褚琪琪，王筱倩，黨雪平，陳懷俠

(湖北大學化學化工學院， 湖北 武漢 430062)

0 引言

對氨基苯酚(p-aminophenol，PAP)和間氨基苯酚(m-aminophenol，MAP)常被應用于氧化型染發(fā)劑，但這些化合物可經皮吸收，長期使用會導致接觸性皮炎或過敏，甚至會致癌、致畸[1]. 2015年，國家化妝品安全技術規(guī)范(STSC)明確規(guī)定氧化型染發(fā)劑中氨基苯酚類最大含量不允許超過0.5%[2].

已有多種方法用于測定氨基苯酚，如高效液相色譜法[3]、拉曼光譜檢測法[4]、電化學檢測法[5]和毛細管電泳法[6]等. 其中，高效液相色譜法由于操作方便、檢測費用低而得到廣泛應用.

染發(fā)劑樣品基質復雜，干擾嚴重. 合適的樣品前處理是其定量分析的關鍵，常用的方法有固相微萃取(SPME)、液相微萃取(LPME)和磁固相萃取(MSPE)等[7-9]. 磁固相萃取是固相萃取的新技術，具有快速分離的優(yōu)點. 分子印跡聚合物具有分子識別選擇性，是理想的吸附材料. 分子印跡磁材料兼具磁微粒和分子印跡的優(yōu)勢，在磁萃取中得到廣泛應用，如應用于食品分析、環(huán)境分析、藥物分析等樣品前處理[10-12]. 目前，未見分子印跡磁材料應用于染發(fā)劑中氨基苯酚類化合物分離分析的研究報道.

本研究以共沉淀法制備出粒度均勻、分散良好、磁響應迅速的納米Fe3O4，依次用正硅酸乙酯和3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷對其進行表面修飾，采用表面印跡方法合成了對氨基苯酚的磁性分子印跡聚合物.以紅外吸收光譜、X線衍射光譜、磁滯回線和熱重分析進行材料的理化性能表征. 將該分子印跡磁性聚合物應用于染發(fā)劑中氨基苯酚類化合物的磁固相萃取，通過優(yōu)化萃取條件，建立了染發(fā)劑中PAP和MAP的磁固相萃取-高效液相色譜定量分析方法，該方法操作簡便、分離快速且選擇性高.

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑LC-CT310型高效液相色譜儀(江蘇天瑞公司)；DAD230二極管陣列檢測器(江蘇天瑞公司)；SMT-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱(美國 Supelco Technologies)；DZ-2BCⅡ型真空干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司)；UPW-20 N 超純水機(北京歷元電子儀器有限公司)； DW-Z型多功能化攪拌器(鞏義市予華儀器有限公司)；HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋(國華電器有限公司)；WH-3 微型旋渦混合儀(上海滬西分析儀器廠有限公司)；KQ 3200E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)； CP213 分析天平(上海五相儀器有限公司).

對氨基苯酚(PAP)、間氨基苯酚(MAP)、氯化鐵(FeCl3·6H2O)、3-(異丁烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷、2,2-偶氮二異丁腈(AIBN)、乙二醇二甲基丙烯酸甲酯和甲基丙烯酸(MAA)均為分析純，購買于上海阿拉丁試劑有限公司；氯化亞鐵(FeCl2·4H2O)、正硅酸乙酯、氫氧化鈉、氨水(25%～28%)、無水乙醇、乙腈、醋酸和甲苯均為分析純購買于上海國藥集團化學試劑公司；醋酸胺購買于上海麥克林試劑有限公司；氯化鈉為分析純購買于天津博迪化工股份有限公司；甲醇色譜純購買于美國Fisher公司.

1.2 色譜條件流動相組成為1 mmol/L的乙酸銨溶液∶甲醇(20∶80,V/V)；流動相流速: 1.0 mL/ min； 色譜柱柱溫：30 ℃；樣品進樣量：20 μL；測試波長：285 nm和300 nm.

1.3 磁性分子印跡聚合物的合成納米Fe3O4的合成：4.053 g FeCl3·6H2O和1.987 5 g FeCl2·4H2O溶于80 mL水，在氮氣保護下，以300 r/min的速度攪拌，逐滴加入50 mL氨水，80 ℃反應30 min，合成的Fe3O4微粒用超純水洗滌多次，產物放入真空干燥箱，60 ℃真空干燥24 h.

Fe3O4@SiO2的合成：將0.3 g納米Fe3O4，50 mL乙醇和4 mL超純水進行混合，超聲15 min，加入5 mL氨水、2 mL TEOS后，室溫下反應12 h，產物用磁鐵分離，經超純水和乙醇洗滌至中性，放入真空干燥箱，60 ℃真空干燥24 h.

Fe3O4@SiO2@MPS的合成：將0.15 g Fe3O4@SiO2溶于30 mL無水甲苯，加入1 mL MPS，60 ℃水浴加熱反應5 h，用磁鐵分離產物，以乙醇洗滌，放入真空干燥箱，60 ℃真空干燥24 h.

磁性分子印跡聚合物(MMIPs)的合成：將0.5 mmol的對氨基苯酚溶于由10 mL甲醇、2 mL乙腈、5 mL氨水和3 mL 5 mmol/L乙酸銨溶液構成的混合溶液，加入170 μL MAA，超聲30 min，放入4 ℃的冰箱中低溫反應12 h.加入0.1 g Fe3O4@SiO2@MPS，攪拌并超聲30 min，然后加入1.9 mL EGDMA和0.06 g AIBN, 在氮氣保護下攪拌超聲30 min，60 ℃水浴加熱反應24 h.產物用磁鐵分離，并用乙腈和乙醇洗滌數(shù)次，放入真空干燥箱，60 ℃真空干燥24 h.

磁性非印跡聚合物(MNIPs)的合成：除不加模板分子對氨基苯酚外，其他步驟同上.

1.4 標準溶液和樣品溶液的配制標準溶液的配制：分別配制1 mg/mL PAP和MAP的甲醇儲備液，存于冰箱4 ℃待用.實驗前分別用超純水稀釋成所需濃度.

樣品溶液的制備：將40 g染發(fā)劑樣品溶于200 mL甲醇，超聲15 min溶解，沉降2 h. 取上清液旋轉蒸發(fā)溶劑，殘留物用超純水溶解并過濾，濾液轉移至500 mL容量瓶并用超純水定容，存于冰箱4 ℃待用.

1.5 磁萃取過程取10 mg分子印跡磁材料于培養(yǎng)瓶中，加入10 mL 200 ng/mL PAP和MAP的混合標準水溶液，震蕩30 min，磁鐵分離，除去上清液，用1 mL 1 mmol /L乙酸銨溶液∶甲醇(20∶80,V/V)混合液超聲洗脫20 min，洗脫液過0.22 μm濾膜，過膜液直接進行高效液相色譜分析.

磁性分子印跡聚合物的制備流程和磁萃取過程見圖1.

圖1 對氨基苯酚印跡磁微粒制備流程和磁萃取過程圖

2 結果與討論

2.1 材料表征

圖2 Fe3O4(a)、Fe3O4@SiO2(b)、Fe3O4@SiO2@MPS(c)和對氨基苯酚印跡聚合物磁微粒(d)的紅外光譜

2.1.2 XRD圖譜分析 圖3是Fe3O4(a)、Fe3O4@SiO2(b)、Fe3O4@SiO2@MPS(c)和對氨基苯酚印跡聚合物磁微粒(d)的X線衍射圖，可見，F(xiàn)e3O4的6個特征衍射峰出現(xiàn)在2θ=30.45°, 35.53°, 43.21°, 53.47°, 57.06° 和62.68°處，這同樣與面心立方標準XRD圖譜中Fe3O4的標準衍射峰對應，且沒有明顯的雜峰，說明Fe3O4純度滿足要求.而Fe3O4@SiO2、Fe3O4@SiO2@MPS和對氨基苯酚印跡聚合物磁微粒的主要衍射峰與Fe3O4的特征衍射峰位置一致，說明經表面修飾和印跡聚合物包覆后，F(xiàn)e3O4的晶體結構未被破壞，該復合材料依然保持著良好的磁性.

圖3 Fe3O4(a)、Fe3O4@SiO2(b)、Fe3O4@SiO2@MPS(c)和對氨基苯酚印跡聚合物磁微粒(d)的X線衍射圖

2.1.3 磁滯回線分析 Fe3O4(a)、Fe3O4@SiO2(b)、Fe3O4@SiO2@MPS(c)和對氨基苯酚印跡聚合物磁微粒(d)的磁滯回線分析圖如圖4所示.復合材料的飽和磁化強度值分別為69.62、55.44、48.93和4.17 emu/g，飽和值的下降表明表面修飾后，磁芯外表面SiO2、乙烯基和印跡層均鍵合成功，且仍然保持良好的磁性，在外加磁場條件下，能滿足快速分離的要求.

圖4 Fe3O4(a)、Fe3O4@SiO2(b)、Fe3O4@SiO2@MPS(c)和對氨基苯酚印跡聚合物磁微粒(d)的磁滯回線分析圖

2.1.4 熱重分析 圖5是對氨基苯酚印跡聚合物磁微粒的熱重分析曲線.可見，合成的印跡磁微粒在300 ℃以下具有良好的穩(wěn)定性.

圖5 對氨基苯酚印跡聚合物磁微粒熱重分析圖

2.2 印跡因子選擇性以富集倍數(shù)(EF)和印跡因子(IF)進行評價，兩者的定義為：

式中C0為樣品溶液分析物的濃度，Celu為洗脫液中分析物濃度，EFMMIP為印跡物對分析物的富集倍數(shù)，EFMNIP為非印跡物對分析物的富集倍數(shù).

如表1所示，該印跡材料對PAP和MAP的印跡因子IF分別為2.56和2.27，說明該材料對PAP和MAP具有良好的吸附選擇性，適用于實際樣品中的氨基苯酚類化合物的分離萃取.

表1 MMIPs和MNIPs對對氨基苯酚和間氨基苯酚的富集倍數(shù)和印跡因子

2.3 萃取條件的優(yōu)化

2.3.1 上樣時間的考察 在相同萃取條件下，取5份10 mL 200 ng/mL對氨基苯酚和間氨基苯酚混標溶液進行萃取，考察上樣時間分別為10、20、30、40、50 min時的回收率.結果顯示，上樣時間30 min時的吸附效果最好.因此，后續(xù)實驗中的上樣時間為30 min.

2.3.2 洗脫時間的考察 在相同的萃取條件下，考察洗脫時間分別為5、10、15、20和25 min時的回收率.結果顯示，洗脫時間為20 min時，具有良好的洗脫效果.因此，后續(xù)實驗選擇洗脫20 min.

2.3.3 上樣體積的考察 在相同萃取條件下，分別取10、20、30、40和50 mL 200 ng/mL分析物混標溶液上樣，考察樣品體積對于回收率的影響.結果表明，10 mL樣品上樣時，目標物的回收率最高.因此，后續(xù)實驗選擇10 mL樣品溶液上樣.

2.3.4 洗脫劑組成的考察 在相同萃取條件下，以1 mmol/L乙酸銨溶液:甲醇分別為10∶90、20∶80、30∶70、40∶60和50∶50 (V/V)的混合液為洗脫劑，考察洗脫劑組成對回收率的影響.實驗結果顯示，乙酸銨溶液和甲醇的體積比為20∶80時，目標物的回收率最高.因此，后續(xù)實驗選擇1 mmol/L乙酸銨溶液∶甲醇=20∶80 (V/V)的混合液為洗脫液.

2.3.5 洗脫劑體積的考察 在相同萃取條件下，分別用0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 mL洗脫液進行洗脫.結果顯示，1.0 mL洗脫液能夠實現(xiàn)定量洗脫，綜合考慮上樣體積和富集倍數(shù)，后續(xù)實驗選擇1 mL洗脫液.

2.3.6 溶液酸度的考察 在相同萃取條件下，在pH為6～11范圍內考察溶液酸度對萃取率的影響.結果顯示，樣品溶液pH值從6增加到7時，分析物的回收率呈現(xiàn)上升趨勢，pH 在7～9時，回收率基本不變，而pH>9時，回收率再次下降.這是因為氨基苯酚的兩級解離常數(shù)(pKa)分別為5.43和10.40，即在pH<6.43的酸性條件下，氨基苯酚質子化為陽離子，在pH>9.40的堿性條件下，氨基苯酚會解離為陰離子，都不利于印跡材料的吸附分離.只有在pH約為7～9時，氨基苯酚以分子狀態(tài)存在，印跡材料的分子識別吸附使得回收率較高.即材料的印跡和分子識別吸附主要是氫鍵作用.樣品溶液的pH值約為8，因此，在后續(xù)實驗中，不改變溶液pH值.

2.3.7 溶液鹽度的考察 其他萃取條件不變，為考察溶液中離子強度對萃取效率的影響，在溶液中加入不同量的NaCl固體(0～20%，w/v).實驗結果顯示，樣品溶液中加入NaCl后，目標物的回收率明顯下降.因此，在后續(xù)實驗中，樣品溶液中不加鹽.

2.4 方法評價在優(yōu)化的萃取條件下，建立染發(fā)劑樣品中對氨基苯酚和間氨基苯酚的MSPE-HPLC定量分析方法. 如表2所示，以Y表示峰面積，X表示分析物的濃度，對氨基苯酚在0.06～50 mg/kg線性范圍內線性關系良好，線性回歸方程為Y=25.672 0X-1.135 6 (R2=0.998 9)；間氨基苯酚在0.08～50 mg/kg線性范圍內線性關系良好，線性回歸方程為Y=27.251 0X-0.492 1(R2=0.998 3).檢出限(LOD，S/N=3)分別為0.018 mg/kg和0.024 mg/kg；定量限(LOQ，S/N=10)分別為0.060 mg/kg和0.080 mg/kg.

表2 線性范圍、檢測限和定量限

為考察方法的準確度和重現(xiàn)性，在空白染發(fā)劑中分別加入0.06、10和50 mg/kg對氨基苯酚和間氨基苯酚. 如表2所示，目標物的加標回收率在89.7～103.8 %范圍內，日內和日間精密度(RSD)分別為0.8%～3.9%和0.7%～7.7%，說明該方法準確度高、重現(xiàn)性好，能滿足染發(fā)劑樣品中氨基萘酚類化合物的定量分析.

2.5 實際樣品分析將本方法應用于超市購買的兩種染發(fā)劑檢測.按照1.4制備樣品溶液，結果發(fā)現(xiàn)，兩種樣品中對氨基苯酚的含量分別為0.46%和1.02%，間氨基苯酚的含量分別為為0.37%和0.78%.

2.6 方法比較將本方法與其他氨基苯酚的分析方法進行比較，如表3所示.可見，本方法比現(xiàn)有方法的檢出限低很多，線性范圍更寬，即分子印跡材料對目標物具有良好的分離富集效果.本方法適用于染發(fā)劑樣品中氨基苯酚類化合物的分離分析.

表3 本方法與其他方法的比較

3 結論

在SiO2和MPS雙重修飾的納米Fe3O4表面成功合成了對氨基苯酚分子印跡聚合物.該材料具有良好的熱穩(wěn)定性和磁性，對于氨基苯酚類化合物具有良好的分子識別吸附選擇性，應用于磁固相萃取，該萃取方法簡便快速，分離富集效果好.建立了染發(fā)劑中氨基苯酚類化合物的MSPE-HPLC分析方法. 該方法選擇性好、靈敏度高、重現(xiàn)性好，且操作簡便，適用于染發(fā)劑樣品中氨基苯酚類的定量分離分析.