劉文君， 史厚珍， 翟鴻儒， 張維君， 朱永強(qiáng)， 劉子重， 王玉召， 王佳,

(1. 江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013； 2. 江蘇大學(xué)附屬第四人民醫(yī)院神經(jīng)科，江蘇 鎮(zhèn)江 212001； 3. 濱?？h人民醫(yī)院護(hù)理部，江蘇 鹽城 224500)

阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease, AD)是一種神經(jīng)退行性疾病，其主要病理學(xué)特征是β-淀粉樣蛋白(Amyloid-β, Aβ)沉積，神經(jīng)纖維纏結(jié)以及進(jìn)行性神經(jīng)元和突觸丟失[1]。AD的發(fā)病機(jī)制尚未被完全闡明，膽堿能損傷[2]、神經(jīng)炎癥[3]、自噬異常[4]、氧化應(yīng)激[5]、線粒體功能障礙[6]等多種復(fù)雜的病理生理過(guò)程都與AD的發(fā)生有關(guān)。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，線粒體功能障礙在AD的發(fā)病機(jī)制中起著至關(guān)重要的作用[7]。AD患者大腦中Aβ的進(jìn)行性積累可能導(dǎo)致線粒體功能障礙，包括線粒體結(jié)構(gòu)受損、ATP水平降低，線粒體生物合成降低以及線粒體動(dòng)力學(xué)異常[8]。線粒體是一種高度動(dòng)態(tài)的細(xì)胞器，處于一種連續(xù)不斷的融合和分裂的動(dòng)態(tài)過(guò)程，這些持續(xù)不斷的運(yùn)動(dòng)能有效調(diào)節(jié)線粒體的形態(tài)，控制線粒體在細(xì)胞內(nèi)的分布，以適應(yīng)細(xì)胞生長(zhǎng)、分裂、分化過(guò)程。線粒體通過(guò)快速和可逆的分裂、融合過(guò)程，可完成從小圓形細(xì)胞器到巨大管狀結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變，位于線粒體外膜的線粒體融合素1(Mitofusin 1, Mfn1)、線粒體融合素2(Mitofusin 2, Mfn2)及線粒體內(nèi)膜中視神經(jīng)萎縮癥蛋白1(optic atrophy 1, OPA1)共同協(xié)作完成了線粒體的融合[9]，已有研究證實(shí)線粒體的融合對(duì)于其功能的維持至關(guān)重要。干擾線粒體的融合，如OPA1的丟失能夠減少線粒體的氧化磷酸化，降低線粒體的膜電勢(shì)。在線粒體的融合-分裂過(guò)程中，OPA1作為線粒體內(nèi)膜融合蛋白，對(duì)維持線粒體內(nèi)膜的完整性和線粒體嵴的結(jié)構(gòu)起決定性作用[10]。研究表明，OPA1在線粒體能量維持上也發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[11]，增加OPA1水平可以同時(shí)增強(qiáng)線粒體融合和ATP的產(chǎn)生[12]。

近年來(lái)，越來(lái)越多的證據(jù)顯示AD的發(fā)生與神經(jīng)元線粒體融合失衡密切相關(guān)。AD患者腦組織解剖學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，其海馬神經(jīng)元線粒體數(shù)目明顯減少，并伴隨著線粒體結(jié)構(gòu)破壞，如線粒體嵴斷裂、內(nèi)部結(jié)構(gòu)丟失及出現(xiàn)短棒狀線粒體[13]。體外研究也已證實(shí)轉(zhuǎn)染了APP質(zhì)粒的M17細(xì)胞出現(xiàn)大量定位于細(xì)胞核的碎片化的線粒體，上述線粒體形態(tài)及分布的異常伴隨著線粒體融合蛋白表達(dá)的改變[14]。

PGC-1α作為過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor γ, PPARγ)轉(zhuǎn)錄共激活因子能夠促進(jìn)線粒體生物合成及抗氧化酶基因的轉(zhuǎn)錄而被定義為代謝調(diào)節(jié)靶點(diǎn)[15]。PGC-1α主要存在于高能量需求的組織，如心臟、肝臟、骨骼肌和腦[16]。許多神經(jīng)生物學(xué)疾病的發(fā)生都與其腦組織PGC-1α表達(dá)下調(diào)、抗氧化酶減少及活性氧簇誘導(dǎo)的線粒體功能障礙密切相關(guān)[17]，如γ-氨基丁酸能神經(jīng)元敲除PGC-1α能夠模擬精神分裂癥的行為學(xué)表型[18]。PGC-1α通過(guò)調(diào)控基因和環(huán)境的相互作用影響了神經(jīng)突觸的可塑性[18]。帕金森氏綜合征的尸檢報(bào)告提示，患者黑質(zhì)腦區(qū)PGC-1α顯著下調(diào)，同時(shí)伴隨線粒體融合蛋白表達(dá)的降低[19]。然而，在AD中PGC-1α究竟扮演了什么樣的角色？PGC-1α是否參與了AD神經(jīng)元線粒體動(dòng)力學(xué)調(diào)控？PGC-1α能否調(diào)控OPA1的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)，繼而改善AD神經(jīng)元線粒體的動(dòng)力學(xué)反常？

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與抗體 細(xì)胞培養(yǎng)基(美國(guó)Invitrogen公司)，化學(xué)試劑(美國(guó)Sigma-Aldrich公司)，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑DNAfection(鎮(zhèn)江愛(ài)必夢(mèng)生物科技有限公司)，DAB顯色試劑盒、免疫組化試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)，4′, 6-二脒基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽(DAPI)、DEPC水(上海碧云天生物技術(shù)公司)，RNA提取試劑盒(南京諾唯贊生物科技有限公司)，cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)Thermo公司)。Aβ抗體(美國(guó)CST公司)，PGC-1α抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)，OPA1抗體(武漢博士德生物工程有限公司)，免疫熒光二抗：Alexa Fluor 594-山羊抗兔IgG(美國(guó)CST公司)，DyLight 488-山羊抗小鼠IgG(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.1.2 質(zhì)粒和腺相關(guān)病毒 APPswe質(zhì)粒，PGC-1α質(zhì)粒均由武漢淼靈生物科技有限公司構(gòu)建。pAAV-MCS-PGC1α-m-FLAG-HA，pAAV-MCS-FLAG-control腺相關(guān)病毒購(gòu)自和元生物技術(shù)(上海)有限公司。

1.1.3 細(xì)胞系 N2A神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)ATCC公司。

1.1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因AD模型小鼠購(gòu)自美國(guó)Jackson實(shí)驗(yàn)室，C57BL/6(WT)小鼠購(gòu)自江蘇集萃藥康生物科技股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染 細(xì)胞培養(yǎng)至密度為70%時(shí)，使用DNAfection進(jìn)行脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，管1：200 μL選擇性培養(yǎng)基(Opti-MEM)+2 μg DNA；管2：200 μL Opti-MEM+5 μL DNAfection；混勻，靜置5 min；管1+管2，混勻，靜置25 min；加入N2A細(xì)胞中，次日收集細(xì)胞。轉(zhuǎn)染細(xì)胞活力通過(guò)細(xì)胞免疫熒光或DAPI染色確定。

1.2.2 RNA提取 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染24 h后，收集細(xì)胞，RNA提取試劑盒提取RNA：6孔板每孔加入500 μL裂解液，吹打細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至離心管中，反復(fù)吹打裂解細(xì)胞。向細(xì)胞裂解液中加入200 μL DEPC水，混勻后靜置5 min，12 000×g室溫離心、15 min，轉(zhuǎn)移水相至新的離心管，加入等量異丙醇抽提RNA，混勻后靜置10 min，12 000×g室溫離心、10 min，棄上清液，加入75%乙醇清洗沉淀，8 000×g室溫離心、5 min，棄上清液并晾干，加入20 μL DEPC水溶解沉淀。

1.2.3 RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA 向RNA沉淀中加入20 μL DEPC水，測(cè)試濃度后，按照cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1.2.4 qRT-PCR檢測(cè)APP、PGC-1α和OPA1的mRNA水平 取200 ng cDNA以20 μL體系進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)，以β-肌動(dòng)蛋白的mRNA作為內(nèi)參對(duì)照，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃ 變性15 s，58 ℃ 退火15 s，72 ℃ 延伸30 s，共40個(gè)擴(kuò)增循環(huán)。qRT-PCR引物：APP上游5′-TGAATGTGCAGAATGGAAAGTG-3′，下游5′-AACTAGGCAACGGTAAGGAATC-3′；PGC-1α上游5′-GGATATACTTTACGCAGGTCGA-3′，下游5′-CGTCTGAGTTGGTATCTAGGTC-3′；OPA1上游5′-CTTACATGCAGAATCCTAACGC-3′，下游5′-CCAAGTCTGTAACAATACTGCG-3′。

1.2.5 腦區(qū)定點(diǎn)微注射AAV-PGC1α 將APP/PS1小鼠麻醉后固定于腦立體定位儀上，使用微量注射器向側(cè)頂葉聯(lián)合皮層(lateral parietal association cortex, LPtA)(前囟點(diǎn)-1.94 mm，側(cè)面±1.5 mm，深度-1.0 mm)注射0.5 μL腺相關(guān)病毒(pAAV-MCS-PGC1α-m-FLAG-HA或pAAV-MCS-FLAG-control)。

1.2.6 蘇木素-伊紅染色觀察注射位點(diǎn) 小鼠灌注取腦，經(jīng)4%多聚甲醛固定過(guò)夜后脫水，包埋，切片。石蠟切片脫蠟至水處理，放于蘇木素染液中染色5～10 min，用1%鹽酸乙醇溶液分化數(shù)秒，伊紅染液染色1～3 min，染色后的切片脫水透明后，中性樹(shù)脂封片。

1.2.7 免疫熒光染色檢測(cè)Aβ和PGC-1α陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目 小鼠灌注取腦后石蠟切片，石蠟切片二甲苯脫蠟，梯度乙醇復(fù)水，將切片置于檸檬酸鹽抗原修復(fù)液中微波輻射抗原修復(fù)，0.3% TritonX-100穿透細(xì)胞30 min，5% BSA+5% 山羊血清封閉90 min，Aβ抗體(1 ∶1 000)和PGC-1α抗體(1 ∶1 000)4 ℃孵育過(guò)夜，熒光二抗室溫孵育90 min，DAPI核染10 min，封片。

1.2.8 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)OPA1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目 小鼠灌注取腦后，石蠟包埋、切片，石蠟切片脫蠟與復(fù)水，將切片放入3%過(guò)氧化氫溶液中孵育10 min以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的干擾，抗原修復(fù)、穿透細(xì)胞、封閉相關(guān)步驟同方法“1.2.7”，4 ℃過(guò)夜孵育OPA1抗體(1 ∶1 000)、二抗室溫孵育30 min，滴加DAB顯色，梯度乙醇脫水，中性樹(shù)脂封片。

1.2.9 透射電鏡觀察線粒體形態(tài) 小鼠灌注取腦后，取腦組織浸于固定液中4 ℃固定24 h，乙醇梯度脫水后包埋。樣品在LEICA EM UC7型超薄切片機(jī)中切片，切片經(jīng)檸檬酸鉛溶液和醋酸雙氧鈾50%乙醇飽和溶液各染色5～10 min，晾干后透射電鏡觀察。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果

2.1 AD小鼠模型及N2A細(xì)胞模型PGC-1α表達(dá)及轉(zhuǎn)錄水平降低

以6月齡APP/PS1小鼠作為AD體內(nèi)模型。通過(guò)免疫熒光染色檢測(cè)AD模型小鼠LPtA腦區(qū)Aβ沉積和PGC-1α蛋白的表達(dá)，與WT小鼠相比，APP/PS1小鼠LPtA腦區(qū)Aβ沉積顯著增加(t=9.71，P<0.01)，驗(yàn)證了模型的有效性。值得注意的是，AD小鼠LPtA腦區(qū)PGC-1α的表達(dá)顯著下調(diào)(t=9.28，P<0.01)。N2A細(xì)胞系脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染APPswe構(gòu)建AD體外模型，qRT-PCR檢測(cè)AD組PGC-1α的轉(zhuǎn)錄水平，與對(duì)照組相比，AD模型組APP轉(zhuǎn)錄水平的增加(t=4.92，P<0.01)伴隨著PGC-1α轉(zhuǎn)錄水平的下降(t=8.54，P<0.01)。見(jiàn)圖1。

A-B：體內(nèi)水平評(píng)價(jià)WT及APP/PS1小鼠LPtA腦區(qū)Aβ的表達(dá)和定量；C-D：體內(nèi)水平評(píng)價(jià)WT及APP/PS1小鼠LPtA腦區(qū)PGC-1α的表達(dá)和定量;E-F：N2A細(xì)胞系脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染PCDNA對(duì)照質(zhì)?；駻PPswe質(zhì)粒，體外水平評(píng)價(jià)對(duì)照組及N2A細(xì)胞模型組APP mRNA及PGC-1α mRNA的相對(duì)表達(dá)(圖B的定量面積為1.35 mm2，圖C的定量面積為0.1 mm2，比例尺=100 μm，n=6)

2.2 AD小鼠模型及N2A細(xì)胞模型OPA1表達(dá)及轉(zhuǎn)錄水平的降低

以AD模型小鼠為研究對(duì)象，通過(guò)免疫組化評(píng)價(jià)OPA1的表達(dá)水平，與WT對(duì)照組相比，APP/PS1小鼠LPtA腦區(qū)OPA1表達(dá)降低(t=6.49，P<0.01)。N2A細(xì)胞系轉(zhuǎn)染APPswe構(gòu)建AD體外細(xì)胞模型，qRT-PCR證實(shí)mutAPP引起OPA1轉(zhuǎn)錄水平降低(t=3.28，P<0.01)。見(jiàn)圖2。

A-B：體內(nèi)水平評(píng)價(jià)WT及APP/PS1小鼠LPtA腦區(qū)OPA1的免疫組化和定量分析；C：N2A細(xì)胞系脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染PCDNA質(zhì)粒或APPswe質(zhì)粒。體外水平評(píng)價(jià)對(duì)照組及N2A細(xì)胞模型組OPA1 mRNA的相對(duì)表達(dá)(圖B的定量面積為0.03 mm2，比例尺=100 μm，n=6)

2.3 AD模型小鼠線粒體形態(tài)異常

透射電鏡觀察顯示，與WT對(duì)照組相比，APP/PS1小鼠LPtA腦區(qū)神經(jīng)元線粒體形態(tài)受損，內(nèi)膜損傷的線粒體數(shù)目顯著增多(t=6.29，P<0.01)。見(jiàn)圖3。

A：體內(nèi)水平評(píng)價(jià)WT及APP/PS1小鼠LPtA腦區(qū)神經(jīng)元線粒體形態(tài)學(xué)改變(透射電鏡)；B：內(nèi)膜損傷的線粒體數(shù)量百分比(比例尺=200 nm，n=6)

2.4 PGC-1α抑制了AD時(shí)Aβ的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)

利用腦區(qū)定點(diǎn)微注射及AAV介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)(pAAV-MCS-PGC1α-m-FLAG-HA)，誘導(dǎo)PGC-1α在AD模型鼠LPtA過(guò)表達(dá)，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，HE染色確認(rèn)灌注位點(diǎn)是否正確，若偏離注射位點(diǎn)，則該樣本的相關(guān)數(shù)據(jù)將被剔除。

利用免疫熒光技術(shù)驗(yàn)證AD模型組及PGC-1α過(guò)表達(dá)組小鼠LPtA Aβ沉積及PGC-1α的表達(dá)情況。與AD模型組相比，PGC-1α在AD模型鼠LPtA成功過(guò)表達(dá)(t=5.49,P<0.01)，且PGC-1α顯著降低了AD模型小鼠LPtA的Aβ沉積(t=4.62，P<0.01)。

N2A細(xì)胞系共轉(zhuǎn)APPswe和PECMV/PGC-1α質(zhì)粒，qRT-PCR檢測(cè)兩組APP和PGC-1α的轉(zhuǎn)錄水平， PGC-1α轉(zhuǎn)錄水平明顯增加(t=7.25，P<0.01)，與N2A細(xì)胞模型組相比，PGC-1α顯著降低了N2A細(xì)胞模型組Aβ的轉(zhuǎn)錄水平(t=9.52，P<0.01)。見(jiàn)圖4。

A：小鼠大腦冠狀切片蘇木素-伊紅染色圖；B-C：體內(nèi)水平確定PGC-1α在APP/PS1小鼠LPtA腦區(qū)過(guò)表達(dá)；D-E：體內(nèi)水平評(píng)價(jià)PGC-1α過(guò)表達(dá)對(duì)APP/PS1小鼠LPtA腦區(qū)Aβ沉積的影響；F-G：N2A細(xì)胞系共轉(zhuǎn)APPswe和PECMV/PGC-1α質(zhì)粒，qRT-PCR確認(rèn)PGC-1α mRNA的相對(duì)表達(dá)，體外水平評(píng)價(jià)PGC-1α對(duì)Aβ mRNA水平的影響(圖C的定量面積為0.1 mm2，圖D的定量面積為1.35 mm2，比例尺=100 μm，n=6)

2.5 PGC-1α改善了AD發(fā)生時(shí)OPA1水平的降低

免疫組化驗(yàn)證PGC-1α過(guò)表達(dá)對(duì)AD小鼠模型LPtA腦區(qū)OPA1表達(dá)的影響，與對(duì)照組(APP/PS1+Vector)相比，PGC-1α過(guò)表達(dá)顯著增加了AD模型小鼠(APP/PS1+PGC-1α)LPtA腦區(qū)OPA1的表達(dá)(t=4.09，P<0.01)。N2A細(xì)胞系共轉(zhuǎn)APPswe和PECMV/PGC-1α質(zhì)粒，qRT-PCR檢測(cè)OPA1的轉(zhuǎn)錄水平，與對(duì)照組(APPswe+PECMV)相比，PGC-1α表達(dá)顯著增加了N2A細(xì)胞模型組(APPswe+PGC-1α)OPA1的轉(zhuǎn)錄水平(t=4.86，P<0.01)。見(jiàn)圖5。

A-B：體內(nèi)水平評(píng)價(jià)PGC-1α過(guò)表達(dá)對(duì)APP/PS1小鼠LPtA腦區(qū)OPA1表達(dá)的影響；C：N2A細(xì)胞系共轉(zhuǎn)APPswe和PECMV/PGC-1α質(zhì)粒，qRT-PCR評(píng)價(jià)PGC-1α對(duì)OPA1 mRNA水平的影響(圖B的定量面積為0.03 mm2，比例尺=100 μm，n=6)

2.6 PGC-1α改善了AD發(fā)生時(shí)線粒體的損傷

透射電鏡檢測(cè)PGC-1α過(guò)表達(dá)對(duì)AD模型小鼠LPtA腦區(qū)神經(jīng)元線粒體形態(tài)的影響，與AD模型組小鼠相比，PGC-1α過(guò)表達(dá)顯著改善了AD小鼠LPtA神經(jīng)元線粒體內(nèi)膜的損傷，線粒體內(nèi)膜的完整性增加(t=5.72，P<0.01)。見(jiàn)圖6。

A：體內(nèi)水平評(píng)價(jià)PGC-1α過(guò)表達(dá)對(duì)APP/PS1小鼠LPtA腦區(qū)神經(jīng)元線粒體形態(tài)的影響(透射電鏡)；B：內(nèi)膜損傷的線粒體百分比的量化(比例尺=200 nm，n=6)

3 討論

近年來(lái)，線粒體的動(dòng)力學(xué)改變成為神經(jīng)生物學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。線粒體通過(guò)快速和可逆的分裂、融合過(guò)程，可完成從小圓形細(xì)胞器到巨大管狀結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變，OPA1主要定位于線粒體內(nèi)膜上控制內(nèi)膜的融合。線粒體內(nèi)膜的邊界膜和線粒體嵴的交界部分會(huì)形成一個(gè)結(jié)構(gòu)—嵴連接[20]。線粒體嵴上錨定著大量的與細(xì)胞氧化磷酸化和ATP生成相關(guān)的重要蛋白，包括呼吸鏈復(fù)合物和ATP合成酶。OPA1通過(guò)形成聚合體來(lái)加強(qiáng)嵴連接點(diǎn)的強(qiáng)度，增加呼吸鏈復(fù)合物的穩(wěn)定性，從而促進(jìn)線粒體的氧化呼吸效率[21-23]。

越來(lái)越多的證據(jù)顯示AD的發(fā)生與神經(jīng)元線粒體動(dòng)力學(xué)異常(融合、分裂失衡)密切相關(guān)。AD患者腦組織解剖學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，其海馬神經(jīng)元線粒體數(shù)目明顯減少，并伴隨著線粒體結(jié)構(gòu)破壞，如線粒體嵴斷裂、內(nèi)部結(jié)構(gòu)丟失及出現(xiàn)短棒狀線粒體[8]。體外研究也證實(shí)轉(zhuǎn)染了APP質(zhì)粒的M17細(xì)胞出現(xiàn)大量定位于細(xì)胞核的碎片化的線粒體，上述線粒體形態(tài)及分布的異常伴隨著線粒體融合及分裂蛋白表達(dá)的變化[24]。

PGC-1α作為PPARγ轉(zhuǎn)錄共激活因子在線粒體生物發(fā)生、線粒體質(zhì)量控制和能量代謝的過(guò)程中起到關(guān)鍵作用。許多神經(jīng)生物學(xué)疾病的發(fā)生都與其腦組織PGC-1α表達(dá)下調(diào)、抗氧化酶減少及活性氧誘導(dǎo)的線粒體功能障礙密切相關(guān)。如帕金森氏綜合征的尸檢報(bào)告顯示患者黑質(zhì)腦區(qū)PGC-1α顯著下調(diào)，同時(shí)伴隨線粒體融合蛋白表達(dá)的降低[19]。本課題組前期通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)AD的發(fā)生伴隨著PGC-1α表達(dá)水平的降低及氧化應(yīng)激產(chǎn)物—DNA損傷標(biāo)志物8-羥基脫氧鳥(niǎo)苷增加[25]。然而，PGC-1α能否改善AD神經(jīng)元線粒體動(dòng)力學(xué)異常及其潛在的機(jī)制尚不清楚。

本研究通過(guò)體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)首先評(píng)價(jià)了AD發(fā)生時(shí)PGC-1α、OPA1的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)水平。結(jié)果表明，無(wú)論在AD動(dòng)物模型或APPswe轉(zhuǎn)染構(gòu)建的N2A細(xì)胞模型中，PGC-1α、OPA1轉(zhuǎn)錄及表達(dá)水平均明顯下降。進(jìn)一步利用透射電鏡觀察了線粒體形態(tài)變化，與Calkins課題組的研究結(jié)果一致[8]，APP/PS1小鼠的側(cè)頂葉聯(lián)合皮層神經(jīng)元線粒體的內(nèi)膜溶解、破壞，并伴隨線粒體的嵴斷裂。盡管研究證實(shí)AD時(shí)神經(jīng)元線粒體形態(tài)的改變與PGC-1α及OPA1表達(dá)下調(diào)有關(guān)，然而PGC-1α能否改善AD的發(fā)生，是否通過(guò)調(diào)控線粒體的融合發(fā)揮作用還有待進(jìn)一步探索。

利用6月齡APP/PS1小鼠作為研究對(duì)象，通過(guò)腦區(qū)定點(diǎn)微注射pAAV-MCS-PGC1α-m-FLAG-HA腺相關(guān)病毒成功誘導(dǎo)PGC-1α在AD小鼠側(cè)頂葉聯(lián)合皮層過(guò)表達(dá)。PGC-1α過(guò)表達(dá)可以顯著降低AD所伴隨的Aβ沉積。值得注意的是，PGC-1α顯著增加了AD組OPA1的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平，并且改善了AD所伴隨的線粒體的嵴斷裂和內(nèi)膜結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明，PGC-1α很可能通過(guò)調(diào)控線粒體的內(nèi)膜融合蛋白OPA1的表達(dá)，抑制線粒體形態(tài)的損傷，從而達(dá)到改善AD的目的。

此外，本研究以N2A細(xì)胞系為研究對(duì)象，脂質(zhì)體法共轉(zhuǎn)APPswe和PECMV/PGC-1α質(zhì)粒，qRT-PCR評(píng)價(jià)了PGC-1α過(guò)表達(dá)對(duì)N2A細(xì)胞模型中PGC-1α、OPA1及Aβ轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控，與體內(nèi)結(jié)果一致，PGC-1α顯著抑制了APPswe轉(zhuǎn)染組Aβ的轉(zhuǎn)錄，該結(jié)果伴隨著OPA1轉(zhuǎn)錄水平的增加。PGC-1α抑制AD神經(jīng)元線粒體形態(tài)的損傷及改善Aβ病理學(xué)沉積與其增加OPA1的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)水平密切相關(guān)。

OPA1的表達(dá)經(jīng)過(guò)選擇性剪接和蛋白水解過(guò)程，產(chǎn)生多種變體形式，包括線粒體內(nèi)膜錨定的長(zhǎng)鏈OPA1(long OPA1, L-OPA1)和可溶性短鏈OPA1(short OPA1, S-OPA1)。研究發(fā)現(xiàn)，L-OPA1不僅可以維持嵴的緊密性，對(duì)線粒體融合能力的維持也是不可或缺的[21，26]，而S-OPA1是否可以參與線粒體融合，存在爭(zhēng)議[10，21]。有研究證明，S-OPA1在線粒體融合中的作用很小，但可以獨(dú)立于L-OPA1維持呼吸功能，在能量維持中發(fā)揮作用[27]，支持嵴的形成，維持嵴的緊密性[28]。這些研究表明，OPA1對(duì)嵴的維持作用獨(dú)立于線粒體融合的調(diào)控。本研究發(fā)現(xiàn)AD的發(fā)生伴隨著OPA1表達(dá)降低和線粒體嵴的損傷，而PGC-1α可以改善此現(xiàn)象。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，L-OPA1既可以維持嵴的結(jié)構(gòu)，又可以參與線粒體融合，而S-OPA1對(duì)線粒體嵴的維持獨(dú)立于線粒體融合的作用。PGC-1α調(diào)控OPA1的具體機(jī)制以及在AD中對(duì)L-OPA1和S-OPA1的調(diào)控，有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，AD的發(fā)生伴隨PGC-1α和OPA1的轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)水平下降。PGC-1α通過(guò)調(diào)控OPA1的表達(dá)，改善AD所伴隨的線粒體內(nèi)膜損傷。PGC-1α很可能為AD的潛在調(diào)控位點(diǎn)，當(dāng)前的研究對(duì)AD的機(jī)制探索及靶向藥物研發(fā)具有重要價(jià)值。PGC-1α對(duì)線粒體AD融合調(diào)控的分子生物學(xué)機(jī)制有待進(jìn)一步研究。