盧珍紅, 武 歡, 焦元辰, 張永艷, 李紳崇, 楊春梅, 程春振

(1.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究所，云南 昆明 650100；2.玉溪云星生物科技有限公司，云南 玉溪 652604；3.福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院，福建 福州 350002；4.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，山西 晉中 030801)

過氧化氫酶(catalase, CAT)又稱觸酶，可將組織中過多的H2O2歧化為H2O和O2，減少過氧化導(dǎo)致的細(xì)胞損傷[1].CAT與超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、抗壞血酸酶(APX)一起被稱為抗氧化酶保護(hù)系統(tǒng).在植物中，抗氧化酶共同作用以維持氧化還原穩(wěn)態(tài)[2].根據(jù)基因結(jié)構(gòu)和序列特征，CAT可分為典型性CAT(單功能CAT)、非典型性CAT(錳CAT)和CAT-POD(雙功能CAT)3種類型[3].根據(jù)卟啉結(jié)構(gòu)所含金屬離子的不同，又可分為鐵卟啉酶(包括典型性CAT、CAT-POD)和錳CAT(非典型性CAT，含有錳離子活性位點(diǎn))兩類[4-5].此外，Willekens et al[6]基于煙草CAT基因的表達(dá)特征將其分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類.其中，Ⅰ類CAT在光合組織中強(qiáng)烈表達(dá)；Ⅱ類CAT在維管組織中表達(dá)最高；Ⅲ類CAT在種子和幼苗中顯著表達(dá).

植物CAT主要位于過氧化物酶體、乙醛酸酶體和細(xì)胞質(zhì)中.它通常由一個(gè)小基因家族編碼[7-8]，擬南芥[9]和煙草[10]均含有3個(gè)CAT基因成員，玉米有2個(gè)CAT基因成員[11]，棉花有7個(gè)CAT基因成員[12].CAT在植物防御應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞氧化還原平衡和延緩衰老等方面發(fā)揮著重要作用，其表達(dá)具有一定的時(shí)空特異性[13-15].此外，眾多研究表明，CAT基因在植物響應(yīng)逆境脅迫，如鹽脅迫[16]、干旱脅迫[17-18]、低溫脅迫[8,16]及抗病[19-21]等過程中發(fā)揮著重要作用.

非洲菊(Gerberajamesonii)是世界五大鮮切花之一，同時(shí)也是研究復(fù)雜花序發(fā)育與進(jìn)化的模式植物[22].在鹽脅迫、干旱和寒冷等逆境下，非洲菊的生長(zhǎng)及產(chǎn)量會(huì)受到嚴(yán)重抑制[23].根腐病是非洲菊的主要病害，可由隱地疫霉單獨(dú)引起[24]，現(xiàn)已成為制約非洲菊產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的重大難題.鑒于CAT基因在植物抗逆防御過程中的重要作用，本研究基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)克隆了一個(gè)非洲菊CAT基因，分析了其核苷酸和編碼蛋白序列特征，并檢測(cè)其在鹽脅迫、干旱脅迫、低溫脅迫處理以及接種根腐病病菌隱地疫霉后的表達(dá)水平，旨在為揭示該基因的功能及其在非洲菊抗逆育種中的應(yīng)用提供參考.

1 材料與方法

1.1 材料處理

試驗(yàn)材料‘玲瓏’非洲菊由云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究所提供.選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的盛花期植株的花莖、花蕾、葉柄和葉片用于總RNA的提取.選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好、株高約為10 cm的幼苗進(jìn)行逆境處理.其中，鹽脅迫(200 mmol·L-1NaCl)、聚乙二醇(polyethylene glycol， PEG)模擬干旱脅迫(30% PEG)和4 ℃低溫處理參照武歡等[25]和王星淇等[26]的方法，于處理0、4、8、12、24 h取葉；隱地疫霉接種參照郝向陽(yáng)等[27]的方法，于處理0、2、4、6 d取根.所有樣品均設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)，取樣后立即置于液氮中速凍，之后置于冰箱(-80 ℃)中保存?zhèn)溆?

1.2 RNA提取及cDNA合成

利用Trizol RNA提取試劑盒[寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司]提取非洲菊總RNA.采用Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒[賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司]以oligo(dT)18作為反轉(zhuǎn)錄引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，用于基因全長(zhǎng)克隆.qRT-PCR檢測(cè)所用不同處理的樣品cDNA使用TransScript All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR(One-Step gDNA Removel)試劑盒(全式金生物技術(shù)有限公司)以oligo(dT)18和隨機(jī)引物作為反轉(zhuǎn)錄引物合成.

1.3 CAT基因克隆及測(cè)序驗(yàn)證

從非洲菊轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選獲得了一條具有完整開放閱讀框(ORF)的CAT基因序列(GenBank登錄號(hào)：MH708533)[28]，設(shè)計(jì)基因特異性引物(上游引物：TACATCAAGATCATGGAT；下游引物：TTCAATAGTTGGGGCGCAC)用于基因全長(zhǎng)克隆.PCR反應(yīng)體系(25 μL)包括12.5 μL Dream TaqTMGreen PCR Master Mix(2×)、9.5 μL ddH2O、1 μL cDNA、上下游引物各1 μL.PCR 擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，34個(gè)循環(huán)；最后于72 ℃延伸10 min.所得PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后采用Gel/PCR Extraction Kit試劑盒回收目的片段，連接PMD18-T載體后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)，選取菌液PCR鑒定為陽(yáng)性的克隆子送至福州鉑尚生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證.

1.4 生物信息學(xué)分析

參照郝向陽(yáng)等[24]的方法，利用在線軟件分析非洲菊CAT2蛋白的基本理化性質(zhì)、亞細(xì)胞定位、信號(hào)肽、跨膜結(jié)構(gòu)、磷酸化位點(diǎn)和保守結(jié)構(gòu)域.利用在線工具PSIPERD(http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)和PHYRE2(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/)分別對(duì)蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析.從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索并下載其他物種CAT的氨基酸序列，使用MEGA-X中的ClustalW程序進(jìn)行多序列比對(duì).采用最大似然法(ML)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹.選擇LG模式，執(zhí)行參數(shù)為完全刪除和1 000次重復(fù).

1.5 非洲菊CAT基因表達(dá)水平的qRT-PCR檢測(cè)

以非洲菊18S rRNA為內(nèi)參基因進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè).以稀釋5倍的cDNA為模板，采用Roche Lighcycler 480熒光定量PCR儀進(jìn)行相對(duì)表達(dá)水平的檢測(cè).qRT-PCR擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共50個(gè)循環(huán).qRT-PCR反應(yīng)體系：10 μL SYBR Premix Ex TaqTM熒光染料[寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司]、7.4 μL ddH2O、上下游引物(上游引物:CATTCTGGCTTGACGACA；下游引物:TGGCGTGGCTGTGATTAG)各0.8 μL、1 μL模板.使用2-ΔΔCT法計(jì)算CAT2基因在不同處理下的相對(duì)表達(dá)量.利用SPSS軟件分析不同樣品在1%水平上的差異顯著性，并使用GraphPad Prism 8.0.2軟件作圖.

2 結(jié)果與分析

2.1 CAT基因的克隆及序列

M：DL5000 marker.圖1 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測(cè)圖譜Fig.1 Electrophoresis gel of amplified products

成功地從“玲瓏”非洲菊中克隆獲得了一條1 490 bp的基因序列(圖1).序列分析顯示，該基因編碼序列(coding sequence， CDS)的長(zhǎng)度為1 479 bp，預(yù)測(cè)可編碼492個(gè)氨基酸.Blastn比對(duì)結(jié)果顯示，該基因與刺苞菜薊(Cynaracardunculus)CAT2基因(XM_025133682.1)的相似度最高，為88.00%，故將其命名為GjCAT2.

2.2 GjCAT2編碼蛋白的基本理化性質(zhì)

蛋白理化性質(zhì)分析顯示，GjCAT2編碼蛋白的分子質(zhì)量為56.854 ku，分子式為C2558H3874N714O734S15，原子總數(shù)為7 895，等電點(diǎn)為6.5，脂肪系數(shù)為71.73，為穩(wěn)定親水蛋白.該蛋白由20種氨基酸組成，以天冬氨酸占比最高，約占7.3%，含有61個(gè)帶正電荷殘基(精氨酸+賴氨酸)和56個(gè)帶負(fù)電荷殘基(天冬氨酸+谷氨酸).蛋白保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)(圖2)顯示，該蛋白含有典型的CAT保守結(jié)構(gòu)域PLN02609(位于第6～492位)和7個(gè)血紅素結(jié)合位點(diǎn)(65H、104S、138N、143F、151F、344R、348Y)[3]，說(shuō)明其屬于過氧化物酶超家族和KatE超家族[30-31].二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)(圖3A)顯示，該蛋白由26.02% α-螺旋、10.98% β-折疊、43.90%不規(guī)則卷曲和19.11%延伸鏈組成.該蛋白無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)及信號(hào)肽，推測(cè)屬于非分泌性蛋白.磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)顯示，該蛋白僅有4個(gè)磷酸化位點(diǎn)：位于第18位的酪氨酸，第7位的蘇氨酸，第19、23位的絲氨酸.亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)顯示，該蛋白主要定位于過氧化物酶體.保守序列分析顯示，該蛋白具有CAT活性基序(CAM, FHRERIPERIVHARGAS)和CAT血紅素結(jié)合位點(diǎn)(HBS, RVFAYGDAQ)[29].三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)(圖3B)顯示，該蛋白含有4個(gè)亞基，由此進(jìn)一步推測(cè)GjCAT2為典型性CAT[4].

圖2 GjCAT2保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)結(jié)果Fig.2 Predicted conserved domain of GjCAT2

A：二級(jí)結(jié)構(gòu)；B:三級(jí)結(jié)構(gòu).圖3 GjCAT2二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果Fig.3 Predicted secondary and tertiary structures of GjCAT2

2.3 蛋白序列比對(duì)及聚類分析

蛋白序列比對(duì)(圖4)顯示：GjCAT2與刺苞菜薊CAT的同源相似性最高，達(dá)96.95%；與向日葵、薇甘菊CAT的同源相似性分別為95.93%和94.11%.系統(tǒng)進(jìn)化樹共分為兩個(gè)分支：GjCAT2與萵苣、刺苞菜薊、向日葵等菊科植物CAT聚在一支，其他物種CAT聚在另一支(圖5).

紅線標(biāo)識(shí)為CAT活性基序(CAM)和血紅素結(jié)合位點(diǎn)(HBC).圖4 不同植物CAT 蛋白序列多重比對(duì)結(jié)果Fig.4 Multiple alignment of CAT protein sequences from different plants

2.4 GjCAT2基因在非洲菊不同組織器官中及在不同非生物逆境處理下的表達(dá)水平

圖6顯示，GjCAT2基因在非洲菊正常健康植株不同組織器官中的表達(dá)水平存在顯著差異.GjCAT2基因在花莖中的相對(duì)表達(dá)量最高，葉柄次之，葉最低；在花莖中的相對(duì)表達(dá)量顯著高于葉、葉柄和花蕾，分別是葉、葉柄和花蕾的31.82、7.48和10.75倍.

圖5 不同植物CAT系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.5 Phylogenetic tree of CAT proteins from different plants

圖7a顯示，鹽脅迫處理下，GjCAT2基因的表達(dá)量呈“降—升—降—升”的趨勢(shì).GjCAT2基因在處理4 h的表達(dá)受到極顯著抑制；處理8 h的相對(duì)表達(dá)量驟升達(dá)到峰值，為CK的3.48倍；隨后于處理12 h急劇下降至與CK相近；處理24 h再次升高，相對(duì)表達(dá)量約為CK的2.66倍.

圖7b顯示，PEG模擬干旱處理后，GjCAT2基因的表達(dá)量呈“升—降—升”的趨勢(shì).GjCAT2基因在處理4 h的表達(dá)受到誘導(dǎo)；之后顯著下降，并于處理12 h降到最低，相對(duì)表達(dá)量?jī)H為CK的33.12%；處理24 h的相對(duì)表達(dá)量回升，與CK基本持平.

圖7c顯示，4 ℃低溫處理下，GjCAT2基因的表達(dá)在脅迫前期受到顯著誘導(dǎo)，處理8 h的相對(duì)表達(dá)量達(dá)到峰值，為CK的2.31倍；處理12 h的相對(duì)表達(dá)量?jī)H為CK的18.00%；而處理24 h的相對(duì)表達(dá)量又恢復(fù)至與CK相近.

圖7d顯示，接種隱地疫霉后，GjCAT2基因的表達(dá)在處理2和4 d均受到極顯著抑制，但處理6 d的相對(duì)表達(dá)量驟升為CK的3.11倍.

a：鹽脅迫處理；b：PEG模擬干旱處理；c：4 ℃低溫處理；d：隱地疫霉接種處理.圖柱上附不同字母表示差異極顯著(P<0.01).圖7 不同脅迫處理對(duì)GjCAT2基因表達(dá)水平的影響Fig.7 Effect of different stress treatments on relative expression of GjCAT2 gene

3 討論

本研究成功地從‘玲瓏’非洲菊克隆獲得了一個(gè)CAT基因(GjCAT2)，該基因序列與刺苞菜薊CAT2基因的相似度高達(dá)88.00%.其編碼蛋白預(yù)測(cè)定位于過氧化物酶體，具有典型性CAT2保守結(jié)構(gòu)域和血紅素結(jié)合位點(diǎn)，且屬于KatE超家族，推測(cè)該蛋白為典型性CAT.此外，根據(jù)GjCAT2基因在非洲菊不同組織器官中的表達(dá)水平(花莖>葉柄>花蕾>葉)，推測(cè)GjCAT2屬于Ⅱ類CAT.

多數(shù)CAT基因具有明顯的時(shí)空特異性.辣椒CAT基因在莖中的表達(dá)水平顯著高于葉和根，且在果實(shí)發(fā)育早期比成熟期更為豐富[20]；黃瓜CAT2基因則在莖、葉、花和果實(shí)中表現(xiàn)出更高的轉(zhuǎn)錄水平[13]；煙草CAT2基因在花中的表達(dá)量最高[27]；而水稻CATA基因和棉花CAT1～CAT4基因在所有發(fā)育階段都表現(xiàn)出較高的表達(dá)水平[12,32].本研究結(jié)果表明，GjCAT2基因在非洲菊花莖中的表達(dá)量極顯著高于其他組織器官，說(shuō)明其具有Ⅱ類CAT基因的典型表達(dá)模式，在維管組織中的表達(dá)量較高.

CAT是一種重要的活性氧清除酶，在植物生長(zhǎng)、發(fā)育和非生物脅迫響應(yīng)中起著至關(guān)重要的作用[33-34].在鹽脅迫條件下，油菜CAT基因家族成員和黃瓜CAT基因均有不同程度的上調(diào)表達(dá)[35-36]；甘薯在200 mmol·L-1NaCl處理2和11 d時(shí)，幼葉中CAT2基因的表達(dá)量分別比CK上調(diào)了72.74和352.48倍，在膨脹塊根中的表達(dá)量同樣在處理11 d時(shí)達(dá)到最大值[14].本研究結(jié)果表明，GjCAT2基因在NaCl處理4 h時(shí)，其表達(dá)受到極顯著抑制，而在處理8和24 h時(shí)的相對(duì)表達(dá)量又出現(xiàn)了不同程度的上升，分別為CK的3.48和2.66倍，說(shuō)明GjCAT2基因在鹽脅迫下被兩次誘導(dǎo)，進(jìn)而在非洲菊抗鹽反應(yīng)中發(fā)揮作用.

研究表明：水稻CATA和CATC基因的過表達(dá)是通過被耐鹽受體樣細(xì)胞質(zhì)激酶磷酸化和激活，進(jìn)而提高了轉(zhuǎn)基因水稻的耐旱性[37]；甘蔗CAT1基因在25% PEG處理下被顯著誘導(dǎo)[38].本研究結(jié)果表明，GjCAT2基因的表達(dá)在PEG模擬干旱脅迫初期受到顯著誘導(dǎo)，其表達(dá)水平于處理8 h時(shí)達(dá)到峰值，處理12 h時(shí)驟然下降，但處理24 h時(shí)又出現(xiàn)回升，表明GjCAT2基因在非洲菊早期抵御干旱過程中發(fā)揮的作用更大.

大量研究表明，CAT基因的表達(dá)豐度可在脅迫開始時(shí)顯著上調(diào)[8,39-40].13 ℃低溫處理下，水稻CAT活性顯著提高，CATB基因的表達(dá)受到顯著誘導(dǎo)，CAT活性與CATB基因的表達(dá)呈正相關(guān)[41].本研究中，GjCAT2基因的表達(dá)受4 ℃低溫脅迫誘導(dǎo)顯著，其相對(duì)表達(dá)量于處理8 h時(shí)達(dá)到峰值，為CK的2.31倍，暗示著GjCAT2基因參與非洲菊早期低溫應(yīng)答.

CAT在植物抗病過程中也發(fā)揮著重要作用.棉花在受大麗花弧菌感染后，CAT基因家族均受顯著誘導(dǎo)[12]；煙草在接種煙草病原菌后，瞬時(shí)過表達(dá)CAT2基因的葉片表現(xiàn)出較輕的病狀[19]；而擬南芥CAT2敲除突變體中含更多的H2O2，表明CAT2是清除活性氧的關(guān)鍵酶之一.本研究中，接種隱地疫霉早期(2、4 d)，GjCAT2基因的表達(dá)受到極顯著抑制，處理6 d的相對(duì)表達(dá)量顯著升高，為CK的3.11倍.GjCAT2基因的表達(dá)在感病前期被顯著抑制可能與病原菌侵染有關(guān)，表達(dá)量在接種隱地疫霉6 d后才開始上調(diào)，說(shuō)明此時(shí)非洲菊根系已經(jīng)受到顯著的氧化脅迫.GjCAT2基因表達(dá)量的增加有助于清除由病原菌刺激產(chǎn)生的H2O2，在抵御根腐病過程中發(fā)揮著重要作用.

4 結(jié)論

本研究成功地從‘玲瓏’非洲菊克隆獲得了一個(gè)CDS長(zhǎng)度為1 479 bp的GjCAT2基因，其編碼蛋白具有典型性CAT保守結(jié)構(gòu)域和血紅素結(jié)合位點(diǎn)，是屬于KatE超家族的典型性CAT.根據(jù)GjCAT2基因在花莖中高水平的表達(dá)特征，推測(cè)其屬于Ⅱ類CAT基因.此外，GjCAT2基因的表達(dá)受鹽脅迫、干旱、低溫和隱地疫霉的影響顯著，推測(cè)其可能在非洲菊抵御這些逆境中扮演著重要角色.