袁平平 呂守印 馬曉婷 程雯 吳煒 韶波

頭頸部因外傷、先天性畸形和腫瘤切除造成的軟骨缺損重建仍然是一個(gè)臨床挑戰(zhàn)。自體軟骨移植雖然是一種常見且成功的治療方法，但對(duì)患者有傷害，手術(shù)中也難免要犧牲部分軟骨組織保證形態(tài)[1]。因此建立一種可替代的移植方法是非常必要的。隨著組織工程技術(shù)的發(fā)展，使用體外擴(kuò)增細(xì)胞重建軟骨成為可行的方法[2]。間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是一種多能干細(xì)胞,具有自我復(fù)制、多向分化和免疫調(diào)控等特點(diǎn),且擁有取材方便、易體外擴(kuò)增的優(yōu)點(diǎn)。大量研究表明,間充質(zhì)干細(xì)胞的再生作用可能是由其來源的囊泡(extracellular vesicles derived from mesenchymal stem cells,MSCs-EVs)介導(dǎo)的旁分泌作用完成的[3]。MSCs-EVs可能通過受體-配體相互作用,傳遞表面受體、信號(hào)分子、生物活性脂質(zhì)、miRNAs、mRNA等至靶細(xì)胞,從而調(diào)控靶細(xì)胞的功能[4]。多項(xiàng)研究表明，MSCs-EVs具有與MSCs相似的功能，并可作為MSCs的替代品，用于多種炎癥性疾病、視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷和骨缺損的治療[5-7]。

組織工程化軟骨移植物的構(gòu)建中，種子細(xì)胞的選擇是至關(guān)重要的。在本研究中，發(fā)現(xiàn)BMSCs-EVs通過其攜帶的miRNA可以增強(qiáng)共培養(yǎng)軟骨細(xì)胞(chondrocytes,CHs)的增殖和遷移能力。這有望為軟骨組織工程提供新的思路，改善組織工程化軟骨移植物的培養(yǎng)方式。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

α-MEM培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、青霉素鏈霉素、胰蛋白酶、磷酸鹽緩沖液(PBS)(HyClone公司,美國(guó));胎牛血清(Gibco公司,美國(guó))；II型膠原酶(Worthington公司，美國(guó));成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基、成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基和成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基(賽業(yè)生物科技有限公司)；DAPI(北京索萊寶科技有限公司);TruSeqTMRNA樣品制備試劑盒(Illumina公司,美國(guó));共聚焦激光掃描顯微鏡、光學(xué)顯微鏡、透射電鏡(Olympus，日本);超速離心機(jī)(Beckman公司,美國(guó))；凝膠電泳系統(tǒng)(Bio-Rad，美國(guó))；BCA蛋白濃度定量試劑盒(上海碧云天)。

1.2 細(xì)胞來源和鑒定

原代BMSCs取自3 周雄性SD大鼠，麻醉處死后無(wú)菌環(huán)境下取出股骨并切斷兩端骨骺，用培養(yǎng)基將骨髓沖出，細(xì)胞傳至P3代后使用。顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志物。分別使用成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基、成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基和成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基(cyagen biosciences)培養(yǎng)BMSCs， 21 d后分別進(jìn)行油紅O染色、茜素紅染色和阿利新藍(lán)染色，評(píng)價(jià)BMSCs向脂肪細(xì)胞、骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞的分化能力。

CHs取自3周雄性SD大鼠，麻醉處死后取膝關(guān)節(jié)，無(wú)菌條件下分離周圍組織，剝下軟骨剪碎，II型膠原酶(worthington)消化后培養(yǎng)，細(xì)胞傳至P3代后使用。

1.3 BMSCs-EVs的分離及鑒定

利用超速離心法進(jìn)行BMSCs-EVs的分離，BMSCs培養(yǎng)24 h后收集上清，4 ℃，1 500 g離心10 min清除死亡細(xì)胞和細(xì)胞碎片,離心后取上清，4 ℃，5 000 g離心15 min,取上清100 000 g離心30 min，取上清140 000 g離心60 min,棄上清， 5 mL PBS重懸后140 000 g離心60 min，棄上清，加入200 μL PBS重懸得到純化的BMSCs-EVs，-80 ℃保存。

形態(tài)學(xué)分析：將純化后的BMSCs-EVs滴在銅網(wǎng)上，利用透射電鏡(JEM-1230,JEOL)對(duì)BMSCs-EVs進(jìn)行觀測(cè)并拍照。

納米顆粒追蹤分析(NTA)：用粒子矩陣ZetaView PMX 110在405 nm 發(fā)射光下將分離得到的BMSCs-EVs進(jìn)行濃度測(cè)定。

表面特征標(biāo)志物分析：用蛋白質(zhì)印記法檢測(cè)CD63(1∶1 000,Abcam), CD9(1∶1 000,Abcam),TSG101(1∶5 000，Abcam)外泌體標(biāo)志蛋白。

1.4 CHs增殖檢測(cè)

用BMSCs-EVs(20 μg, 40 μg)處理CHs，以無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)CHs作為空白對(duì)照組。培養(yǎng)24 h后，CHs在4%多聚甲醛中固定30 min，5%Triton 100通透20 min, 10%的山羊血清(Boster)封閉60 min,然后4 ℃條件下孵育Ki67(1∶200， Abcam)過夜。PBS洗滌3 次后37 ℃避光孵育二抗(1∶500)30 min。DAPI(Solarbio)染細(xì)胞核5 min。用共聚焦激光掃描顯微鏡(FV1000, Olympus)觀察并拍照。

1.5 CHs遷移能力檢測(cè)

劃痕實(shí)驗(yàn)：將CHs接種于6 孔板中，培養(yǎng)至100%融合， 用1 mL移液器槍頭垂直于孔板劃痕,用PBS清洗劃痕過程中脫落的細(xì)胞，并用光學(xué)顯微鏡(IX71, Olympus)拍照記錄0 h痕跡。加BMSCs-EVs(20 μg, 40 μg)和無(wú)血清培養(yǎng)基(Hyclone)， 24 h后記錄同一劃痕位置下寬度的變化，并計(jì)算劃痕愈合率。

Transwell實(shí)驗(yàn)：在24 孔板中加BMSCs-EVs(20 μg,40 μg)和無(wú)血清培養(yǎng)基， 將軟骨細(xì)胞接種于Transwell上室， 24 h后取出上室，加入4%多聚甲醛固定30 min， 0.1%結(jié)晶紫染色20 min，將小室置于光學(xué)顯微鏡下，拍照并計(jì)算穿過小室膜的細(xì)胞數(shù)目。

1.6 蛋白質(zhì)印記法(Western blot,WB)

使用WB檢測(cè)增殖相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，將CHs接種于6 孔板中，用BMSCs-EVs(20 μg, 40 μg)處理CHs 24 h，以無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)CHs作為空白對(duì)照組。提取CHs蛋白，蛋白通過凝膠電泳(Bio-Rad)被分離,然后移至PVDF膜上，室溫下用5%的脫脂牛奶封閉膜60 min，TBST清洗后加入Cyclin D1(1∶5 000)、Axin 2(1∶1 000)、 β-actin(1∶5 000，Abcam)孵育過夜，TBST清洗3 次，二抗孵育60 min，TBST清洗3 次, 增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光劑顯色，Image J(1.52a)檢測(cè)灰度值。

1.7 BMSCs-EVs的miRNA測(cè)序(miRNA-seq)

使用TruSeqTMRNA樣品制備試劑盒(Illumina)提總RNA，按照TruSeqTMRNA樣品制備指南合成雙末端文庫(kù)。然后用PCR對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行純化和富集，以創(chuàng)建最終的cDNA文庫(kù)。純化文庫(kù)通過Qubit?2.0熒光計(jì)(Life Technologies,美國(guó))進(jìn)行定量，并通過Agilent 2100生物分析儀(Agilent Technologie，美國(guó))進(jìn)行驗(yàn)證，以確認(rèn)插入物大小并計(jì)算摩爾濃度。用cBot生成聚類，稀釋至10 pmol/L，然后在Illumina NovaSeq 6000上進(jìn)行測(cè)序。

利用miRDB數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)高表達(dá)的top20 個(gè)miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)，然后用R包c(diǎn)lusterProfiler、enrichplot、ggplot2對(duì)靶基因進(jìn)行基因本體分析(gene ontology，GO)和京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用Prism 9軟件(GraphPad Prism)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析, Student-t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，當(dāng)P<0.05結(jié)果被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 BMSCs形態(tài)學(xué)觀察及鑒定結(jié)果

原代的BMSCs呈長(zhǎng)梭形，集落性生長(zhǎng)(圖 1A)。經(jīng)過誘導(dǎo)后具有向成骨(圖 1B)、成脂(圖 1C)及成軟骨分化的能力(圖 1D)。流式細(xì)胞鑒定結(jié)果表明，表達(dá) CD29、CD44 的細(xì)胞分別占總細(xì)胞數(shù)的96.1%、95.4%,表達(dá) CD34、CD45的細(xì)胞總細(xì)胞數(shù)占比分別為3.5%、1.8%(圖 1E)，該結(jié)果說明實(shí)驗(yàn)所提取原代BMSCs具有干細(xì)胞特性。

圖 1 體外培養(yǎng)的大鼠BMSCs的鑒定

2.2 BMSCs-EVs的鑒定及內(nèi)吞觀察

透射電鏡結(jié)果顯示，BMSCs-EVs具有典型的雙層膜結(jié)構(gòu)，大小均勻，直徑約150 nm(圖 2A)。囊泡特征標(biāo)記蛋白CD9、CD63和TSG101均有表達(dá)(圖 2B)。NTA提示BMSCs-EVs直徑在175 nm左右(圖 2C),均符合細(xì)胞外囊泡鑒定標(biāo)準(zhǔn)。將BMSCs-EVs與CHs共培養(yǎng)， 24 h后顯示EVs被CHs內(nèi)吞，并分布于細(xì)胞核周圍，證明EVs可成功進(jìn)入CHs內(nèi)(圖 2D)。

圖 2 BMSCs-EVs的鑒定

2.3 BMSCs-EVs對(duì)CHs增殖的影響

用BMSCs-EVs(20 μg， 40 μg)處理CHs, 24 h后用Ki67免疫熒光染色法檢測(cè)BMSCs-EVs對(duì)CHs增殖的影響。結(jié)果如圖 3A示BMSCs-EVs組 CHs增殖數(shù)量較無(wú)血清培養(yǎng)組均明顯增加，并且40 μg BMSCs-EVs組CHs染色陽(yáng)性高于20 μg BMSCs-EVs組，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(圖 3B)。WB結(jié)果表明：與無(wú)血清培養(yǎng)組相比增殖相關(guān)蛋白Cyclin D1，Axin2表達(dá)水平在BMSCs-EVs組均升高(P<0.01)(圖 3C～D)，說明BMSCs-EVs可以促進(jìn)CHs的增殖。

圖 3 CHs增殖活性檢測(cè)

2.4 BMSCs-EVs對(duì)CHs遷移的影響

用劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)BMSCs-EVs(20 μg， 40 μg)對(duì)CHs遷移的影響。 24 h 后20 μg BMSCs-EVs組CHs的劃痕愈合率為85.31%±2.89%， 40 μg BMSCs-EVs組的劃痕愈合率為98.29%±0.70%，無(wú)血清培養(yǎng)組的劃痕愈合率為59.83%±2.79%，明顯低于BMSCs-EVs組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(圖 4A～B)。

使用Transwell法檢測(cè)BMSCs-EVs對(duì)CHs遷移能力的影響。結(jié)晶紫染色結(jié)果(圖 4C)顯示，與無(wú)血清培養(yǎng)組相比，BMSCs-EVs(20 μg， 40 μg)處理CHs，CHs遷移能力增強(qiáng)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(圖 4D)。

圖 4 各組CHs遷移能力比較

2.5 BMSCs-EVs的miRNA分析及生物信息學(xué)分析

miRNA-seq結(jié)果顯示了BMSCs-EVs中總計(jì)數(shù)最高的20 個(gè)高豐度miRNAs(圖 5A),并對(duì)其靶基因進(jìn)行了功能富集分析，KEGG結(jié)果表明基因富集在Wnt信號(hào)通路、細(xì)胞黏附和細(xì)胞周期相關(guān)信號(hào)通路上(圖 5B)。GO分析顯示在生物過程中參與形態(tài)發(fā)生的發(fā)育生長(zhǎng)、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架組織的調(diào)節(jié)顯著(圖 5C)?？傊?，這些結(jié)果表明來自BMSCs-EVs的miRNAs可能參與調(diào)控軟骨細(xì)胞增殖與遷移。

圖 5 BMSCs-EVs的miRNA分析及生物信息分析

3 討 論

在軟骨組織修復(fù)中，單獨(dú)使用自體CHs，單獨(dú)使用BMSCs或兩種細(xì)胞共同培養(yǎng)作為種子細(xì)胞都有過報(bào)道[8]。然而，CHs屬于增殖能力較弱的終末細(xì)胞傳代能力受限；而MSCs定向分化比較復(fù)雜且不穩(wěn)定，分化后的CHs易出現(xiàn)退化和衰老。兩種細(xì)胞共培養(yǎng)目前仍存在一些問題, 共培養(yǎng)的方法、時(shí)間及兩種細(xì)胞的比例均會(huì)影響最終軟骨修復(fù)的效果[9]。

MSCs在各種疾病中的治療應(yīng)用拓寬了人們對(duì)MSCs-EVs的認(rèn)識(shí)。與其親代細(xì)胞相比，MSCs-EVs對(duì)受體組織再生、免疫調(diào)節(jié)和炎癥控制體現(xiàn)了其對(duì)MSCs的功能替代性，而低免疫原性和安全儲(chǔ)存性則賦予它更好的臨床應(yīng)用前景。EVs通過把攜帶的內(nèi)容物傳遞給受體細(xì)胞，進(jìn)而影響細(xì)胞的微環(huán)境并調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白的表達(dá)[10-11]。已有文獻(xiàn)報(bào)道牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的微囊泡調(diào)節(jié)TGF-β1與JAK2-STAT1信號(hào)通路的交互作用發(fā)揮了抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用[12]。角質(zhì)形成細(xì)胞分泌囊泡可以促進(jìn)成纖維細(xì)胞遷移和增殖，從而促進(jìn)傷口愈合[13]。然而BMSCs-EVs是否對(duì)CHs也有同樣積極的作用是解決干細(xì)胞/軟骨細(xì)胞培養(yǎng)缺點(diǎn)的關(guān)鍵。在本研究中通過內(nèi)吞實(shí)驗(yàn)證明BMSCs-EVs可以被CHs內(nèi)化攝取。免疫熒光染色，蛋白印記分析證實(shí)了BMSCs-EVs與CHs共培養(yǎng)后,CHs的增殖能力增強(qiáng)，通過劃痕實(shí)驗(yàn)和遷移實(shí)驗(yàn)證明CHs遷移增強(qiáng)并呈劑量依賴性。miRNA-seq結(jié)果展示BMSCs-EVs攜帶大量miRNA，對(duì)這些miRNA靶基因功能富集分析后KEGG結(jié)果表明基因富集在Wnt信號(hào)通路。而Wnt信號(hào)通路是影響細(xì)胞增殖的重要通路[14]。本研究結(jié)果表明，BMSCs-EVs可能通過釋放miRNA調(diào)節(jié)CHs的遷移和增殖。但目前尚不清楚哪些miRNA發(fā)揮了核心作用。后續(xù)要進(jìn)一步明確BMSCs-EVs促進(jìn)CHs遷移和增殖的具體信號(hào)通路和明確的分子靶點(diǎn)，并增加動(dòng)物模型進(jìn)行驗(yàn)證。

綜上所述,BMSCs-EVs可促進(jìn)CHs的增殖與遷移,進(jìn)而可能有利于共移植軟骨細(xì)胞及組織的再生,有望為組織工程軟骨再生提供新思路。