質量，是新的治療選擇和生存希望，具有廣泛而深遠的社會意義。