白玉 柳鑫 程小剛 郭倩 何文喜 余擎

當齲病突破牙釉質(zhì)進展到牙本質(zhì)層時，微生物增殖和代謝活動產(chǎn)生的細菌會沿著牙本質(zhì)小管向外周牙髓擴散，牙本質(zhì)脫礦也可能使基質(zhì)中的活性分子釋放。成牙本質(zhì)細胞會識別這些細菌產(chǎn)物以及分子觸發(fā)一系列宿主保護事件，包括抗菌、免疫炎癥反應(yīng)[1]及分泌形成修復(fù)性牙本質(zhì)[2]，從而阻止發(fā)展為不可逆的牙髓炎癥。當炎癥發(fā)展迅速或加重時會通過多種機制損害成牙本質(zhì)細胞的功能[3]，因此牙髓牙本質(zhì)修復(fù)是炎癥反應(yīng)和修復(fù)反應(yīng)之間的一種平衡，這一過程受多種分子信號共同調(diào)控[4-5]，了解這些分子功能有助于優(yōu)化牙髓的保存治療。組蛋白去乙?；?histone deacetylases,HDACs)是表觀遺傳學(xué)中的重要調(diào)控因子，可以調(diào)節(jié)組蛋白及非組蛋白的乙酰化修飾，參與免疫調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)和組織再生過程[5]。本課題組前期及其它學(xué)者已證實泛HDAC抑制劑可促進牙髓干細胞的分化[6-7]，說明HDACs參與調(diào)控了牙本質(zhì)形成的過程。HDAC5是一種Ⅱ類HDAC，已證實其在免疫反應(yīng)以及成骨過程中有重要的調(diào)節(jié)作用[8]，但HDAC5在牙髓牙本質(zhì)炎癥及再生過程中的功能還未見相關(guān)研究。本實驗擬通過觀察HDAC5在不同牙髓組織中的表達變化，體外建立過表達HDAC5的成牙本質(zhì)細胞系，初步探討HDAC5在牙髓炎中的表達以及對成牙本質(zhì)細胞功能的影響，為臨床治療提供新的靶點和思路。

1 材料與方法

本實驗涉及人牙實驗已由空軍軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院倫理委員會審批(批號： IRB-REV-2019018)。

1.1 實驗主要試劑

α-MEM培養(yǎng)基(C12571500BT)、胎牛血清(10270-106)(Gibco，美國)；RIPA裂解液(P0013B)、蛋白酶抑制劑(P1005)、Western blot封閉液及抗體稀釋液(P0239)、免疫染色封閉液(P0260)、免疫染色一抗稀釋液(P0239)、免疫熒光染色試劑盒-抗鼠Alexa Fluor(P0191)、堿性磷酸酶檢測試劑盒(P0321S)、BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒(C3206)(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；茜素紅染液(G1038)、蘇木素染液(G1004)(武漢賽維爾生物科技有限公司)；Western blot凝膠配制套裝(1610172)、電泳液(1610732 )、轉(zhuǎn)膜液(10026938)(Bio-Rad，美國);CCK-8(CK04,同仁，日本)；慢病毒載體(上海吉凱基因科技有限公司)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(G490)、實時定量PCR試劑盒(G895)(ABM，加拿大)；BSP(5468)、COL1α(7206)、Runx2抗體(12556)(CST，美國)；HDAC5(sc-133225)、DSPP(sc-73632)、OCN抗體(sc-390877)(Santa，美國)；DMP-1抗體(NBP1-45525，Novus，美國)；GAPDH(60004，Proteintech，美國)；HRP山羊抗小鼠IgG(33201ES60)、HRP山羊抗兔IgG(33101ES60)(上海翌圣生物科技有限公司)。成牙本質(zhì)細胞系(OLCs)由日本秋田大學(xué)Arany教授饋贈。

1.2 離體牙HE染色和免疫熒光染色

經(jīng)患者知情同意收集頜面外科因治療需要拔除的第三磨牙，分為健康組(無牙體牙周疾病)及牙髓炎組(組織染色結(jié)合臨床診斷)，立即用渦輪機磨除釉質(zhì)及根尖三分之一，4%多聚甲醛固定48 h，17%EDTA脫鈣液脫礦2 個月，常規(guī)脫水浸蠟包埋切片，HE染色，免疫熒光染色觀察HDAC5在牙髓炎及健康牙髓組織中的表達變化。

1.3 建立HDAC5過表達OLCs

OLCs培養(yǎng)于含10%血清的培養(yǎng)基中。設(shè)置含空載體的陰性對照組，過表達HDAC5慢病毒轉(zhuǎn)染組，按照吉凱公司慢病毒使用手冊進行轉(zhuǎn)染實驗。48 h后熒光顯微鏡下觀察細胞轉(zhuǎn)染情況，TRIzol提取RNA進行qRT-PCR檢測HDAC5 mRNA表達情況，72 h后提取蛋白Western blot檢測HDAC5蛋白表達情況，均選擇GAPDH為內(nèi)參。 引物序列如表 1。

1.4 細胞增殖實驗

將各組細胞按照1×103個/孔種于96 孔版中，分別于1、 3、5和7 d在固定時間加入含10% CCK8的培養(yǎng)基，37 ℃孵育2 h，酶標儀450 nm波長檢測各孔吸光度值，取平均值繪制生長曲線。

1.5 成牙/成骨能力檢測

1.5.1 ALP染色及活性檢測 礦化誘導(dǎo)7 d后，根據(jù)說明書進行ALP染色及活性檢測。

1.5.2 茜素紅染色 礦化誘導(dǎo)14 d后固定細胞后茜素紅染色15 min，拍照后每孔加入1 mL 10%氯化十六烷基吡啶，完全脫色后酶標儀562 nm波長檢測脫色液吸光度值。

1.5.3 Western blot 礦化誘導(dǎo)14 d后RIPA裂解液提取蛋白，BCA法檢測蛋白濃度，蛋白變性后按照20 μg每泳道上樣進行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，加入COL1α、DSPP、Runx2、OCN、BSP、DMP-1和GAPDH抗體4 ℃孵育過夜，加入二抗室溫孵育1 h，滴加ECL發(fā)光液成像儀采集印記結(jié)果，Image J軟件測算灰度值。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

實驗數(shù)據(jù)結(jié)果統(tǒng)計學(xué)分析及作圖使用GraphPad Prism 8軟件，統(tǒng)計學(xué)方式為配對t檢驗，當P<0.05時，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 HDAC5在牙髓組織中的表達

HE染色可見正常牙髓組織結(jié)構(gòu)完整，成牙本質(zhì)細胞層排列整齊(圖 1A)， HDAC5(紅色熒光)在正常牙髓組織僅在髓核血管位置陽性表達(圖 1B)。牙髓炎標本的牙髓組織HE染色可見血管增多，炎性細胞增多牙髓細胞減少，成牙本質(zhì)細胞體積縮小(圖 1C)，其免疫熒光染色顯示HDAC5表達增多，并在成牙本質(zhì)細胞層可見HDAC5的表達(圖 1D,白色箭頭指向成牙本質(zhì)細胞層)。

圖 1 HDAC5在牙髓組織中的表達情況

2.2 HDAC5過表達慢病毒轉(zhuǎn)染效率

慢病毒轉(zhuǎn)染48 h后，倒置顯微鏡下觀察可見兩組細胞形態(tài)均為梭形并無明顯差異，各組均觀察到綠色熒光染色陽性細胞(圖 2A)，qRT-PCR和Western blot結(jié)果表明，與NC組相比，過表達組細胞中HDAC5的mRNA表達(P<0.000 1)和蛋白水平(P<0.000 1)均明顯上升(圖 2B～2C)。

圖 2 慢病毒轉(zhuǎn)染后OLCs中HDAC5的表達

2.3 HDAC5抑制細胞增殖

CCK8結(jié)果表明，在第1天兩組之間增殖能力無明顯差異(P=0.977 5)，而第3、5及7天(P<0.000 1)，HDAC5過表達組細胞增殖活性受到抑制(圖 3)。

圖 3 HDAC5對OLCs增殖的影響

2.4 HDAC5抑制OLCs成牙/成骨分化

ALP染色和活性檢測結(jié)果(圖 4A)及茜素紅染色結(jié)果(圖 4B)可見，與NC組相比，過表達HDAC5組早期和晚期成骨/成牙分化均受到抑制，礦化結(jié)節(jié)形成減少(P<0.001)。

圖 4 HDAC5對OLCs礦化能力的影響

同時， Western blot實驗結(jié)果可見HDAC5過表達組的COL1α，DSPP，Runx2，OCN，BSP，DMP-1蛋白表達均降低(P<0.05)(圖 5)，進一步驗證了HDAC5對OLCs成牙/成骨分化的抑制作用。

圖 5 HDAC5對OLCs成牙/成骨相關(guān)蛋白表的影響

3 討 論

齲病是牙體牙髓疾病最常見的病因，在齲病發(fā)展過程中，細菌及他們的代謝產(chǎn)物以及牙本質(zhì)基質(zhì)中分解的活性分子與牙髓中的細胞發(fā)揮相互作用，參與這一過程[9]。在進展相對緩慢的病程中，這些分子會誘導(dǎo)牙本質(zhì)再生反應(yīng)，相反的，在進展迅速或感染未阻斷的損傷下，細胞和分子作用會引起更強烈的免疫炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致牙髓組織的壞死[10]，而如果在疾病發(fā)展過程中給予適當?shù)母缮妫赡軙龠M再生反應(yīng)自然發(fā)生，也是臨床活髓保存術(shù)及再生根管治療的生理學(xué)基礎(chǔ)。炎癥和再生這兩個過程之間的平衡受到了復(fù)雜的信號網(wǎng)絡(luò)調(diào)控，了解這其中的生物分子是如何調(diào)控細胞行為，有助于掌握臨床再生治療的局限性和設(shè)計改進治療方法。

目前已有很多研究闡明了分子信號通路在牙髓牙本質(zhì)再生中的作用[11]，但最近越來越多的研究發(fā)現(xiàn)表觀遺傳學(xué)在炎癥及組織修復(fù)中也起到了關(guān)鍵作用[12]。翻譯后修飾(PTMs)是其中的一種調(diào)控方式，包括了磷酸化、糖基化、甲基化、乙酰化、泛素化和類泛素化等[13]。其中乙?；陌l(fā)生主要是通過HDACs和組蛋白乙酰基轉(zhuǎn)移酶，他們根據(jù)細胞需要改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄過程發(fā)揮重要功能[14]?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)組織中有18種HDAC酶存在，但其在牙髓炎癥及損傷修復(fù)中的表達和作用尚不清楚。在本研究中，首先通過免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)與健康牙髓組織相比，HDAC5在牙髓炎標本中表達增強，尤其在成牙本質(zhì)細胞層出現(xiàn)陽性表達，但高表達的HDAC5究竟對成牙本質(zhì)細胞有什么作用還不清楚。

為了進一步確定HDAC5對成牙本質(zhì)細胞的影響，利用通過慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)，成功建立了HDAC5過表達OLCs的細胞模型，在此基礎(chǔ)上研究HDAC5的調(diào)控功能。發(fā)現(xiàn)HDAC5過表達抑制OLCs的增殖，ALP染色活性及茜素紅結(jié)果顯示過表達HDAC5的OLCs成骨能力和礦化結(jié)節(jié)形成能力受到抑制。為進一步驗證HDAC5對OLCs分化的影響，通過Western blot實驗觀察了成牙/成骨分化相關(guān)蛋白的表達，結(jié)果可見，無論是早期分化相關(guān)蛋白COL1α、Runx2、BSP和DMP-1，還是晚期基質(zhì)礦化相關(guān)蛋白DSPP、OCN的表達均受到了抑制，說明了HDAC5在OLCs分化過程中起負調(diào)控作用。

通過的實驗以及文獻報道可以推測組蛋白去乙?；甘枪?、牙周膜和牙髓礦化過程中的重要調(diào)節(jié)因子點[15-16]，但其作用機制還未明確。HDACs除對組蛋白修飾還可以通過對非組蛋白(如轉(zhuǎn)錄因子)去乙酰化修飾調(diào)控轉(zhuǎn)錄活性[17]，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)HDAC4和HDAC5可以結(jié)合Runx2抑制其啟動OCN的轉(zhuǎn)錄進而抑制成骨細胞分化[18]，為下一步研究HDAC5對OLCs的調(diào)控機制提供思路。

由于組蛋白修飾高度不穩(wěn)定可以被干預(yù)，隨著特異性HDAC抑制劑的發(fā)展，HDACs將會是臨床治療中容易控制的治療靶點[19]。綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)牙髓炎中HDAC5的表達增強，同時通過過表達HDAC5證實其對OLCs增殖及分化有抑制作用，未來還需進一步研究如何調(diào)控HDACs促進牙本質(zhì)修復(fù)再生。