馬嘉楠, 楊穎麗

(西北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，甘肅 蘭州 730000)

菌根是真菌與植物根系形成的共生體，一般分為外生菌根和內(nèi)生菌根.菌根在陸地植物營養(yǎng)器官中普遍存在.世界上約95%的維管束植物屬于典型的菌根家族植物[1]，雖然只有約3%的種子植物能夠與外生菌根真菌建立起菌根共生體系，但這些植物種類是溫帶、寒帶和部分熱帶地區(qū)森林和林地的主要樹種[2].外生菌根真菌在溫帶和北方森林生態(tài)系統(tǒng)中占主導(dǎo)地位[3]，其能與植物根部形成菌根共生結(jié)構(gòu)，即菌根的菌絲一部分連接植物根系而另一部分延伸到土壤中，增強(qiáng)宿主植物對土壤中水分和營養(yǎng)元素(特別是氮、磷)的吸收、利用，促進(jìn)植物生長并增強(qiáng)植物的抗逆性[4-5].有關(guān)外生菌根共生體建立過程的研究較少[6]，在擔(dān)子菌中，雙色蠟?zāi)?Laccariabicolor)—毛果楊(Populustrichocarpa)[7]、松乳菇(Lactariusdeliciosus)—草莓樹(Arbutusunedo)[8]、黑孢塊菌(Tubermelanosporum)—冬青櫟(Quercusilex)幼苗[9]等幾種外生菌根的共生建立過程目前均有較多研究.對外生菌根的培養(yǎng)方法如溫室土培[10]和盆栽土培[11]有見報(bào)道.Souza et al[12]以泥炭—蛭石混合物作為基質(zhì)培養(yǎng)桉樹外生菌根，而Vuorinen et al[13]在硅基固態(tài)培養(yǎng)基中培養(yǎng)真菌菌絲.隨著菌根真菌與宿主植物互作的分子機(jī)制等研究工作的不斷深入，建立不同外生菌根真菌與宿主植物形成外生菌根的無菌實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ鸵诧@得更為迫切.

雙色蠟?zāi)儆趽?dān)子菌亞門(Basidiomycotina)軸腹菌科(Hydnangiaceae)蠟?zāi)?Laccaria)，通過定殖于植物根部[14]，形成菌根菌絲網(wǎng)絡(luò)能提高植物的抗病性和抗逆性[15].楊樹廣泛分布于歐、亞和北美地區(qū)，具有生長快、產(chǎn)量高、易擴(kuò)繁與適應(yīng)性強(qiáng)等特性，多數(shù)種類具有較強(qiáng)的適應(yīng)性[16].目前雙色蠟?zāi)⑴c毛果楊都已完成基因組測序[17-18]，因此毛果楊-雙色蠟?zāi)⒐采w系成為研究林木外生菌根發(fā)育分子機(jī)制的理想模型.本研究以毛果楊和雙色蠟?zāi)楣┰嚥牧?，以石英砂為基質(zhì)體外培養(yǎng)外生菌根，從形態(tài)學(xué)方面鑒定外生菌根，并研究了外生菌根真菌對共生植物的影響，旨在為外生菌根真菌與植物相互的分子機(jī)制研究提供參考.

1 材料與方法

1.1 供試材料

真菌菌株雙色蠟?zāi)⒑兔麠罱M培幼苗，由法國農(nóng)業(yè)科學(xué)院Francis Martin院士惠贈.

1.2 方法

1.2.1 雙色蠟?zāi)⒌呐囵B(yǎng) 雙色蠟?zāi)⒌木z體在固體培養(yǎng)基[Thiamine 0.05 g·L-1，CaCl20.05 g·L-1，NaCl 0.025 g·L-1，KH2PO40.5 g·L-1，MgSO4·7H2O 0.15 g·L-1，(NH4)2HPO40.25 g·L-1，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.001 g·L-1，葡萄糖10 g·L-1，麥芽糖提取物3 g·L-1，酵母提取物0.5 g·L-1]上培養(yǎng)，pH為5.8.25 ℃下暗培養(yǎng)7 d后轉(zhuǎn)接到200 mL的MMN液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d，溫度25 ℃，轉(zhuǎn)速200 r·min-1.培養(yǎng)好的菌絲用三層紗布過濾后備用.

1.2.2 毛果楊幼苗的培養(yǎng) 毛果楊幼苗在培養(yǎng)瓶中生長3～4周后，剪掉多余葉片，并剪切為2～3 cm長的莖段，在生根培養(yǎng)基(2%蔗糖+1 mg·L-1吲哚丁酸IBA)中培養(yǎng)2～3周后備用.培養(yǎng)條件為：光周期16 h(白天)，暗周期8 h(夜晚)；溫度為25 ℃(白天)和18 ℃(夜晚)，相對濕度為50%～60%，光照度為14 000 lx.

1.2.3 毛果楊根部接種雙色蠟?zāi)?培養(yǎng)瓶中裝入150 g石英砂，在25 mL培養(yǎng)液(Thiamine 0.05 g·L-1,CaCl20.05 g·L-1,NaCl 0.025 g·L-1,KH2PO40.5 g·L-1,MgSO4·7H2O 0.15 g·L-1,(NH4)2HPO40.25 g·L-1,FeSO4·7H2O 0.001 g·L-1,葡萄糖1 g·L-1)中培養(yǎng)，pH為5.8.121 ℃滅菌20 min，備用.將3.5 g培養(yǎng)好的菌絲接種到楊樹幼苗根部，置于裝有石英砂的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)3周.培養(yǎng)條件：光周期16 h(白天)，暗周期8 h(夜晚)，溫度23 ℃(白天)，光照度14 000 lx.對照組為沒有菌絲的共培養(yǎng)培養(yǎng)液，每種處理設(shè)置6組重復(fù)，用于株高和鮮重生物量的測定.

1.2.4 外生菌根切片染色 毛果楊幼苗和雙色蠟?zāi)⒕z共培養(yǎng)3周后，對楊樹幼苗的菌根進(jìn)行觀察分析.新鮮的外生菌根用多聚甲醛固定樣品4 h后，使用PBS溶液清洗3遍；隨后用4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))瓊脂糖進(jìn)行包埋.使用振動切片機(jī)(Leica VT1000 S)制備橫切片(厚度25 μm).用小麥凝集素(WGA染料，終濃度為10 μg·mL-1)和碘化丙啶(PI染料，終濃度為1 μg·mL-1)進(jìn)行染色，染色0.5 h后用PBS溶液清洗3次.利用激光共聚焦顯微鏡(Olympus FV3000)觀察菌根的形態(tài).激發(fā)波長為488、561 nm.

1.2.5 毛果楊株高鮮重的測定 從石英砂中取出楊樹苗，清水洗凈根部殘留的石英砂，使用直尺測量株高；將楊樹苗瀝干水分后，使用精密天平測定其鮮重.

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，使用Origin 2018軟件繪圖.

2 結(jié)果與分析

2.1 毛果楊菌根的形成

楊樹幼苗和雙色蠟?zāi)⒃跓o菌環(huán)境下共培養(yǎng)3周后，形成的外生菌根結(jié)構(gòu)如圖1、2所示.與未接種雙色蠟?zāi)⒌拿麠钣酌缦啾?，接種雙色蠟?zāi)⒌拿麠钣酌缧纬奢^多的側(cè)根和菌根(圖2A).菌根化毛果楊幼苗的主根不明顯，側(cè)根被雙色蠟?zāi)⒕z包裹和纏繞，呈現(xiàn)褐色短小的菌根；非菌根化楊樹的主根較為明顯，側(cè)根較少，呈現(xiàn)乳白色；側(cè)根間有菌絲網(wǎng)和明顯的菌根結(jié)構(gòu)(圖2B、2C).

2.2 毛果楊菌根的結(jié)構(gòu)

圖3A～3D和圖3E～3H分別為20倍與40倍顯微鏡下的菌根切片圖.圖3A、3B為明場下的外生菌根橫切片，內(nèi)部排列致密的為楊樹根細(xì)胞，外部為纏繞的真菌菌絲.由圖3可知外生菌根形態(tài)完整.綠色為外生菌根真菌(圖3B、3F)，紅色為楊樹根細(xì)胞(圖3C、3G)，綠色的菌絲呈現(xiàn)絲狀或空心圓圈狀；楊樹根細(xì)胞普遍為橢圓狀，排列齊整，但最外層細(xì)胞排列較內(nèi)部根細(xì)胞松散，細(xì)胞間有菌絲伸入，有空隙.圖3D、3H分別為488 nm和561 nm的疊加場圖.通過WGA與PI染色，可同時觀察到菌絲圍繞在楊樹根細(xì)胞周圍，在根際周圍形成菌套；部分真菌菌絲進(jìn)入楊樹根細(xì)胞間并在楊樹的表皮和皮質(zhì)細(xì)胞之間形成哈氏網(wǎng)(圖3D、3H).

A.雙色蠟?zāi)⒕zMMN固體培養(yǎng)7 d；B.雙色蠟?zāi)⒕zMMN液體培養(yǎng)7 d；C.在生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)毛果楊幼苗2～3周；D.石英砂加25 mL共培養(yǎng)液體培養(yǎng)基；E.毛果楊幼苗和雙色蠟?zāi)⒕z共培養(yǎng)；F.共培養(yǎng)3周后進(jìn)行檢測.圖1 毛果楊—雙色蠟?zāi)⑼馍捏w外培養(yǎng)體系Fig.1 Ectomycorrhizal culture system of P.trichocarpa -L.bicolor in vitro

A.毛果楊樹根系生長形態(tài)；B.顯微鏡下菌根化毛果楊根形態(tài)；C.顯微鏡下非菌根化毛果楊根形態(tài).圖2 不同處理的毛果楊樹根系生長形態(tài)圖Fig.2 Morphology of P.trichocarpa root with or without L.bicolor inoculation

2.3 菌根化對毛果楊幼苗生長的影響

圖4 不同處理對毛果楊生長狀態(tài)的影響Fig.4 Effect of mycorrhization on the growth of P.trichocarpa

在菌根真菌的作用下，處理組(楊樹與真菌共培養(yǎng))的楊樹幼苗較對照組(未添加真菌的共培養(yǎng))具有更好的生長狀態(tài)(圖4).

共培養(yǎng)3周后發(fā)現(xiàn)，未添加真菌的毛果楊幼苗平均株高為(45.67±8.77) mm，外生菌根真菌共培養(yǎng)的毛果楊平均株高為(53.17±5.56) mm，菌根化的毛果楊幼苗的株高比未添加真菌的毛果楊提高了15.16%(圖5A)；未添加真菌的毛果楊幼苗鮮重為(412.15±59.49) mg，外生菌根真菌共培養(yǎng)的毛果楊鮮重為(620.92±57.43) mg，菌根化的毛果楊幼苗的鮮重比非菌根化毛果楊提高了50.65%(圖5B).單因素方差分析結(jié)果表明，接種外生菌根真菌雙色蠟?zāi)γ麠铛r重有顯著影響(P=0.030)，對株高無顯著影響(P=0.487).

A.楊樹苗株高；B.楊樹苗鮮重.*表示具有顯著性.圖5 不同處理對毛果楊鮮重與株高的影響Fig.5 Effect of mycorrhization on fresh weight and plant height of P.trichocarpa

3 小結(jié)

本研究以石英砂為基質(zhì)，使用模式植物楊樹與模式外生菌根真菌雙色蠟?zāi)⑴囵B(yǎng)外生菌根，并觀察到菌絲進(jìn)入楊樹根細(xì)胞間隙，形成了典型的哈氏網(wǎng)結(jié)構(gòu).通過測量生長3周的毛果楊幼苗的株高與鮮重，發(fā)現(xiàn)添加雙色蠟?zāi)⒌拿麠钣酌绲闹旮吲c鮮重比未添加雙色蠟?zāi)⒌姆謩e增長15.16%與50.65%.表明外生菌根真菌能促進(jìn)楊樹生長，顯著增加楊樹的鮮重.