付堂清， 李文忠， 羅仕云， 師 路， 杜鎮(zhèn)鴻

(三六三醫(yī)院胸外科， 四川 成 都 610041)

食道癌(Esophageal cancer，EC)，也被稱為食管癌，是一種惡性腫瘤，發(fā)病率和病死率均較高[1]。鱗狀細胞癌和腺癌是EC的兩種主要的組織病理亞型[2]。關于食管癌的各種治療策略已被開發(fā)，包括內(nèi)窺鏡技術、外科治療、全身化療和免疫療法[3,4]。近年來的研究強調(diào)了分子靶點在EC個體化治療和早期診斷中的重要意義。非編碼RNA(ncRNAs)包括非編碼環(huán)狀RNA(circRNAs)和microRNAs(miRNAs)是當前EC研究的熱點。CircRNAs可以特異性結(jié)合miRNAs，從而發(fā)揮基因的間接調(diào)控作用，促進或抑制EC的進展。例如，circ_0023397通過靶向miR-106b抑制EC細胞的增殖[5]，而circ_0004370/miR-1294/LASP1軸被發(fā)現(xiàn)能夠促進EC的發(fā)育過程[6]。據(jù)報道，hsa_circ_0005273(circPTK2)在結(jié)直腸癌中作為腫瘤啟動子[7]，而hsa_circ_0008305(circPTK2)在非小細胞肺癌中作為腫瘤抑制子[8]。盡管circPTK2在多種癌癥中的生物學功能已被證實，但circPTK2在EC中的具體作用仍不清楚。miR-619-5p已被證實為口腔鱗狀細胞癌[9]的腫瘤抑制因子，但是miR-619-5p在EC中的表達和作用尚不明確。本研究將主要研究circPTK2和miR-619-5p在EC中的生物學功能及調(diào)控機制，為腫瘤發(fā)生機制提供更深層次的理解，并為EC的治療提供潛在的靶點。

1 材料與方法

1.1實驗材料：circPTK2的小干擾RNA(si-circPTK2)和siRNA陰性對照(si-NC)、miR-619-5p mimic(miR-619-5p)和陰性對照(miR-NC)、miR-619-5p inhibitor(anti-miR-619-5p)和陰性對照(anti-NC)、慢病毒包被的circPTK2質(zhì)粒(LV-circPTK2)和陰性對照(LV-NC)、circPTK2的短發(fā)夾RNA(sh-circPTK2)和陰性對照(sh-NC)、生物素偶聯(lián)miR-619-5p mimic(Bio-miR-619-5p)和陰性對照(Bio-miR-NC)均購自RIBOBIO。RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Sigma-Aldrich；Lipofectamine 3000試劑、TRIzol購自美國Invitrogen公司；SuperScriptTM IV第一鏈合成系統(tǒng)、SYBR Green一步法qPCR試劑盒、鏈霉親和素磁珠購自美國Thermo Fisher公司；細胞計數(shù)盒-8(CCK-8)購自北京科碩生物技術有限公司；Transwell室購自美國康寧公司；RIPA裂解緩沖液購自上海遠慕生物科技有限公司；一抗anti-E-cadherin、anti-N-cadherin、anti-Vimentin、anti-GAPDH和山羊抗兔IgG H&L(HRP)二抗、ECL Western Blotting底物試劑盒購自美國ABCam公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自翌圣生物公司。酶標儀購自美國伯樂公司；倒置顯微鏡購自日本Olympus。

1.2組織獲取和細胞培養(yǎng)：51例EC患者在本院接受手術治療。接受化療、放療或其他治療的患者被排除在本研究之外。收集的EC組織(n=51)和正常的癌旁組織(n=51)保存在-80℃。已獲得所有EC患者的書面知情同意書。本研究經(jīng)本醫(yī)院倫理委員會批準。人食管上皮細胞系(HEEC)和EC細胞系(OE19、KYSE-450、KYSE-520和TE-13)購自北納生物。RPMI-1640培養(yǎng)基添加10%胎牛血清以維持上述細胞生長。培養(yǎng)環(huán)境為37℃、5% CO2的潮濕空氣中。

1.3細胞轉(zhuǎn)染與分組：使用20nmoL/L的siRNA或抑制劑和50nmoL/L的模擬物進行細胞轉(zhuǎn)染。將TE-13細胞接種于96孔板過夜，然后用Lipofectamine 3000試劑轉(zhuǎn)染1.1中的寡核苷酸或載體，并分組為對照組、si-NC、si-circPTK2組、miR-NC組、miR-619-5p組、si-circPTK2+anti-NC組和si-circPTK2+anti-miR-619-5p組。

1.4qRT-PCR檢測EC組織和細胞內(nèi)circPTK2和miR-619-5p的表達：用TRIzol試劑從組織和細胞中純化RNA。通過SuperScript IVSuperScriptTM IV第一鏈合成系統(tǒng)逆轉(zhuǎn)錄后，根據(jù)使用說明采用SYBR Green一步法qPCR試劑盒進行表達檢測。引物序列為：circPTK2為5’-AATGCCTGTGAACCCATAGTG-3’(正向引物)和5’-CTGACAGCATGAGCATCCCT-3’(反向引物)；miR-619-5p為5’-GGGGGTCCCCGGTGCT-3’(正向引物)和5’-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3’(反向引物)；GAPDH為5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’(正向引物)和5’-GAGATGGTGATGGGATTTC-3’(反向引物)；U6為5’-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3’(正向引物)和5’-GGAACGCTTCACGAATTTG-3’(反向引物)。GAPDH作為circPTK2的內(nèi)參。U6為miR-619-5p的內(nèi)參。最后，用2-ΔΔCT法進行相對表達分析。

1.5CCK-8評估TE-13細胞活力：TE-13細胞轉(zhuǎn)染48h后，96孔板每孔移入10μL CCK-8試劑；4h后，在酶標儀上450nm處檢測吸光度，以實驗組與對照組的吸光度百分比表示細胞活力(%)。

1.6Transwell檢測TE-13細胞侵襲、遷移：上室接種1×104個TE-13細胞(轉(zhuǎn)染24h后)，下室加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，24h后小心擦去未遷移的細胞，用4%多聚甲醛固定和結(jié)晶紫染色。Transwell上腔涂布基質(zhì)后進行細胞侵襲檢測；將1×105個TE-1細胞接種到上腔室，按照遷移試驗的步驟進行后續(xù)處理。倒置顯微鏡下保存100倍鏡下細胞圖像，計數(shù)遷移或侵襲細胞。

1.7Western blot檢測EC組織和細胞內(nèi)上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)相關蛋白表達：用放射免疫沉淀法(RIPA)裂解緩沖液提取總蛋白；用SDS-PAGE分離40μg總蛋白，然后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用5%脫脂牛奶孵育膜，以阻止非特異性蛋白信號之間的結(jié)合，然后在4℃條件下孵育一抗過夜。使用的一抗如下：anti-E-cadherin、anti-N-cadherin、anti-Vimentin、anti-GAPDH。將PVDF膜與山羊抗兔IgG H&L(HRP)二抗在室溫下孵育；1h后，使用ECL Western Blotting底物試劑盒顯影。用Image Lab軟件進行蛋白表達分析。

1.8雙熒光素酶報告實驗證實circPTK2與miR-619-5p的關系：將含有miR-619-5p結(jié)合位點的circPTK2 3’-非翻譯區(qū)(3’ UTR)的序列克隆到基礎熒光素酶表達質(zhì)粒pGL3-control中，構(gòu)建野生型熒光素酶質(zhì)粒。野生型熒光素酶質(zhì)粒命名為WT-circPTK2。此外，突變體circPTK2 3’ UTR序列(包含miR-619-5p結(jié)合的突變位點)被插入到pGL3-control中，以產(chǎn)生突變型(MUT)熒光素酶質(zhì)粒(MUT-circPTK2)。TE-13細胞分別用上述質(zhì)粒與miR-NC或miR-619-5p在37℃下轉(zhuǎn)染48h。使用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)測量熒光素酶活性。

1.9生物素偶聯(lián)miRNA pull-down試驗：分別將Bio-miR-619-5p和Bio-miR-NC轉(zhuǎn)染TE-13細胞48h后，將細胞裂解，在4℃條件下與鏈霉親和素磁珠孵育16h，提取磁珠結(jié)合的總RNA，采用qRT-PCR檢測circPTK2的相對水平。

1.10荷瘤裸鼠實驗觀察TE-13細胞在體內(nèi)的抗瘤能力：將6周齡雄性BALB/c裸鼠，購自長春生物制品研究所有限責任公司，許可證號：SYXK(吉)2017-0005。實驗分為5組(每組6只)：對照組、sh-NC組、sh-circPTK2組、sh-circPTK2+anti-NC組、sh-circPTK2+anti-miR-619-5p組。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染sh-NC、sh-circPTK2、sh-circPTK2+anti-NC、sh-circPTK2+anti-miR-619-5p后，將1×106個TE-13細胞重懸于100μL磷酸鹽緩沖液中，皮下注射裸鼠。每周用數(shù)字卡尺測量腫瘤的長和寬，腫瘤體積計算公式為：長×寬2×0.5。5周后處死裸鼠，用電子秤稱腫瘤重量。本實驗經(jīng)本醫(yī)院動物倫理委員會批準。裸鼠的所有實驗均符合美國國立衛(wèi)生研究院實驗室動物護理和使用指南。

2 結(jié) 果

2.1circPTK2和miR-619-5p在EC組織和細胞系中的表達：與正常的癌旁組織和HEEC細胞相比，circPTK2水平在51個EC組織和4個細胞系(OE19、KYSE-450、KYSE-520、TE-13)中明顯升高，miR-619-5p在51個EC組織和4個細胞系(OE19、KYSE-450、KYSE-520、TE-13)中明顯降低(P<0.05)，見表1、表2。后續(xù)研究采用TE-13細胞(circPTK2表達量高于其他三種EC細胞系)。

表1 qRT-PCR測定正常組織與EC組織中circPTK2和miR-619-5p的表達

2.2miR-619-5p過表達抑制了EC細胞的生長、侵襲、遷移和EMT：與對照組和miR-NC組比較，miR-619-5p組TE-13細胞中的miR-619-5p水平顯著升高，細胞活力顯著下降，侵襲和遷移細胞數(shù)目明顯減少，E-cadherin的表達顯著增高，N-cadherin和Vimentin的表達顯著降低(P<0.05)，見圖1、圖2、表3。

表2 qRT-PCR測定HEEC與EC細胞系中circPTK2和miR-619-5p的表達

圖1 miR-619-5p上調(diào)對EC細胞侵襲、遷移的影響

圖2 Western blot檢測EC細胞中EMT蛋白標記物水平

2.3circPTK2通過海綿吸附降低miR-619-5p的水平：生物信息學分析顯示了circPTK2和miR-619-5p序列之間的結(jié)合位點(圖3)。雙熒光素酶報告實驗顯示，miR-619-5p+WT-circPTK2組的熒光素酶活性明顯低于miR-NC+WT-circPTK2(P<0.05)，而miR-619-5p+MUT-circPTK2組的熒光素酶活性與miR-NC+MUT-circPTK2組無顯著差異(P>0.05)，見表4。同時，circPTK2可被miR-619-5p在生物素偶聯(lián)miRNA下拉實驗中捕獲(P<0.05)，見表5。此外，si-circPTK2組的miR-619-5p表達增高，LV-circPTK2組的miR-619-5p表達降低(P<0.05)，見表6。

表3 轉(zhuǎn)染miR-619-5p對EC細胞生長侵襲遷移及EMT蛋白標記物的影響

圖3 circPTK2和miR-619-5p的結(jié)合位點

表4 雙熒光素酶報告實驗分析circPTK2和miR-619-5p的交互

表5 pull-down實驗分析circPTK2和miR-619-5p的交互

表6 qRT-PCR測定各組TE-13細胞中miR-619-5p的表達

2.4miR-619-5p抑制劑逆轉(zhuǎn)了si-circPTK2的抗腫瘤作用：與對照組和si-NC組比較，si-circPTK2組TE-13細胞中circPTK2的水平顯著降低，細胞活力顯著下降，侵襲和遷移細胞數(shù)目明顯減少，E-cadherin的表達顯著增高，N-cadherin和Vimentin的表達顯著降低(P<0.05)；與si-circPTK2組和si-circPTK2+anti-NC組比較，si-circPTK2+anti-miR-619-5p組TE-13細胞中的miR-619-5p水明顯降低，細胞活力顯著增高，侵襲和遷移細胞數(shù)目明顯增多，E-cadherin的表達顯著下降，N-cadherin和Vimentin的表達顯著升高(P<0.05)，見圖4、圖5、表7、表8。

圖4 si-circPTK2和anti-miR-619-5p共轉(zhuǎn)染對EC細胞侵襲、遷移的影響

表7 si-circPTK2和anti-miR-619-5p共轉(zhuǎn)染對EC細胞生長侵襲遷移的影響

表8 si-circPTK2和anti-miR-619-5p共轉(zhuǎn)染對EC細胞中EMT蛋白標記物的影響

2.5circPTK2和miR-619-5p對EC在體內(nèi)腫瘤發(fā)生的影響：sh-circPTK2組腫瘤體積(第3、4、5周)和重量均較sh-NC組和對照組減輕，sh-circPTK2+anti-miR-619-5p組腫瘤體積(第3、4、5周)和重量較sh-circPTK2組和sh-circPTK2+anti-NC組增高(P<0.05)，見表9。

表9 sh-circPTK2和anti-miR-619-5p影響EC在體內(nèi)的腫瘤發(fā)生

圖5 Western blot檢測EC細胞中EMT蛋白標記物水平

3 討 論

CircRNAs的共價閉合環(huán)結(jié)構(gòu)使其比傳統(tǒng)的線性RNA更穩(wěn)定地對抗RNase和外切酶，能夠長時間發(fā)揮其生物學功能[10]。近年來，高效測序和生物信息學分析技術的發(fā)展促進了circRNAs的鑒定和功能研究。已有研究證實許多circRNAs的異常表達作為腫瘤抑制或啟動子參與了EC[11]等多種癌癥的發(fā)生發(fā)展。在本研究中，circPTK2在臨床EC組織和體外培養(yǎng)的EC細胞系中顯著上調(diào)。與該結(jié)果一致，circPTK2在多種人類惡性腫瘤(如口腔鱗狀細胞癌[9]和胃癌[12])中作為生物活性的調(diào)節(jié)因子。此外，本研究通過功能缺失實驗探究了circPTK2的生物學作用。結(jié)果表明，在EC中下調(diào)circPTK2導致細胞活力、侵襲、遷移和EMT過程受到顯著抑制。這些結(jié)果均證實circPTK2在EC中表達上調(diào)，并作為一種致癌分子發(fā)揮作用。

在眾多的miRNAs中，miR-619-5p在癌癥中得到了新的關注。以往的研究表明，miR-619-5p在腫瘤進展中的功能不同。例如，miR-619-5p通過靶向ATXN3抑制口腔鱗癌的增殖，增強順鉑耐藥性[9]，而在膠質(zhì)瘤中miR-619-5p過表達促進細胞增殖和遷移并抑制凋亡[13]。miR-619-5p在不同癌癥中功能不一致的原因可能是由于癌細胞的不同類型導致的。本研究發(fā)現(xiàn)miR-619-5p在EC組織和細胞中表達下調(diào)，其過表達可抑制EC細胞侵襲、遷移和EMT過程。提示miR-619-5p在EC中作為抑癌分子發(fā)揮作用。

大量研究表明circRNA在包括EC在內(nèi)的各種癌癥中可作為miRNA的分子海綿。例如，circ_0006168作為miR-384的海綿，促進EC的發(fā)展[14]；circ_0000554沉默可通過海綿吸收miR-485-5p下調(diào)FERMT1抑制EC進展，增強細胞的放射敏感性[15]。本研究的生物信息學分析推測了circPTK2與miR-619-5p之間的結(jié)合位點。然后，通過miRNA pull-down實驗和熒光素酶報告基因檢測確認它們之間的結(jié)合能力。而且，circPTK2與miR-619-5p呈負調(diào)控。此外，拯救實驗顯示，miR-619-5p的衰減可以逆轉(zhuǎn)circPTK2下調(diào)介導的EC細胞增殖、侵襲、遷移效應。并且，miR-619-5p缺失可部分恢復circPTK2下調(diào)對體內(nèi)EC瘤體生長的抑制作用。

本研究首次提供了circPTK2/miR-619-5p軸調(diào)控EC進展的證據(jù)。然而，本研究仍存在一些局限性。首先，可以通過更多的實驗來驗證這些結(jié)果：例如通過MTT法或5-乙基-2-脫氧尿苷(Edu)法進一步證實circPTK2對細胞增殖的影響；為了探索circPTK2的調(diào)控機制，可以通過免疫熒光檢測來確定circPTK2的亞細胞定位。眾所周知，circRNA可能在多種癌癥的發(fā)展過程中作為一種競爭性的內(nèi)源性RNA(ceRNA)。因此，還需要進一步開展實驗，進一步研究circPTK2在EC進展過程中可能存在的ceRNA網(wǎng)絡。

綜上所述，circPTK2在EC中上調(diào)，miR-619-5p下調(diào)，circPTK2通過下調(diào)miR-619-5p促進EC進展，提示在EC中發(fā)現(xiàn)了一種新的調(diào)控機制。這些發(fā)現(xiàn)可能為啟發(fā)新的EC分子診斷和治療策略提供科學依據(jù)。