杜 然，王 湘，李希平，崔應(yīng)東，曾 光

糖尿病腎病是糖尿病患者常見并發(fā)癥之一，主要表現(xiàn)為腎小管上皮細(xì)胞損傷，最終導(dǎo)致腎臟纖維化和腎功能下降[1]。近年糖尿病腎病已成為重要的公共衛(wèi)生問題，嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量[2]。腎小管上皮細(xì)胞活力下降和凋亡增加是糖尿病腎小管上皮細(xì)胞損傷的關(guān)鍵因素[3]。糖尿病影響腎小管上皮細(xì)胞活力和凋亡的確切分子機(jī)制并不清楚。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)是一類長(zhǎng)度普遍>200個(gè)核苷酸的單鏈非編碼RNA，調(diào)控各種底物基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，參與調(diào)控泌尿系統(tǒng)的發(fā)育和病理改變[4]。已有研究證實(shí)，高糖能夠誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞中l(wèi)ncRNA表達(dá)下調(diào)或上調(diào)，調(diào)控lncRNA的表達(dá)可有效抑制腎小管上皮細(xì)胞的損傷[5-7]。TMEM161B-AS1是一種lncRNA，其基因定位于人染色體5q14.3，長(zhǎng)度為409個(gè)核苷酸，作為癌基因或抑癌基因參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。然而，目前并不清楚TMEM161B-AS1在糖尿病腎小管上皮細(xì)胞損傷中的作用。本文探究TMEM161B-AS1在高糖誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞增殖和凋亡中發(fā)揮的作用，并明確其確切分子機(jī)制，為探究新的糖尿病腎病防治靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞與試劑 人腎小管上皮細(xì)胞HK-2購于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、Lipofectamine 3000試劑盒購于中國(guó)賽默飛科技有限公司；細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、qRT-PCR試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司；雙熒光素酶檢測(cè)試劑盒、TMEM161B-AS1過表達(dá)載體、陰性對(duì)照載體購于美國(guó)Promega公司；hsa-miR-135b、has-miR-NC、野生型TMEM161B-AS1 WT和突變型TMEM161B-AS1 Mut質(zhì)粒購于蘇州泓迅生物科技有限公司；α-SMA、β-Tubulin、Fibronectin、E-Cadherin、Claudin-1、ZO-1單克隆抗體購于美國(guó)Santa Cruz Biotechnology公司。

1.2細(xì)胞高糖培養(yǎng)與分組轉(zhuǎn)染 在水浴鍋中快速解凍凍存的HK-2細(xì)胞，使用含5%胎牛血清、30 mmol/L葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基，于5% CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)。將細(xì)胞分別接種于12孔板，繼續(xù)培養(yǎng)12 h，按照Lipofectamine 3000試劑盒說明書，分別將TMEM161B-AS1過表達(dá)載體、陰性對(duì)照載體轉(zhuǎn)染至HK-2細(xì)胞，設(shè)為TMEM161B-AS1組和對(duì)照組，常規(guī)培養(yǎng)36 h后進(jìn)行后續(xù)操作。

1.3qRT-PCR檢測(cè)TMEM161B-AS1、hsa-miR-135b表達(dá) Trizol法抽提2組細(xì)胞總RNA，通過微量分光光度計(jì)分析總RNA濃度和純度，逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。qRT-PCR反應(yīng)程序?yàn)?6 ℃ 55 s、59 ℃ 27 s、73 ℃ 27 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參計(jì)算TMEM161B-AS1相對(duì)表達(dá)量，以U6為內(nèi)參計(jì)算hsa-miR-135b相對(duì)表達(dá)量，引物序列見表1。

表1 TMEM161B-AS1、hsa-miR-135b及其內(nèi)參的引物序列

1.4CCK-8法檢測(cè)HK-2細(xì)胞增殖 將2組細(xì)胞接種于96孔板，每孔6×103個(gè)。繼續(xù)培養(yǎng)1、2、3、4、5 d后，每孔加入25 μl的CCK-8試劑，于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)5 h，使用多功能酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)460 nm處檢測(cè)每孔光密度(OD)值，繪制各組細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HK-2細(xì)胞凋亡 收集2組和對(duì)照組細(xì)胞，用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液清洗4次，加入結(jié)合緩沖液調(diào)整細(xì)胞密度為5×105/ml，分別加入PI試劑和FITC-Annexin V工作液各6 μl，在暗室內(nèi)孵育30 min。加入600 μl結(jié)合緩沖液，立即通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)HK-2細(xì)胞凋亡率。

1.6生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)和雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)測(cè)定 利用在線靶基因預(yù)測(cè)軟件LNCediting預(yù)測(cè)TMEM161B-AS1的靶基因。按照Lipofectamine 3000試劑盒說明書,分別將hsa-miR-135b、has-miR-NC、TMEM161B-AS1 WT及TMEM161B-AS1 Mut質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HK-2細(xì)胞，轉(zhuǎn)染50 h后，使用雙熒光素酶檢測(cè)試劑盒檢測(cè)不同細(xì)胞相對(duì)熒光素酶活性。

1.7Western blot檢測(cè)HK-2細(xì)胞α-SMA、Fibronectin、E-Cadherin、Claudin-1和ZO-1蛋白表達(dá) 使用含有苯甲基磺酰氟的裂解液裂解細(xì)胞，離心并收集上清，測(cè)定蛋白濃度后，每組取60 μg蛋白添加到凝膠孔，進(jìn)行蛋白電泳。完成蛋白電泳后，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。采用8%脫脂奶粉去除非特異性結(jié)合位點(diǎn)，加入一抗稀釋液α-SMA(1∶2000)、β-Tubulin(1∶1000)、Fibronectin(1∶2000)、E-Cadherin(1∶2000)、Claudin-1、ZO-1(1∶2000)，其中β-Tubulin為內(nèi)參，于4 ℃下孵育8 h。添加特異性二抗稀釋液(1∶7000)，室溫孵育3 h。配制ECL發(fā)光液，均勻滴加在條帶上，采用凝膠成像系統(tǒng)曝光蛋白條帶。

2 結(jié)果

2.1TMEM161B-AS1的二級(jí)結(jié)構(gòu) 采用RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)軟件UFold預(yù)測(cè)TMEM161B-AS1的二級(jí)結(jié)構(gòu)，見圖1。

2.2TMEM161B-AS1過表達(dá)載體對(duì)高糖誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞TMEM161B-AS1表達(dá)的影響 qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，對(duì)照組和TMEM161B-AS1組細(xì)胞TMEM161B-AS1表達(dá)水平分別為0.98±0.12和8.21±1.85。與對(duì)照組比較，TMEM161B-AS1組細(xì)胞TMEM161B-AS1表達(dá)水平明顯升高(P<0.01)。

2.3TMEM161B-AS1對(duì)高糖誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞增殖的影響 CCK-8法檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，TMEM161B-AS1組細(xì)胞培養(yǎng)2～5 d增殖能力顯著升高(P<0.05，P<0.01)。見圖2。

圖2 TMEM161B-AS1對(duì)高糖誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞增殖的影響

2.4TMEM161B-AS1對(duì)高糖誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，對(duì)照組和TMEM161B-AS1組細(xì)胞凋亡率分別為(12.06±2.46)%和(7.06±0.47)%。與對(duì)照組比較，TMEM161B-AS1組細(xì)胞凋亡率明顯降低(P<0.01)。見圖3。

圖3 TMEM161B-AS1對(duì)高糖誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞凋亡的影響

2.5生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)TMEM161B-AS1的靶基因 通過在線軟件LNCediting預(yù)測(cè)顯示，TMEM161B-AS1與hsa-miR-135b存在互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)。見圖4。

圖4 LNCediting軟件預(yù)測(cè)TMEM161B-AS1的靶基因

2.6TMEM161B-AS1與hsa-miR-135b的關(guān)系 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染has-miR-NC比較，轉(zhuǎn)染hsa-miR-135b能顯著降低HK-2細(xì)胞TMEM161B-AS1 WT的熒光素酶活性(P<0.01)，二者對(duì)于TMEM161B-AS1 Mut熒光素酶活性無明顯影響(P>0.05)。提示hsa-miR-135b能抑制HK-2細(xì)胞TMEM161B-AS1 WT熒光素酶活性，但不能降低TMEM161B-AS1 Mut熒光素酶活性。見圖5。

圖5 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證TMEM161B-AS1與hsa-miR-135b的關(guān)系

2.7TMEM161B-AS1對(duì)hsa-miR-135b表達(dá)的影響 qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，對(duì)照組和TMEM161B-AS1組細(xì)胞hsa-miR-135b表達(dá)水平分別為5.37±0.99和1.06±0.51。與對(duì)照組比較，TMEM161B-AS1組細(xì)胞hsa-miR-135b表達(dá)水平明顯降低(P<0.01)。

2.8TMEM161B-AS1對(duì)高糖誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化表型蛋白的影響 Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，TMEM161B-AS1組上皮細(xì)胞表型蛋白ZO-1、E-Cadherin、Claudin-1表達(dá)明顯增加，間質(zhì)細(xì)胞表型蛋白α-SMA、Fibronectin表達(dá)明顯降低(P<0.05)。見圖6。

圖6 Western blot檢測(cè)TMEM161B-AS1對(duì)HK-2細(xì)胞上皮-間質(zhì)表型蛋白的影響

3 討論

糖尿病腎病是一種糖尿病微血管并發(fā)癥，最終導(dǎo)致終末期腎病[8]。高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞損傷涉及多種分子信號(hào)通路的異常改變[9]。lncRNA是一種表觀遺傳修飾因子，通過改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)、調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后修飾，影響細(xì)胞的生理和病理行為[10-11]。近年來，lncRNA已成為糖尿病腎病研究的熱點(diǎn)。有研究表明，lncRNA Dlx6os1在糖尿病腎病小鼠腎臟組織中高表達(dá)，敲低lncRNA Dlx6os1表達(dá)能夠抑制高糖誘導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞增殖、纖維化和炎性細(xì)胞因子釋放[12]。lncRNA PAX8-AS1-N在糖尿病腎病患者血液和尿液中低表達(dá)，能通過直接靶標(biāo)miR-17-5p增強(qiáng)小鼠足細(xì)胞的增殖能力并降低細(xì)胞的凋亡比例[13]。lncRNA lnc-ISG20在糖尿病腎病小鼠腎組織中表達(dá)升高，沉默lncRNA lnc-ISG20表達(dá)能夠減輕高糖誘導(dǎo)的腎臟纖維化，可能成為糖尿病腎病的診斷指標(biāo)[14]。

TMEM161B-AS1是一個(gè)功能性lncRNA。SHI等[15]研究結(jié)果顯示，TMEM161B-AS1在食管鱗狀細(xì)胞癌組織中表達(dá)低于正常組織樣本，其低表達(dá)與食管鱗狀細(xì)胞癌患者TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預(yù)后不良有關(guān)，過表達(dá)TMEM161B-AS1能抑制食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的葡萄糖消耗和乳酸產(chǎn)生。CHEN等[16]研究顯示，TMEM161B-AS1能夠上調(diào)多個(gè)鐵死亡相關(guān)基因的表達(dá)，從而促進(jìn)膠質(zhì)細(xì)胞瘤的惡性生物學(xué)行為及對(duì)替莫唑胺的耐藥性。TMEM161B-AS1在腎小管上皮細(xì)胞中的功能尚不明確。

本研究顯示，上調(diào)TMEM161B-AS1能夠促進(jìn)HK-2細(xì)胞的增殖，抑制HK-2細(xì)胞的凋亡。提示TMEM161B-AS1可能在高糖誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞中發(fā)揮保護(hù)作用，從而抑制糖尿病腎病的進(jìn)展。既往研究證實(shí)，miRNA是一種高度保守的不具有編碼功能的轉(zhuǎn)錄本，lncRNA能夠靶向結(jié)合特定miRNA，覆蓋其功能區(qū)域，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的各種生命活動(dòng)[17-19]。本研究顯示，TMEM161B-AS1與hsa-miR-135b存在結(jié)合位點(diǎn)。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)TMEM161B-AS1與hsa-miR-135b序列間直接結(jié)合。本研究還顯示，HK-2細(xì)胞TMEM161B-AS1表達(dá)升高后，hsa-miR-135b表達(dá)被抑制。以上結(jié)果表明HK-2細(xì)胞存在TMEM161B-AS1/hsa-miR-135b信號(hào)調(diào)控通路。已有研究表明，在高糖刺激的腎小管上皮細(xì)胞中hsa-miR-135b表達(dá)顯著上調(diào)，hsa-miR-135b參與高糖誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激過程，抑制腎小管上皮細(xì)胞的增殖并促進(jìn)其凋亡[20]。腎小管上皮細(xì)胞損傷能夠誘發(fā)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，是最終發(fā)展至腎纖維化的重要環(huán)節(jié)[19]。本研究結(jié)果顯示，TMEM161B-AS1表達(dá)上調(diào)后，高糖誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞的上皮細(xì)胞表型蛋白ZO-1、E-Cadherin、Claudin-1表達(dá)明顯增加，間質(zhì)細(xì)胞表型蛋白α-SMA、Fibronectin表達(dá)明顯降低，表明TMEM161B-AS1能夠抑制HK-2細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，

綜上所述，lncRNA TMEM161B-AS1通過抑制hsa-miR-135b表達(dá)，促進(jìn)高糖誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞增殖、抑制其凋亡及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化,從而參與腎小管上皮細(xì)胞的功能活動(dòng)，通過調(diào)控相關(guān)通路促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞的增殖并抑制其凋亡。