潘俏芬 ,尤金杰 ,劉 華 ,陸 茵 ,孫愛麗* ,張澤明

（1.寧波大學(xué) 海洋學(xué)院,浙江 寧波 315823;2.寧波大學(xué) 食品與藥學(xué)學(xué)院,浙江 寧波 315823）

隨著社會的發(fā)展和經(jīng)濟的全球化,人類對塑料制品需求及使用量逐年增加,2018年全球塑料產(chǎn)量已達到3.6×108t[1].然而,塑料制品壽命普遍偏低,塑料垃圾通常會以工業(yè)及生活垃圾的方式排放到自然環(huán)境中進一步降解,釋放大量的化學(xué)物質(zhì)并遷移到環(huán)境中,造成嚴重的環(huán)境污染[2].

鄰苯二甲酸二(2-乙基)己酯(Bis(2-ethylhexyl)phthalate,DEHP)是一種常見的工業(yè)單體塑化劑,主要用于提升塑料制品的耐腐蝕性和柔韌性[3].作為常見的環(huán)境激素類污染物,DEHP 除了對環(huán)境造成沉重負擔之外,還具有較強的生殖毒性[4].研究表明,DEHP 經(jīng)人體呼吸系統(tǒng)和消化系統(tǒng)吸收后,能夠?qū)е律矬w內(nèi)分泌失調(diào)和紊亂,對人體生殖系統(tǒng)造成嚴重危害[5].此外,有研究證實孕婦暴露在含DEHP的環(huán)境中,會對胎兒有嚴重的致畸致癌作用[6].因此,中國及歐美等國家均禁止將DEHP用于兒童玩具及食品包裝中[6].由于DEHP 與塑料制品之間常以非共價鍵結(jié)合,導(dǎo)致DEHP在塑料制品中可自由浸出,因此在生產(chǎn)和消費過程中很容易浸出,并通過大氣沉降、地表徑流等方式進入海洋系統(tǒng)[7].研究表明,在部分海域中DEHP 的污染已十分嚴重,對當?shù)氐乃h(huán)境和養(yǎng)殖系統(tǒng)造成了巨大的危害[7].我國于2002 年出臺了相關(guān)法律法規(guī)限制DEHP 的使用,規(guī)定食品及環(huán)境中DEHP的限值為1.5 mg·kg-1[6].因此,對DEHP 進行實時監(jiān)測和檢測具有重要意義.目前,常見的DEHP 的檢測手段有氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用、酶聯(lián)免疫吸附法、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法等[8-10],但這些方法的預(yù)處理時間和檢測時間較長,儀器維護費用較高.因此,亟須一種簡單、快速、高效的DEHP 的分析檢測方法.

分子印跡聚合物(MIPs)是一種具有與目標分子形狀和大小互補的印跡孔洞仿生材料[11],除具有生物抗體良好的選擇性和特異性外,MIPs 還具有良好機械穩(wěn)定性、快速平衡動力學(xué)和良好的可重復(fù)使用性.將MIPs 錨定在量子點(QDs)上,獲得的MIPs-QDs 納米材料不僅具有規(guī)則均勻的形貌,方便功能基團的接枝,還具有QDs 優(yōu)良的熒光檢測性能[12].因此,基于MIPs 的熒光傳感器的開發(fā)越來越受到關(guān)注.在各種熒光信號材料中,QDs 因其發(fā)光明亮、發(fā)光顏色可調(diào)、發(fā)光范圍窄、光學(xué)穩(wěn)定性高而成為最受歡迎的熒光信號材料[13].一些研究團隊成功開發(fā)了基于MIP-coated QDs(MIP-QDs)的熒光傳感器,具有對目標分析物高選擇性敏感響應(yīng),這些MIP-QDs 在實際檢測中顯示出良好的應(yīng)用潛力[14-15].本文通過制備基于DEHP的分子印跡聚合物,結(jié)合量子點優(yōu)異的光電特性,開發(fā)了新型分子印跡熒光傳感器用于海水中DEHP 的快速識別檢測.通過表征傳感器形貌結(jié)構(gòu)、優(yōu)化檢測條件,構(gòu)建了海水中DEHP 的熒光檢測方法,并成功應(yīng)用實際樣品中DEHP 的檢測.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗所需試劑見表1.

表1 實驗主要試劑

1.2 儀器與設(shè)備

熒光分光光度計(F-4600,日本日立公司);掃描電鏡(SEM)(S-4800,日本日立公司);洛倫茲透射電鏡(TEM)(H-7650,日本日立公司);傅立葉紅外變換光譜儀(FT/IR-4700,日本株式會社日立制作所);X 射線光電子能譜(XPS)(ESCALAB 250 XiX,美國賽默飛公司).

1.3 實驗方法

1.3.1 MIP-QDs 的制備

向50 mL 圓底燒瓶中加入8 mL 環(huán)己烷和2 mL表面活性劑Triton X-100,室溫下以400 r·min-1磁力攪拌15 min.隨后,將200 μL CdSe/ZnS 油溶性量子點(2.5 mg·mL-1,氯仿溶解)和60 μL TEOS 及200 μL 氨水(25wt%)依次加入燒瓶中,在400 r·min-1條件下攪拌2 h.與此同時,將200 μL DEHP(20 mg·mL-1,環(huán)己烷溶解)加入棕色小瓶中,依次加入200 μL 環(huán)己烷,36 μL APTES,并在400 r·min-1條件下充分攪拌2 h,進行模板和單體的預(yù)聚合.隨后將預(yù)聚合溶液加入圓底燒瓶中,在黑暗條件下,以400 r·min-1磁攪拌12 h.

聚合反應(yīng)結(jié)束后,向反應(yīng)體系中快速注入10 mL 丙酮,震蕩10 min,超聲5 min 終止反應(yīng)并破除乳液體系,在8.5×103g 條件下離心10 min,將離心去除上清液的聚合物用超純水洗滌,去除反應(yīng)不完全的APTES 和TEOS.最后,用洗脫液(V(乙醇):V(乙腈)=8:2)去除模板,超聲10 min,震蕩45 min.重復(fù)洗脫過程,直到LC-UV 在上清液中檢測不到DEHP 為止.相應(yīng)地,非分子印跡聚合物(NIP-QDs)是將200 μLDEHP 替換為相同體積的環(huán)己烷進行合成.

1.3.2 MIP-QDs 和NIP-QDs 的結(jié)構(gòu)表征

采用掃描電鏡(SEM)和透射電鏡(TEM)對獲得的MIP-QDs 和NIP-QDs 進行表面形貌表征.同時,通過傅里葉紅外變換光譜(FT-IR)和X 射線光電子能譜(XPS)對獲得聚合物進行官能團和元素解析.

1.3.3 MIP-QDs 的熒光響應(yīng)分析

將制備的MIP-QDs 超聲分散在乙醇中,配制質(zhì)量濃度為25 mg·L-1的懸濁液用于熒光分析.向比色皿(1 cm×1 cm×2 cm)中加入900 μL MIP-QDs,采用F-4600 熒光分光光度計測定并記錄其初始熒光F0,加入100 μL DEHP 孵育300 s 后,測定其熒光強度并記錄其熒光強度為F.其熒光測定參數(shù)設(shè)置為: 激發(fā)波長(Ex)為340 nm,發(fā)射波長(Em)掃描范圍為580～680 nm,光電倍增管電壓750 eV,激發(fā)和發(fā)射夾縫寬度分別為5 nm 和10 nm.

通過Stern-Volmer 方程[16]評價MIP-QDs 的熒光猝滅效率:

式中:F0表示初始熒光強度;F表示加入DEHP 后,被抑制之后的熒光強度;KSV表示熒光猝滅常數(shù);Q表示DEHP 的濃度.

以印跡因子IF 為指標,評價合成MIP-QDs 的熒光猝滅效率及其對DEHP 的選擇性,IF 的計算公式如下:

1.3.4 實際樣本的前處理

在象山港某入?？诓杉Ｋ畼颖?將采集的海水經(jīng)0.45 μm 的玻璃纖維膜過濾后移入頂空萃取小瓶中,加入內(nèi)標后,固定在微萃取裝置臺上,并置入萃取針,在35 ℃條件下以500 r·min-1速度磁力攪拌40 min 進行萃取.隨后,將萃取針插入GCMS/MS 進樣口,以280 ℃熱解吸2 min,GC 和MS設(shè)定參數(shù)參考文獻[17].

2 結(jié)果與討論

2.1 MIP-QDs和NIP-QDs合成體系的研究與表征

TEOS 的用量在很大程度上影響了MIP-QDs對DEHP 的印跡效應(yīng)和特異性響應(yīng)[18].如圖1 所示,隨著TEOS 用量的增加,添加DEHP 的MIP-QDs熒光猝滅程度先升高后降低,當TEOS 用量為60 μL 時,熒光猝滅程度最大為741,而未添加DEHP的NIP-QDs對DEHP熒光猝滅程度幾乎一致,且遠低于MIP-QDs.這些結(jié)果表明,MIP-QDs 對DEHP具有良好的識別效果和熒光猝滅能力.

圖1 不同TEOS 用量的熒光猝滅效果影響

通過SEM 和TEM 對MIP-QDs 和NIP-QDs 進行形貌采集,結(jié)果如圖2 所示.從圖中可見,MIPQDs 和NIP-QDs 為表面粗糙,形貌均一的微球,直徑約為(90±15)nm.同時,TEM 顯示微球具有明顯的殼核結(jié)構(gòu),表明量子點成功包埋進聚合物中.此外,SEM 和TEM 采集的聚合物在形貌和大小上沒有明顯差異,這是由于MIP-QDs 和NIP-QDs 的合成方法相同.

圖2 MIP-QDs(A、a)和NIP-QDs(B、b)的掃描電鏡和透射電鏡圖

為進一步驗證關(guān)鍵基團是否成功接枝在分子印跡層上,通過傅里葉紅外變換光譜(FT-IR)和X射線光電子能譜(XPS)對MIP-QDs 和NIP-QDs 的表面功能性基團和元素進行解析,結(jié)果如圖3 所示.圖3(a)顯示,在795 和460 cm-1附近的振動峰則是由Si-O 的拉伸振動得到,1 061 cm-1處的特征峰為Si-O-Si 的伸縮振動,表明硅球已成功形成.在2930 cm-1處的伸縮振動一般被認為是-CH3和-CH2振動.此外,在3334 和1550cm-1處的伸縮振動峰值來自-NH/NH2化學(xué)鍵[19],表明APTES 中的特征基團成功接枝在硅球表面.MIP-QDs和NIP-QDs的FT-IR 譜圖基本一致,表明聚合物成功被合成.圖3(b)顯示,150 eV 處的Si2s 峰、400 eV 處的Cd3d5/2峰、525 eV 處的O 峰、979 eV 處的O 峰揭示了MIP-QDs 上Si、Cd、O 的存在[20],進一步表明量子點被成功包埋在SiO2層中,形成殼核結(jié)構(gòu).MIPQDs 和NIP-QDs 的XPS 能譜顯示出相同峰型,表明MIP-QDs 上的模板也成功被洗脫.

圖3 MIP-QDs 和NIP-QDs 的FT-IR(a)和XPS(b)能譜圖

2.2 MIP-QDs 熒光響應(yīng)特性研究

MIP-QDs 與模板間的相互作用需要一定的反應(yīng)時間,為獲得最佳響應(yīng)時間,將DEHP(20 mg·L-1,乙醇溶解)加入MIP-QDs 中連續(xù)掃描1 000 s,結(jié)果如圖4(a)所示.向體系中加入DEHP 后體系熒光持續(xù)降低,孵育300 s 后,熒光強度基本穩(wěn)定不變,表明此時MIP-QDs 與DEHP 之間達到動態(tài)吸附平衡.因此后續(xù)實驗的孵育時間均設(shè)置為300 s.MIP-QDs濃度也是影響傳感器檢測的重要因素,過低或者過高的濃度均會導(dǎo)致傳感器的線性和靈敏度[21].如圖4(b)所示,隨著MIP-QDs 質(zhì)量濃度增加,MIPQ Ds對DEHP的熒光猝滅程度(F0-F)逐漸增大,在MIP-QDs質(zhì)量濃度為25 mg·L-1時,熒光猝滅程度最高.分子印跡聚合物的特異性熒光猝滅反應(yīng)受印跡層空腔空間構(gòu)型的影響,體系中水的溶脹作用是影響檢測靈敏度的重要因素[18].如圖4(c)所示,水的存在顯著影響了MIP-QDs 對DEHP 選擇性,當水的比例達到80%時,MIP-QDs 對DEHP 的熒光猝滅效率最大,因此,后續(xù)實驗中選擇80%的水比例.強酸或強堿性環(huán)境對印跡層有明顯的破壞作用,甚至電離印跡層,導(dǎo)致聚合物表面的識別為點被破壞[19].圖4(d)顯示,隨著pH 的增加,MIP-QDs 對DEHP 的熒光猝滅效率呈先增加后降低的趨勢,當pH 為8.0 時,KSV最高(數(shù)值為14.3),此時印跡因子(IF)為2.3,表明MIP-QDs 對DEHP 具有優(yōu)異的識別能力.

圖4 MIP-QDs 的孵育時間(a)、質(zhì)量濃度(b)、水的比例(c)、體系pH(d)優(yōu)化

2.3 MIP-QDs 的性能研究

為評價MIP-QDs 對DEHP 的特異性選擇能力,以鄰苯二甲酸丁基芐酯(BBP)、鄰苯二甲酸二乙酯(DEP)、鄰苯二甲酸二壬酯(DNP)和鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)為抑制劑,進行熒光響應(yīng)分析,其中DEHP 質(zhì)量濃度為25 mg·L-1,其他結(jié)構(gòu)類似物質(zhì)量濃度為50 mg·L-1,結(jié)果如圖5 所示.由圖可知,MIPQDs 對DEHP 有較高熒光響應(yīng),相比于BBP、DEP、DNP、DBP 等結(jié)構(gòu)類似物,其Ksv值達到15.1,印跡因子(IF)達到2.37.NIP-QDs 對所有物質(zhì)的熒光響應(yīng)基本相同,表明構(gòu)建的MIP-QDs 具有識別DEHP 的印跡位點,能夠特異性識別和吸附DEHP導(dǎo)致熒光猝滅,而對于結(jié)構(gòu)類似物,雖然具有相似的結(jié)構(gòu),但印跡位點在形狀、大小以及結(jié)構(gòu)上無法與之匹配,因此無法特異性識別其他物質(zhì).

圖5 MIP-QDs 的選擇性評估

2.4 MIP-QDs 在海水中的應(yīng)用

通過分析所構(gòu)建的熒光傳感器在最佳體系下的線性、準確度、檢出限和回收率,探討了其在實際樣品中的應(yīng)用前景.如圖6 所示,在最佳檢測體系下,MIP-QDs 的熒光強度在0.005～25 mg·L-1的DEHP 濃度范圍內(nèi)隨DEHP 濃度的增加而猝滅,熒光猝滅效率值(F0/F-1)逐漸增大,熒光猝滅效率與DEHP 濃度之間滿足Stern-Volmer 方程,并在0.005～25 mg·L-1范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系,滿足線性方程F0/F-1=0.0152X+0.0593,相關(guān)性系數(shù)R2=0.9901,檢測限(LOD)為1.5 μg·L-1,表明構(gòu)建的MIP-QDs 可用于DEHP 定量測定.

圖6 MIP-QDs 熒光響應(yīng)線性及方程

此外,由表3 可知,在0.1、5.0、10.0 mg·L-1的3 個空白加標質(zhì)量濃度下,測定的MIP-QDs 對DEHP 的回收率分別為92.0%、96.8%、95.5%,RSD均小于8.2%,表明構(gòu)建的傳感器可用于實際樣本中DEHP 的檢測.

表3 海水中DEHP 的熒光分析(n=6)

為進一步探究實際應(yīng)用的可行性,采集象山港3 條入海河流的海水樣本進行GC-MS/MS 和MIP-QDs 比較分析.由圖7 可知,GC-MS/MS 的檢測結(jié)果分別為13.22、26.64、27.44 μg·L-1,MIP-QDs的檢測結(jié)果分別為11.56、23.24、25.17 μg·L-1,與GC-MS/MS 結(jié)果相比,兩者RSD 小于5.5%,表明兩種方法檢測的結(jié)果具有較好的一致性,構(gòu)建的熒光傳感器可用于實際海水樣本的檢測.

圖7 MIP-QDs 對實際樣品中DEHP 的測定

3 結(jié)論

綜上所述,通過改進的反相微乳液法合成了基于DEHP 的分子印跡聚合物.并成功將APTES和TEOS 接枝到量子點表面,結(jié)合量子點優(yōu)異的光學(xué)特性實現(xiàn)了DEHP 的高靈敏度和高選擇性檢測.形貌和結(jié)構(gòu)表征表明MIP-QDs 獲得成功制備,通過優(yōu)化合成和檢測體系,成功構(gòu)建了用于DEHP快速檢測的熒光傳感器.實際應(yīng)用中,熒光猝滅效率(F0/F-1)與DEHP 濃度之間存在良好的線性關(guān)系,檢出限低至1.5 μg·L-1.本文制備的熒光傳感器進一步提高了DEHP的檢測效率,在靈敏度和檢測時間方面優(yōu)于傳統(tǒng)的檢測方法,可應(yīng)用海水中DEHP的檢測.