羅仕園,楊誠(chéng),陳載晗,孫啟航,安建輝,鄧伶俐*,譚林立

1(超輕彈性體材料綠色制造國(guó)家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(湖北民族大學(xué)),湖北 恩施,445000)2(湖北民族大學(xué) 生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,湖北 恩施,445000)3(湖北民族大學(xué) 智能科學(xué)與工程學(xué)院,湖北 恩施,445000)

姜黃素是一種提取于姜科、天南星科植物根莖中的二酮類化合物,作為天然色素廣泛應(yīng)用于食品行業(yè)。已有研究表明姜黃素具有良好的抗氧化性、抑菌性、抗炎性、抗腫瘤、抗病毒等生物活性[1-3]。目前基于姜黃素水溶性差引起的生物利用度低的問題,已有大量研究通過包埋的方式以提升其在食品體系的溶解性[4-5]。靜電紡絲技術(shù)作為一種微納米載運(yùn)體系的制備技術(shù)已被許多研究者應(yīng)用于姜黃素載運(yùn)緩釋,提升其在體內(nèi)和體外的生物利用度[6]。已有研究將姜黃素包埋于各種不同的高分子納米纖維體系中,研究了納米纖維膜物理化學(xué)性質(zhì)的差異,對(duì)其抑菌性、抗氧化性、抗炎效果等進(jìn)行了表征[7-11]。改變納米纖維的組成成分、形態(tài)結(jié)構(gòu)和成分間的交聯(lián)狀態(tài)能夠改變其包埋的姜黃素的釋放行為及功能發(fā)揮,但是交聯(lián)方式對(duì)姜黃素功能特性影響的研究鮮有報(bào)道。

通常天然高分子納米纖維膜的應(yīng)用研究均需要對(duì)其進(jìn)行交聯(lián),可以通過化學(xué)法或者酶法交聯(lián)[12]。最常見的交聯(lián)方式是戊二醛熏蒸,但是研究表明戊二醛殘留具有細(xì)胞毒性?？紤]到交聯(lián)劑的毒性可能對(duì)其后期應(yīng)用在食品行業(yè)或者組織工程有影響,必須選擇更加安全的交聯(lián)方式。雖然前期研究表明由2種或2種以上性質(zhì)不同的高聚物原料混合電紡制備復(fù)合納米纖維可一定程度改善單一組分納米纖維的物化性質(zhì)、功能特性等,但其對(duì)納米纖維膜綜合性能提升效果還不足以將其實(shí)際應(yīng)用。研究表明通過添加葡萄糖誘導(dǎo)的美拉德反應(yīng)能夠提升天然高分子納米纖維膜的綜合性能[13-16]。然而高溫條件進(jìn)行美拉德反應(yīng)會(huì)使得生物活性物質(zhì)不穩(wěn)定[13,17-19],因此本文采用低溫控濕的條件進(jìn)行美拉德反應(yīng)。

雖然靜電紡絲技術(shù)廣泛應(yīng)用于制備納米纖維[20-22],但是基于常規(guī)靜電紡絲設(shè)備制備纖維的產(chǎn)率較低,通常采用的流速僅0.1～2 mL/h,其中高分子濃度通常低于30%,尤其一些多糖類分子濃度通常不高于5%[23-24]。為了提升靜電紡絲效率,本研究采用氣流輔助靜電紡絲技術(shù)制備負(fù)載姜黃素的明膠/玉米醇溶蛋白納米纖維。UM等[25]在2004年首次提出靜電溶吹技術(shù),相較于傳統(tǒng)電紡,能夠提高電紡速率和改善納米纖維性能。氣流輔助靜電紡絲設(shè)備主要由供樣系統(tǒng)、高壓系統(tǒng)、收集系統(tǒng)、供氣系統(tǒng)、噴絲頭組成,相較于傳統(tǒng)電紡系統(tǒng),增添了供氣系統(tǒng),改變了噴絲頭結(jié)構(gòu)。CANBAY-GOKCE等[26]利用熱塑性聚氨酯封裝香菇提取物制備抗菌敷料,溶吹總流量能達(dá)到10.0 mL/h,效率高,成膜性良好,透氣性與抗菌功能良好。

本文旨在通過氣流輔助靜電紡絲技術(shù)制備負(fù)載姜黃素的明膠/玉米醇溶蛋白/葡萄糖納米纖維并研究控溫控濕條件下的美拉德反應(yīng)對(duì)納米纖維微觀形貌、宏觀性質(zhì)和功能特性的影響。通過掃描電子顯微鏡觀察納米纖維微觀形態(tài)變化。通過傅里葉紅外光譜、示差量熱掃描/熱重掃描、X射線衍射研究組分間的分子間相互作用和納米纖維結(jié)晶性的變化。通過水接觸角的測(cè)定分析納米纖維親疏水性的變化。通過抗氧化、抗菌測(cè)試研究美拉德反應(yīng)對(duì)姜黃素納米纖維的生物活性影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米醇溶蛋白,西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司;明膠、姜黃素、DPPH、ABTS、2,4,6-三吡啶基三嗪[2,4,6-tris(2-pyridyl)-s-triazine,TPTZ]、新亞銅試劑,上海阿拉丁試劑有限公司;大腸桿菌ATCC 25922、金黃色葡萄球菌CMCC(B)26003,北京生物保藏中心;葡萄糖、乙酸及其他試劑,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

JDF05靜電紡絲機(jī),長(zhǎng)沙納儀儀器科技有限公司;恒溫恒濕箱、S4800掃描電子顯微鏡,日本日立;iS5傅里葉紅外光譜儀,美國(guó)Nicolet;STA449F3DSC/TG同步熱分析儀,德國(guó)NETZSCHN;X射線衍射儀,荷蘭PA Analytical;視頻接觸角測(cè)試儀,德國(guó)Dataphysics。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 溶液配制

參考前期研究選取明膠和玉米醇溶蛋白質(zhì)量比為1∶1的溶液進(jìn)行靜電紡絲[17],分別稱取1.5 g明膠、1.5 g玉米醇溶蛋白和0.5 g葡萄糖于容器中,加入10 mL體積分?jǐn)?shù)為80%乙酸水溶液后攪拌過夜使其充分溶脹。然后在上述配比基礎(chǔ)上添加相比于蛋白質(zhì)量0.1%、0.5%和1.0%的姜黃素于溶液中。

1.3.2 納米纖維制備

采用氣流輔助法靜電紡絲制備納米纖維(圖1)。將上述溶液轉(zhuǎn)移至10 mL螺口注射器中,設(shè)定進(jìn)料流速為10.0 mL/h,電壓15 kV,針尖接受距離15 cm,輔助氣流流速為400 L/h。將含有相比于蛋白質(zhì)量0%、0.1%、0.5%和1.0%姜黃素的納米纖維分別記為C0、C0.1、C0.5、C1.0。將制備好的納米纖維放入溫度50濕度60%的恒溫恒濕箱中,美拉德反應(yīng)2 d的納米纖維記為C0M2、C0.1M2、C0.5M2、C1.0M2,美拉德反應(yīng)5 d的納米纖維記為C0 M5、C0.1M5、C0.5 M5、C1.0 M5。

圖1 氣流輔助靜電紡絲設(shè)備示意圖Fig.1 The illustration of the air-assisted electrospinning set up

1.3.3 納米纖維膜表征

剪取納米纖維膜,經(jīng)真空噴金處理后,于掃描電子顯微鏡上觀察納米纖維的微觀形貌。使用軟件Nano Measure從納米纖維的掃描電子顯微鏡圖中隨機(jī)選取40根纖維,對(duì)其直徑進(jìn)行統(tǒng)計(jì),根據(jù)所得數(shù)據(jù)擬合得出纖維平均直徑并計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差。

采用傅里葉變換衰減全反射法進(jìn)行紅外光譜掃描,掃描范圍為4 000～600 cm-1,分辨率為2 cm-1,累加32次,以空氣為背景,每次掃描前扣除背景。

利用梅特勒差示掃描量熱儀對(duì)納米纖維膜進(jìn)行熱特性分析。準(zhǔn)確稱取6～10 mg樣品放入鋁坩堝中,密封。用相同條件的空坩堝作參比。以10 ℃/min的升溫速度從20 ℃升溫至600 ℃。整個(gè)過程均在干燥N2下進(jìn)行。

采用接觸角測(cè)量?jī)x(OCA-20,德國(guó))測(cè)定水接觸角。將樣品固定在載玻片上,采用去離子水作為探針溶劑在室溫下進(jìn)行測(cè)量。每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)量3次。

采用X射線光電子能譜儀(XPS,美國(guó))用于分析膜表面元素。光源為Al Kα X射線光源(1 486.6 eV)。寬掃范圍為0～1 000 eV,掃描頻率為1.0 eV。精細(xì)掃描的頻率為0.1 eV。采用Origin pro9軟件擬合C1 s精細(xì)掃描光譜圖。以284.8 eV作為C—C/C—H的特征峰,進(jìn)行光譜校正[15]。

將電紡膜剪成2 cm×2 cm的片狀,在X-pert Powder衍射儀上進(jìn)行檢測(cè)分析,Cu Kα(λ =1.540 6 ?),傾角0.02 °,掃描速度1(°)/min,掃描范圍2θ=5 °～90 °,電壓40 kV,電流200 mA。

1.3.4 抗氧化活性

1.3.4.1 DPPH自由基清除率測(cè)定

稱取0.019 5 g DPPH,乙醇定容至100 mL得到500 μmol/L DPPH乙醇溶液,鋁箔紙包裹置于冰箱冷藏備用。稱量5 mg樣品置于10 mL離心管中,平行3次,加入2 mL 500 μmol/L DPPH乙醇溶液避光反應(yīng)30 min,在517 nm測(cè)定吸光度。DPPH自由基清除率的計(jì)算如公式(1)所示:

(1)

式中:A0為對(duì)照組吸光度,A1為樣品組吸光度。

1.3.4.2 ABTS陽離子自由基清除率測(cè)定

稱取0.038 4 g ABTS溶于10 mL去離子水得到ABTS溶液,稱取0.013 4 g 過硫酸鉀溶于10 mL 去離子水得到過硫酸鉀溶液,將2種試劑以體積比1∶1混合均勻,避光反應(yīng)12 h,得到ABTS工作液。采用pH 值為7.4的磷酸鹽緩沖溶液(PBS溶液)稀釋ABTS工作液在734 nm處吸光度為0.7±0.02的ABTS/PBS溶液。稱量5 mg樣品置于10 mL離心管中,平行3次,加入2 mL ABTS/PBS溶液,避光反應(yīng)30 min,在734 nm測(cè)定吸光度。ABTS陽離子自由基清除率的計(jì)算如公式(2)所示:

(2)

式中:A0為對(duì)照組吸光度,A1為樣品組吸光度。

1.3.4.3 FRAP總抗氧化能力測(cè)定

吸取濃鹽酸0.5 mL, 加水定容至150 mL得到40 mmol/L HCl溶液;稱取0.540 6 g六水氯化鐵,加水定容至100 mL得到20 mmol/L FeCl3溶液;稱取三水醋酸鈉16.922 1 g,量取冰醋酸40 mL,加水定容至500 mL得到0.3 mol/L醋酸鈉緩沖液(pH 3.6);稱取0.031 23 g TPTZ,用40 mmol/L HCl定容至10 mL得到TPTZ溶液。將醋酸鈉緩沖液、FeCl3溶液、TPTZ溶液以體積比10∶1∶1的比例混合得到TPTZ工作液。稱量5 mg樣品置于10 mL離心管中,平行3次,加入2 mL TPTZ工作液于37 ℃反應(yīng)30 min后,在592 nm測(cè)定吸光度,以O(shè)D值表示還原能力。

1.3.4.4 CUPRAC抗氧化能力測(cè)定

稱取0.426 2 g的二水氯化銅,定容至250 mL得到0.01 mol/L Cu2+溶液;稱取19.27 g的醋酸銨,定容至250 mL得到1 mol/L醋酸銨溶液;稱取0.040 6 g新亞銅試劑,用95%乙醇溶解后,再用無水乙醇定容至25 mL得到7.5×10-3mol/L新亞銅試劑溶液。稱量5 mg樣品置于10 mL離心管中,平行3次,加入2 mL體積比1∶1∶1銅離子溶液,醋酸銨溶液和新亞銅試劑溶液,常溫反應(yīng)30 min后,在450 nm測(cè)定吸光度,以O(shè)D值表示還原能力。

1.3.5 抑菌活性

采用抑菌圈法考察包埋有抑菌性分子的納米纖維膜的抑菌特性。選用革蘭氏陰性菌(大腸桿菌Escherichiacoli)和革蘭氏陽性菌(金黃色葡萄球菌Staphylococcusaureus)作為研究對(duì)象。用打孔器將纖維膜制成直徑5 mm的圓片在紫外燈下滅菌30 min。取100 μL菌懸液(1×106CFU/mL)均勻涂布于已滅菌的培養(yǎng)基上,然后將纖維膜貼于培養(yǎng)基表面,37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈大小。

1.4 數(shù)據(jù)分析

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用t分布檢驗(yàn)單因素方差分析(ANOVA one way),后續(xù)使用Tukey分析進(jìn)行檢驗(yàn),分析軟件為Origin 8.0。當(dāng)P<0.05時(shí),結(jié)果被認(rèn)為具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 纖維形態(tài)

圖2為負(fù)載姜黃素的明膠/玉米醇溶蛋白美拉德反應(yīng)前和反應(yīng)2 d、5 d后的電鏡圖。由圖2可知通過氣流輔助法制備得到的納米纖維形態(tài)良好,與前期研究中通過普通靜電紡絲制備得到的納米纖維形態(tài)無顯著差異[17]。但是前期研究中的進(jìn)料流速僅1.0 mL/h,而氣流輔助法可將其流速提升至10.0 mL/h,顯著提升靜電紡絲的效率,并且通過氣流輔助使得纖維直徑可調(diào)控的范圍更廣。崔柄元等[27]以聚丙烯腈為原料,采用氣流輔助紡絲工藝,在溶液的推進(jìn)速度為50 μL/h,氣流速度為90 m/s條件下,成功制得直徑為1 μm的聚丙烯腈納米纖維。如圖2所示,C0、C0.1、C0.5和C1.0的直徑分別為(573.5±172.28)、(703.5±54.89)、(733.27±75.65)、(752.25±144.34) nm。研究表明常規(guī)靜電紡絲明膠/玉米醇溶蛋白(1∶1)納米纖維的直徑約500 nm,說明氣流輔助靜電紡絲所能達(dá)到的直徑范圍與常規(guī)靜電紡絲無顯著差異[17]。美拉德反應(yīng)2 d和5 d對(duì)納米纖維的形態(tài)和直徑無顯著影響,說明該條件下對(duì)明膠/玉米醇溶蛋白進(jìn)行美拉德反應(yīng)能夠保持納米纖維膜的孔隙率和較大的比表面積。ZHANG等[28]制備了谷朊蛋白/玉米醇溶蛋白/木糖納米纖維并在溫度60 ℃濕度40%條件下反應(yīng)24 h后發(fā)現(xiàn)纖維直徑增大并發(fā)生了一定程度的溶并,可能是由于纖維中的蛋白吸水發(fā)生了潤(rùn)脹。

圖2 明膠/玉米醇溶蛋白納米纖維美拉德反應(yīng)前和反應(yīng)2 d、5 d后的掃描電鏡圖和纖維直徑分布Fig.2 The SEM images and diameter distribution of gelatin/zein nanofibers before and after 2 d,5 d Maillard reaction

2.2 傅里葉變換紅外(Fourier transform infrared,FTIR)分析

2.3 差示掃描量熱(differential scanning calorimeter,DSC)分析

納米纖維膜的DSC圖如圖4所示,熱力學(xué)數(shù)據(jù)列于表1。T1表示導(dǎo)致納米纖維膜結(jié)構(gòu)的解聚溫度,而T2對(duì)應(yīng)于納米纖維膜的降解溫度。隨著美拉德反應(yīng)進(jìn)行增加了T1的溫度,說明美拉德反應(yīng)體系有更好的熱穩(wěn)定性。張洪才[30]在α-殼聚糖-果糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物研究中顯示,隨著果糖的加入,美拉德反應(yīng)后解聚溫度增加。歲魯姍等[31]也在研究中得出,紫薯蛋白-葡萄糖美拉德產(chǎn)物的變性峰溫度有所提高,這表明美拉德反應(yīng)改變了蛋白的結(jié)構(gòu)和構(gòu)象。

a-反應(yīng)前；b-反應(yīng)2 d；c-反應(yīng)5 d圖3 明膠/玉米醇溶蛋白納米纖維美拉德反應(yīng)前和反應(yīng)2 d、5 d后的紅外光譜圖Fig.3 The FTIR spectra of gelatin/zein nanofibers before and after 2 d,5 d Maillard reaction

a-反應(yīng)前；b-反應(yīng)2 d；c-反應(yīng)5 d圖4 明膠/玉米醇溶蛋白納米纖維美拉德反應(yīng)前和反應(yīng)2 d、5 d后的DSC譜圖Fig.4 The DSC curves of gelatin/zein nanofibers before and after 2 d, 5 d Maillard reaction

表1 明膠/玉米醇溶蛋白納米纖維美拉德反應(yīng)前和反應(yīng)2 d、5 d后的熱力學(xué)數(shù)據(jù)Table 1 The DSC spectra data of gelatin/zein nanofibers before and after 2 d,5 d Maillard reaction

2.4 X射線衍射(X-ray diffraction,XRD)分析

通過XRD對(duì)納米纖維膜的結(jié)晶性進(jìn)行研究,結(jié)果如圖5所示。根據(jù)研究表明,明膠/玉米醇溶蛋白在8.5和21.2處出現(xiàn)寬衍射峰,其結(jié)晶性是由其α-螺旋結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的[17]。陳建平等[32]研究發(fā)現(xiàn),單一的姜黃素在8.78、17.2和21.01等多處存在結(jié)晶衍射峰。但不同姜黃素添加量及美拉德反應(yīng)的納米纖維膜具有相同的散射模式,表明姜黃素均勻包埋于明膠/玉米醇溶蛋白中,無結(jié)晶形成。

2.5 接觸角分析

接觸角用來衡量潤(rùn)濕程度,由表2 可知,接觸角均大于90(θ>90),說明納米纖維膜表面表現(xiàn)為疏水狀態(tài)。由于姜黃素不溶于水,隨著姜黃素的加入,一定程度上增加了納米纖維膜的疏水性。對(duì)于不含姜黃素的明膠/ 玉米醇溶蛋白納米纖維,含0.1%和0.5%姜黃素的納米纖維膜隨著美拉德反應(yīng)進(jìn)行接觸角減小,結(jié)合電鏡圖來看,最小接觸角為C0.1M2[(138.40±0.26)°],原因?yàn)榧{米纖維膜在美拉德反應(yīng)中暴露出的OH基團(tuán)殘留導(dǎo)致。ZHANG等[28]研究表明通過美拉德反應(yīng)可以破壞氫鍵和非極性疏水性基團(tuán)來提高靜電紡絲薄膜的疏水性,但未消耗的糖中暴露出的殘留OH基團(tuán)對(duì)薄膜的表面親水性有較大的促進(jìn)作用。

2.6 抑菌抗氧化分析

本研究采用了DPPH、ABTS、FRAP和CUPRAC法評(píng)價(jià)C0、C0.1、C0.5和C1.0分別進(jìn)行0、2、5 d美拉德反應(yīng)后的抗氧化效果。由圖6可知,不同樣品之間的抗氧化效果有顯著性差異。由圖6-a可知,隨著姜黃素含量增加,對(duì)DPPH自由基清除率逐漸增大,當(dāng)姜黃素含量為1.0%時(shí),其自由基清除率達(dá)到58.99%。在同一濃度下,伴隨著美拉德反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng),試樣對(duì)DPPH自由基清除率降低,是由于隨著美拉德反應(yīng)交聯(lián)進(jìn)行,使得姜黃素釋放受到限制,從而降低其抗氧化活性。由圖6-b可以看出,姜黃素含量和美拉德反應(yīng)程度對(duì)ABTS陽離子自由基清除率沒有顯著影響。由圖6-c可以看出,不同的姜黃素添加在美拉德反應(yīng)2 d時(shí)對(duì)Fe3+還原能力最強(qiáng),且隨著姜黃素含量增加而增大,隨著美拉德反應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行至5 d,美拉德反應(yīng)中間產(chǎn)物被分解,從而使得其抗氧化效果降低[33]。圖6-d納米纖維膜對(duì)Cu2+還原能力結(jié)果與圖6-b和圖6-c基本一致。

a-反應(yīng)前；b-反應(yīng)2 d；c-反應(yīng)5 d圖5 明膠/玉米醇溶蛋白納米纖維美拉德反應(yīng)前和反應(yīng)2 d、5 d后的XRD譜圖Fig.5 The XRD spectra of gelatin/zein nanofibers before and after 2 d, 5 d Maillard reaction

表2 明膠/玉米醇溶蛋白納米纖維膜美拉德反應(yīng)前和反應(yīng)2 d、5 d后接觸角Table 2 The water contact angle of gelatin/zein nanofibrous film before and after 2 d,5 d Maillard reaction

納米纖維膜對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的平板抑菌效果如圖7所示,姜黃素納米纖維膜對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均具有顯著抑制效果,負(fù)載 0.1%、0.5%和1.0%姜黃素的納米纖維膜對(duì)大腸桿菌抑菌圈直徑分別為9.51、17.55和19.86 mm,對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌圈直徑分別為6.23、12.15和13.07 mm,抑菌效果隨著姜黃素濃度增加而增強(qiáng),存在量效關(guān)系。但隨著美拉德反應(yīng)的發(fā)生,抑菌效果不顯著,歸因于蛋白的氨基酸殘基與葡萄糖發(fā)生美拉德反應(yīng)增加了網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的聯(lián)結(jié),從而限制姜黃素的釋放,降低其抑菌效果,這一結(jié)果與DPPH的抗氧化效果一致。

a-DPPH法;b-ABTS法;c-FRAP法;d-CUPRAC法圖6 明膠/玉米醇溶蛋白納米纖維美拉德反應(yīng)前和反應(yīng)2 d、5 d后的抗氧化效果Fig.6 The antioxidant activity of gelatin/zein nanofibers before and after 2 d,5 d Maillard reaction

圖7 明膠/玉米醇溶蛋白納米纖維美拉德反應(yīng)前和反應(yīng)2 d、5 d后的抑菌圈結(jié)果Fig.7 The inhibition zones of gelatin/zein nanofibers before and after 2 d,5 d Maillard reaction

3 結(jié)論

本文研究了負(fù)載0%、0.1%、0.5%、1.0%姜黃素的明膠/玉米醇溶蛋白納米纖維美拉德反應(yīng)前和反應(yīng)2 d、5 d后納米纖維性能的變化。氣流輔助靜電紡絲技術(shù)顯著提升納米纖維的制備效率并對(duì)其纖維形態(tài)無影響,姜黃素含量和美拉德反應(yīng)程度對(duì)納米纖維直徑無顯著影響。負(fù)載姜黃素的明膠/玉米醇溶蛋白納米纖維具有較好的抑菌抗氧化性能,具有作為活性包裝的應(yīng)用前景。美拉德反應(yīng)后的納米纖維具有較高的熱穩(wěn)定性,但抑制了姜黃素的快速釋放,表現(xiàn)為較低的DPPH自由基清除能力和抗菌能力。但是美拉德反應(yīng)增加了納米纖維的Fe3+和Cu2+還原能力,可歸因于美拉德產(chǎn)物對(duì)金屬離子具有較好的螯合作用。