靳 瑛，徐曉健，陳慧瑾，馬志中

1 解放軍總醫(yī)院第三醫(yī)學(xué)中心 眼科醫(yī)學(xué)部，北京 100143；2 北京市神經(jīng)外科研究所，北京 100070；3 北京大學(xué)第三醫(yī)院 眼科，北京 100191

視力不良預(yù)后的眼外傷青壯年及士兵的主要損傷類型是開放性眼外傷，目前無有效治療手段。在開放性眼外傷中，40% ～ 60%的病例發(fā)生外傷性增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病變(proliferative vitreoretinopathy，PVR)，其引起的牽拉性視網(wǎng)膜脫離(traction retinal detachment，TRD)最終將導(dǎo)致眼球萎縮[1-2]。傷后視網(wǎng)膜形成的增殖膜是眼內(nèi)繼發(fā)損害的主要因素。由于受到研究手段的限制，以往PVR基因研究效率較低。近年來，高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展使得這種研究成為可能。另外，針對(duì)術(shù)中PVR增殖膜，由于其樣品組織小的特點(diǎn)，其基因分析是傳統(tǒng)的高通量測(cè)序無法完成的。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(RNA-sequencing，RNA-seq)基于高通量測(cè)序平臺(tái)如Illumina，通過研究某個(gè)物種在特定狀態(tài)或特定時(shí)期下少量組織細(xì)胞的mRNA，針對(duì)實(shí)際樣品信息采用靈活的差異分析策略可以找到生物體不同狀態(tài)細(xì)胞差異表達(dá)的mRNA，再通過軟件進(jìn)行功能注釋，最終可以得到單細(xì)胞在生物體中參與生命活動(dòng)的清晰生物信息圖譜。這一技術(shù)手段為解析細(xì)胞的行為、機(jī)制及其與機(jī)體的關(guān)系等提供了新方法[3-4]。本研究通過對(duì)4例眼球開放傷后玻璃體切除術(shù)中獲取的PVR增殖膜標(biāo)本進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，探討早期與晚期增殖膜的基因表達(dá)。

材料與方法

1標(biāo)本來源 收集北京大學(xué)第三醫(yī)院眼科2015年1 - 12月4例12 ～ 45歲男性開放性眼外傷住院患者的視網(wǎng)膜增殖膜標(biāo)本。玻璃體切除術(shù)中術(shù)者使用眼內(nèi)鑷將視網(wǎng)膜增殖膜取出，置液氮中冷凍1 min后，放入-80℃凍存。4例視網(wǎng)膜前膜和(或)視網(wǎng)膜下膜病例臨床特征見表1。本研究已通過北京大學(xué)第三醫(yī)院醫(yī)學(xué)科學(xué)研究倫理委員會(huì)審批(reference no.IRB00006761-2 015 190)。所有參加研究的患者均在手術(shù)前簽署知情同意書。

2標(biāo)本分組 4個(gè)標(biāo)本根據(jù)傷術(shù)時(shí)間分為早期組和晚期組；標(biāo)本均為視網(wǎng)膜前膜或(和)視網(wǎng)膜下膜，PVR分級(jí)均為C級(jí)。早期膜組(EM組，n=2，M1，M2，傷-術(shù)時(shí)間≤30 d)；晚期膜組(LM組，n=2，M3，M4，傷-術(shù)時(shí)間＞30 d)；比較早期與晚期增殖膜的基因表達(dá)。

表 1 4例開放性眼外傷增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病變患者特征Tab. 1 Characteristics of patients with proliferative vitreoretinopathy after open globe injury of the 4 obtained specimens

3轉(zhuǎn)錄組測(cè)序 提取增殖膜總RNA。單細(xì)胞采集液包含細(xì)胞裂解成分和RNase抑制劑，采用帶有OligodT的核酸序列進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，形成1st cDNA。對(duì)1st cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增富集核酸，純化擴(kuò)增產(chǎn)物后進(jìn)行文庫構(gòu)建，構(gòu)建好的文庫用Illumina HiSeq 2500進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序策略為PE125。Illumina高通量測(cè)序結(jié)果采用TopHat v2.0.12軟件與人類參考基因組(GRCh38)比對(duì)。

4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 根據(jù)計(jì)算每個(gè)條目的基因數(shù)目，應(yīng)用超幾何檢驗(yàn)，找出與整個(gè)基因組背景相比在差異表達(dá)基因中顯著富集的GO條目，計(jì)算得到的P值通過校正之后，以Q＜0.05為閾值，滿足此條件的GO條目定義為在差異表達(dá)基因中顯著富集。采用DEseq2對(duì)EM與LM進(jìn)行基因差異表達(dá)分析，以|log2LM/EM| ≥1和Q＜0.05作為基因差異表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)。

結(jié) 果

1PVR增殖膜轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)量 共獲得135 586 954條讀長(zhǎng)，其中可比對(duì)到參考基因組的讀長(zhǎng)數(shù)為130 304 457(96.1%)，唯一比對(duì)到基因組的讀長(zhǎng)數(shù)為119 999 185(88.5%)。

2差異表達(dá)基因 相對(duì)于EM組，LM組共有397個(gè)基因發(fā)生了差異性表達(dá)，其中254個(gè)基因顯著上調(diào)，152個(gè)基因顯著下調(diào)。見圖1。

圖 1 不同時(shí)期外傷性增殖膜的DEGs基因火山圖。橘黃色點(diǎn)代表上調(diào)，綠色點(diǎn)代表下調(diào)?；疑c(diǎn)代表非顯著DEGs。FC：倍數(shù)變化；DEGs：差異表達(dá)基因Fig.1 Volcano plots of DEGs of traumatic proliferative membrane at different stages. FC: fold change; DEGs: differentially expressed genes. Orange dots indicate up-regulation. Green dots indicate down-regulation. Grey dots indicate nonsignificant DEGs

3差異表達(dá)基因聚類分析 利用R軟件對(duì)LM與EM組的差異表達(dá)基因進(jìn)行分層聚類分析，結(jié)果顯示差異表達(dá)基因M1和M2聚為一類，而M3和M4聚為一類。提示差異基因可將LM與EM組進(jìn)行區(qū)分。見圖2。

圖 2 不同時(shí)期外傷性增殖膜的DEGs差異基因聚類熱圖。每列代表1個(gè)樣品，每行代表1個(gè)轉(zhuǎn)錄本,顏色越紅則表達(dá)量越高，顏色越藍(lán)則表達(dá)量越低，LM與EM在整體基因表達(dá)方面存在明顯差異Fig.2 Hierarchical clustering of DEGs of traumatic proliferative membrane at different stages. Each column represents a sample, and each row represents a transcript. Deeper red represents higher expression level, and deeper blue means lower expression level. There are significant differences in overall gene expression between the two groups

圖 3 不同時(shí)期外傷性增殖膜的DEGs差異表達(dá)基因的GO統(tǒng)計(jì)柱狀圖。紅色代表上調(diào)，綠色代表下調(diào)Fig.3 Histogram presentation of GO functional annotations for the DEGs of traumatic proliferative membrane at different stages. Red indicates up-regulation. Green indicates down-regulation

4差異表達(dá)基因GO分析 GO注釋分為三個(gè)分支，分別為生物學(xué)過程(biological process，BP)、細(xì)胞組分(cellular component，CC)和分子功能(molecular function，MF)，上述三個(gè)分支的三級(jí)條目的數(shù)量分別為24個(gè)、22個(gè)和22個(gè)。本研究中的差異基因注釋到BP、CC和MF三級(jí)條目中的個(gè)數(shù)分別為22個(gè)、15個(gè)和15個(gè)。在生物學(xué)過程中，差異基因主要注釋到單一生物體過程、細(xì)胞過程和生物調(diào)控等條目。在細(xì)胞組分中，差異基因主要注釋到細(xì)胞組分、膜部分、細(xì)胞和膜等條目。在分子功能中，差異基因主要注釋到結(jié)合和催化等條目(圖3)。結(jié)果顯示，與整個(gè)基因組背景相比，生物學(xué)過程中的細(xì)胞通訊(P=9.4 × 10-18，F(xiàn)DR=8.18 × 10-14) 、信 號(hào) (P=1.9 × 10-17，F(xiàn)DR=8.18 × 10-14)等GO條目發(fā)生顯著富集。細(xì)胞組分中，細(xì)胞外間隙(P=1.2 × 10-16，F(xiàn)DR=1.78 × 10-13)、細(xì)胞外空間蛋白質(zhì)性細(xì)胞外基質(zhì)(P=6.3 × 10-10，F(xiàn)DR=2.34 × 10-10)和 細(xì) 胞外 基 質(zhì)(P=3.4 × 10-12；FDR=8.43 × 10-10)等GO條目發(fā)生顯著富集。分子功能中，共有9個(gè)GO條目發(fā)生了顯著富集，分別為抗原結(jié)合(P=2.4 × 10-7；FDR=8.02 × 10-4)、細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)成分 (P=4.1 × 10-7；FDR=8.02 ×10-4)、血小板衍生生長(zhǎng)因子結(jié)合(P=8.7 × 10-6；FDR=9.4 × 10-3)、糖 胺 聚 糖 結(jié) 合(P=1.0 × 10-5；FDR=9.4 × 10-3)、受體活性(P=1.2 × 10-5；FDR=9.4 × 10-3)、配體門控通道活性(P=3.8 × 10-5；FDR=0.02)、配體門控離子通道活性(P=3.8 × 10-5；FDR=0.02)、信號(hào)受體活性(P=6.1 × 10-5；FDR=0.03)、細(xì)胞因子活性(P=6.5 × 10-5；FDR=0.03)。

5KEGG通路分析 結(jié)果顯示有5條通路發(fā)生了顯著富集，分別為細(xì)胞黏附分子(P=8.65 × 10-6；FDR=2.8 × 10-3)、蛋白質(zhì)消化吸收(P=3.84 × 10-5；FDR=4.5 × 10-3)、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作 用 (P=4.83 × 10-5；FDR=4.5 × 10-3)、核 糖體(P=5.58 × 10-5；FDR=4.5 × 10-3)和細(xì)胞外基質(zhì)受體相互作用 (P=7.74 × 10-5；FDR=5.0 × 10-3)。見圖4、表2。

圖 4 不同時(shí)期外傷性視網(wǎng)膜增殖膜的DEGs通路富集散點(diǎn)圖。每個(gè)點(diǎn)表示該通路的富集程度，顏色越趨近于紅色表示富集程度越高。每個(gè)點(diǎn)的大小表示富集到該通路的基因的個(gè)數(shù)，點(diǎn)越大表示富集到該通路的基因越多，反之則越少Fig.4 Bubble chart of KEGG for the DEGs of traumatic proliferative membrane at different stages. Running horizontally along the graph is the enrichment factor. Each dot indicates the enrichment degree of the pathway, and deeper red indicates higher enrichment degree. The size of each dot indicates the number of genes enriched in this pathway. The larger the dot, the more genes enriched in this pathway, and vice versa

討 論

對(duì)外傷性PVR與特發(fā)性PVR的認(rèn)識(shí)是PVR預(yù)后分析的基礎(chǔ)。特發(fā)性PVR指由于孔源性視網(wǎng)膜脫離所導(dǎo)致的增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病變。特發(fā)性PVR發(fā)生的視網(wǎng)膜下膜的收縮力主要來自具有肌成纖維細(xì)胞特性的RPE細(xì)胞[5]。而外傷性PVR因?yàn)閭澜M織修復(fù)的參與，成纖維細(xì)胞增殖在外傷后的增殖反應(yīng)過程中起到了至關(guān)重要的作用，其中成纖維細(xì)胞主要由膠質(zhì)細(xì)胞和RPE細(xì)胞轉(zhuǎn)化而來[6]。

不同開放性眼外傷后PVR的發(fā)生率：貫通傷15%，破裂傷27%，穿通傷23%，眼內(nèi)異物存留35%[7]。外傷性PVR是嚴(yán)重開放性眼外傷后導(dǎo)致眼球不良預(yù)后的主要危險(xiǎn)因素。對(duì)外傷性PVR的深入研究將有助于我們提高對(duì)嚴(yán)重開放性眼外傷的救治成功率。

以往的研究表明，從分期的角度認(rèn)識(shí)眼外傷后的損傷修復(fù)過程十分重要[8-10]。即早期以細(xì)胞反應(yīng)為主，其中包括炎癥細(xì)胞、肌成纖維細(xì)胞和RPE細(xì)胞等。晚期則表現(xiàn)為細(xì)胞含量下降，以慢性反應(yīng)細(xì)胞為主，同時(shí)代之以細(xì)胞外基質(zhì)成份，如膠原。通過發(fā)現(xiàn)不同時(shí)期參與損傷修復(fù)過程中的基因變化，尋找外傷性增殖膜生物標(biāo)記物，是外傷性PVR早期治療的關(guān)鍵。

表 2 不同時(shí)期外傷性增殖膜的RNA-seq富集KEGG的差異表達(dá)基因Tab. 2 Differential expression genes of enriched KEGG of traumatic proliferative membrane at different stages

細(xì)胞黏附分子信號(hào)通路(cell adhesion molecules，CAMs)，細(xì)胞黏附分子是表達(dá)在細(xì)胞膜表面的一種糖蛋白，在很多生物過程中都起到了重要作用，如止血、免疫反應(yīng)、炎癥、胚胎發(fā)生、神經(jīng)組織的生長(zhǎng)發(fā)育等。其中主要包括4個(gè)家族：整合素家族、免疫球蛋白超家族、選擇素類、鈣黏蛋白(Cadherin)。其主要作用是抗原識(shí)別，共同刺激和細(xì)胞黏附。以往的研究表明，細(xì)胞黏附分子分別在PVR增殖膜中的肌成纖維細(xì)胞活化過程和視網(wǎng)膜表面膜的免疫及炎癥反應(yīng)中起重要作用[11-12]。

在本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，CAMs通路在晚期PVR膜組織中顯著富集，其中整合素亞單位8基因呈上調(diào)差異表達(dá)。整合素家族最初是因此類黏附分子主要介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的黏附，使細(xì)胞得以附著形成整體而得名。整合素是一種介導(dǎo)細(xì)胞與其外環(huán)境(如細(xì)胞外基質(zhì))之間連接的跨膜受體。在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中，整合素將ECM的化學(xué)成分與力學(xué)狀態(tài)等有關(guān)信息傳入細(xì)胞。因此，整合素除了穿過膜的機(jī)械作用，也參與了細(xì)胞訊息、細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)、細(xì)胞形態(tài)以及細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)。整合素是由α(120 ～ 185 kU)和β(90 ～ 110 kU)兩個(gè)亞單位形成的異二聚體。迄今已發(fā)現(xiàn)18種α亞單位和9種β亞單位。以含有β亞單位的不同可將整合素家族分為8個(gè)組(β1組 ～ β8組)。整合素β8的功能目前不清楚。Morales等[13]應(yīng)用體外PVR模型中培養(yǎng)的RPE細(xì)胞證實(shí)，整合素通過影響RPE細(xì)胞去分化參與PVR的組織損傷修復(fù)過程。由此提示了整合素β8亞單位有可能在PVR增殖膜RPE細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化過程中起到重要作用。

鈣黏蛋白也是CAMs通路的一員。鈣黏蛋白是一種同親型結(jié)合、Ca依賴的細(xì)胞黏著糖蛋白，對(duì)胚胎發(fā)育的細(xì)胞識(shí)別、遷移、組織分化和成體組織器官構(gòu)成具有重要作用。

本研究結(jié)果顯示鈣黏蛋白5基因呈上調(diào)差異表達(dá)。Cadherin 5基因編碼鈣黏蛋白家族中的一個(gè)經(jīng)典鈣黏蛋白。編碼的前蛋白原經(jīng)過蛋白水解過程而形成成熟的糖蛋白。這種鈣依賴的細(xì)胞和細(xì)胞間的黏附分子是由5個(gè)細(xì)胞外的鈣黏蛋白重復(fù)、1個(gè)跨膜區(qū)域和1個(gè)高度保守的細(xì)胞質(zhì)尾組成。作為一種細(xì)胞共有的經(jīng)典黏附蛋白，其在細(xì)胞連接的裝配和維持方面起重要作用。Cadherin 5基因定位于16號(hào)染色體長(zhǎng)臂的一個(gè)基因簇內(nèi)，參與乳腺癌和前列腺癌的雜合子丟失。Chen等[14]通過研究體外培養(yǎng)的ARPE-19細(xì)胞，在EMT過程中發(fā)現(xiàn)RPE的表型轉(zhuǎn)化過程中N-cadherin發(fā)生改變。近年來，在斑馬魚視網(wǎng)膜神經(jīng)元祖細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)，Müller細(xì)胞通過N-cadherin參與視網(wǎng)膜神經(jīng)元的再生[15]。以上研究提示，鈣黏蛋白可能以經(jīng)典作用方式參與PVR的多個(gè)病理過程。

蛋白消化與吸收分子信號(hào)通路，人類基因組中已確定了兩大轉(zhuǎn)運(yùn)載體超家族——溶質(zhì)載體家族和ATP結(jié)合盒超家族(ATP—binding cassette，ABC)，均屬于蛋白消化與吸收分子信號(hào)通路系統(tǒng)。在以往的研究中，溶質(zhì)載體家族和ATP結(jié)合盒超家族，如ABCB、ABCC、ABCG、SLC7、SLC16、SLC19、SLCO/SLC21A、SLC22A和SLC29轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白都是血-眼屏障的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[16]。近年來研究表明，溶質(zhì)載體家族和ATP結(jié)合盒超家族在多種疾病和藥物的遞送中起重要作用[17-19]。在此相關(guān)領(lǐng)域的研究將打開代謝、營養(yǎng)和微環(huán)境等相關(guān)疾病的大門。

本課題結(jié)果顯示ATP1A2，SLC8A3和SLC7 A15P基因呈上調(diào)差異表達(dá)。由此提示SLC和ABC相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在PVR發(fā)展過程中，即血-眼屏障修復(fù)過程中起到了積極的作用。

綜上所述，本課題結(jié)果顯示，在外傷性PVR晚期，CAMs和蛋白消化與吸收信號(hào)通路顯著富集。其中，Integrin β8、Cadherin 5、ATP1A2、SLC8A3和SLC7A15P基因呈上調(diào)差異表達(dá)。結(jié)果提示，整合素β8亞單位有可能在PVR增殖膜RPE細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化過程中起到重要的作用。另外，在血-眼屏障修復(fù)過程中，ATP1A2、SLC8A3和SLC7A15P基因起到了重要作用。

本研究為相對(duì)小樣本量的探索性研究，對(duì)于廣泛的臨床指導(dǎo)尚需更大樣本量、更多時(shí)間段分組才能實(shí)現(xiàn)。另外，本研究結(jié)果中表達(dá)的差異基因提示了下一步研究可能與外傷性PVR的相關(guān)環(huán)節(jié)有關(guān)，但尚需功能驗(yàn)證。