常裕紳，張子鳴，李振宇，安 娟，何瀚威，匡建軍

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis, OP)是一種系統(tǒng)性代謝性骨病，其特點(diǎn)是骨量低、骨微結(jié)構(gòu)被破壞、同時(shí)成骨不全增加，容易發(fā)生骨折[1]。隨著我國(guó)人口老齡化日益嚴(yán)重， OP已成為威脅中老年人群的最大健康問(wèn)題，并且骨質(zhì)疏松性骨折相關(guān)的醫(yī)療活動(dòng)給社會(huì)衛(wèi)生保健系統(tǒng)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。目前對(duì)于OP相關(guān)疾病的研究主要集中在內(nèi)分泌、免疫、消化系統(tǒng)領(lǐng)域，其中炎癥性腸病(inflammatory bowel disease, IBD)是不容忽視的重要一環(huán)。IBD是一種慢性腸道炎癥性疾病，主要包括潰瘍性結(jié)腸炎和Crohn病。有報(bào)道，IBD患者同時(shí)患有OP的概率為18%～42%，IBD骨質(zhì)疏松患者骨折風(fēng)險(xiǎn)比正常人高1.4倍[2]。因此二者在臨床上包括發(fā)病機(jī)制、致病因素、易發(fā)人群的內(nèi)在關(guān)聯(lián)性受到越來(lái)越多的關(guān)注。有研究顯示，IBD相關(guān)OP的發(fā)生發(fā)展與眾多因素關(guān)系密切，最常見(jiàn)的是胃腸道持續(xù)慢性感染、腸道菌群失調(diào)、鈣和維生素D吸收障礙等[3-4]，然而，其發(fā)病機(jī)制至今尚未明確，很少有IBD患者能及早接受適當(dāng)?shù)目构琴|(zhì)疏松治療。因此本研究通過(guò)生物信息學(xué)方法分析并闡述OP與IBD的基因相關(guān)性，并為相關(guān)治療藥物的研發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1數(shù)據(jù)收集 從DisGeNET、TTD、GeneCards及OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)分別以“Osteoporosis”和“Inflammatory bowel disease”為關(guān)鍵詞查詢(xún)疾病相關(guān)靶點(diǎn)。其中DisGeNET篩選評(píng)分≥0.1，GeneCards篩選相關(guān)度≥10。整合各數(shù)據(jù)庫(kù)的基因后進(jìn)行去重，去重后的基因通過(guò)R 4.2.0軟件“RSQLite”“BiocManager”包轉(zhuǎn)換成entrez ID，獲得疾病兩組基因靶點(diǎn)。

1.2蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和關(guān)鍵基因的篩選 將兩組靶點(diǎn)導(dǎo)入在線(xiàn)網(wǎng)站Venny 2.1.0取交集繪制韋恩圖，得到OP與IBD間的共病靶點(diǎn)，將共病靶點(diǎn)借助string平臺(tái)(https://string-db.org/)制作PPI網(wǎng)絡(luò)，以最低交互分?jǐn)?shù)0.7篩選，保存.tsv文件，將表格數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2軟件實(shí)現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)可視化，應(yīng)用cytoHubba插件中的最大團(tuán)體中心(MCC)算法，從而獲得調(diào)控OP與IBD的關(guān)鍵基因。

1.3GO功能及KEGG通路富集分析 將“1.2”中共病靶點(diǎn)通過(guò)R軟件的“DOSE”“clusterProfiler”“pathview”程序包，篩選條件為P<0.05，Q<0.05，進(jìn)行GO功能富集和KEGG通路富集分析。

1.4關(guān)鍵基因的miRNA基因網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將獲得的關(guān)鍵基因借助網(wǎng)絡(luò)分析工具Networkanalyst預(yù)測(cè)關(guān)聯(lián)miRNA，并繪制miRNA基因關(guān)系網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié)果

2.1疾病基因搜集 經(jīng)DisGeNET、TTD、GeneCards及OMIM疾病數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，整合各數(shù)據(jù)庫(kù)的重復(fù)靶點(diǎn)，獲得與“OP”和“IBD”相關(guān)靶點(diǎn)分別為1779和2779個(gè)，可見(jiàn)每種疾病的作用靶點(diǎn)龐大，調(diào)控機(jī)制復(fù)雜。

2.2PPI的構(gòu)建和關(guān)鍵基因篩選 通過(guò)韋恩圖獲得共病靶點(diǎn)869個(gè)(23.6%)，說(shuō)明OP與IBD間確實(shí)存在相似作用機(jī)制。依托string數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖，以“high confidence(0.700)”為篩選標(biāo)準(zhǔn)得到的網(wǎng)絡(luò)圖中具有756個(gè)節(jié)點(diǎn)，8353條相互作用連線(xiàn)，說(shuō)明靶點(diǎn)間協(xié)同發(fā)生諸多調(diào)控作用。通過(guò)Cytoscape中cytoHubba插件分析PPI網(wǎng)絡(luò)，根據(jù)MCC算法，認(rèn)為前10個(gè)基因是關(guān)鍵基因，以顏色變化代表基因的關(guān)鍵程度，分別為IL6、IL10、IL17A、TNF、CSF2、IL4、IL1B、CXCL8、IFNG、IL13。見(jiàn)圖1。

2.3GO功能及KEGG通路富集分析 將共病靶基因?qū)隦軟件，獲得4278項(xiàng)GO富集結(jié)果及173條KEGG信號(hào)通路。取各富集結(jié)果前10個(gè)條目以氣泡圖顯示，見(jiàn)圖2。

圖2 OP與IBD共病靶基因GO功能及KEGG通路富集分析氣泡圖

2.4關(guān)鍵基因miRNA網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 Networkanalyst預(yù)測(cè)關(guān)鍵基因關(guān)聯(lián)的miRNA，通過(guò)Cytoscape 3.8.2軟件構(gòu)建了由83個(gè)節(jié)點(diǎn)和104條邊組成的基因-miRNA網(wǎng)絡(luò)(圖3)。IL6、IL10、CXCL8能與miR-106a-5p和miR-98-5p相互作用，miR-24-3p能與TNF、IL4、IFNG、IL1B基因相互作用，miR-335-5p能與IL6、CXCL8、IL4、IL17A基因相互作用。

圖3 OP與IBD關(guān)鍵基因-miRNA網(wǎng)絡(luò)

3 討論

OP是一種全身性骨病，破骨細(xì)胞骨吸收超過(guò)成骨細(xì)胞骨形成導(dǎo)致骨量減少是OP發(fā)生的關(guān)鍵[5]。目前研究發(fā)現(xiàn)一些胃腸道疾病與骨質(zhì)減少關(guān)系密切，包括IBD、乳糜瀉和結(jié)直腸癌。IBD是OP一大誘發(fā)因素，到目前為止，IBD和OP間的相關(guān)機(jī)制尚不完全清楚。因此，探索IBD和OP的分子機(jī)制用于早期識(shí)別與干預(yù)具有重要的臨床意義。

本研究采用生物信息學(xué)方法闡述IBD與OP間分子機(jī)制的相關(guān)性。PPI網(wǎng)絡(luò)分析得到了IL6、IL10、IL17A、TNF、CSF2、IL4、IL1B、CXCL8、IFNG、IL13這10個(gè)核心靶點(diǎn)，IBD與炎性因子的關(guān)系已有報(bào)道，IL6、IL1B、IL17A和TNF-α都是促炎因子，而IFN-γ、IL10、IL4、IL13為抗炎因子，是由巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞等免疫細(xì)胞合成和分泌，單獨(dú)或共同參與自身免疫性和炎癥性疾病。

有研究發(fā)現(xiàn)，IL6、IL1、IL17、TNF-α和NF-κB在IBD患者腸道黏膜中大量表達(dá)，多種促炎因子不斷發(fā)生級(jí)聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)一步加重腸組織微循環(huán)障礙[4]?？筎NF-α制劑現(xiàn)已納入治療IBD的常用藥物。有研究表明，抗TNF-α制劑可以改善IBD患者骨代謝及骨密度[6]。此外，OP患者體內(nèi)IL1、IL6、TNF-α和IL17水平較正常人群也顯著升高，促炎因子可通過(guò)促進(jìn)NF-κB受體活化因子(RANK)和(或)通過(guò)抑制骨保護(hù)素(OPG)的表達(dá)增強(qiáng)其對(duì)NF-κB受體活化因子配體(RANKL)的敏感性[7]，增加破骨細(xì)胞活性，促進(jìn)骨吸收，打破骨代謝平衡來(lái)加重OP，而IFN-γ、IL10、IL4等抗炎因子能夠顯著抑制破骨細(xì)胞生成，抑制骨吸收[8]。RANK-RANKL-OPG軸是OP的關(guān)鍵調(diào)節(jié)通路，這些細(xì)胞因子通過(guò)該途徑共同發(fā)揮骨吸收和骨形成的作用。ZHANG等[9]研究發(fā)現(xiàn)，健脾清腸補(bǔ)腎煎劑可通過(guò)抑制結(jié)腸黏膜炎癥，促進(jìn)黏膜愈合，抑制該信號(hào)軸的激活達(dá)到抗骨質(zhì)疏松的目的。CSF是集落刺激因子，可促進(jìn)巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、嗜酸粒細(xì)胞、腸上皮細(xì)胞和樹(shù)突細(xì)胞的活化[10]，其中粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)可以改善腸黏膜損傷和炎癥反應(yīng)，調(diào)節(jié)腸道免疫功能，有研究顯示，缺乏GM-CSF的小鼠更易出現(xiàn)非甾體抗炎藥導(dǎo)致的腸道炎癥反應(yīng)[11]。同時(shí)GM-CSF在破骨細(xì)胞生成和發(fā)育方面起關(guān)鍵作用，可以結(jié)合破骨細(xì)胞前體上的受體(c-Fms)更有利于破骨細(xì)胞的存活與成熟[8]。CXCL8又稱(chēng)IL8，是一種趨化因子，主要由巨噬細(xì)胞、上皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞分泌，其可以誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞隨著腸上皮細(xì)胞IL8表達(dá)的升高而被吸引到腸黏膜的炎癥部位積聚和活化，加重炎癥反應(yīng)[12]。IL8在骨代謝方面還具有雙重效應(yīng)，一方面是通過(guò)促進(jìn)甲狀旁腺激素的生成刺激破骨細(xì)胞分化，增加骨吸收，有研究發(fā)現(xiàn)絕經(jīng)后OP患者體內(nèi)血清IL8水平變化與骨密度呈負(fù)相關(guān)[13]。另一方面，也有學(xué)者認(rèn)為IL8能夠通過(guò)缺氧誘導(dǎo)因子-1α通路促進(jìn)骨形成從而抑制OP進(jìn)程[14]。

GO功能和KEGG通路富集分析能夠使共表達(dá)基因間的作用關(guān)系更加清晰。GO分析主要富集于細(xì)胞因子生成的調(diào)節(jié)、炎性因子的調(diào)節(jié)和信號(hào)傳導(dǎo)受體激活劑活性方面，說(shuō)明OP與IBD間的關(guān)系與免疫和炎癥密切相關(guān)，這與大部分研究結(jié)果一致。KEGG富集主要與細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、PI3K-Akt、脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化、Th17細(xì)胞分化等特異性信號(hào)通路有關(guān)。而這些通路作用途徑不僅參與免疫炎癥過(guò)程，而且還與動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)的心血管疾病有關(guān)[15]，這些結(jié)果或許能提供一個(gè)新觀(guān)點(diǎn):IBD骨質(zhì)疏松患者也更容易患有心血管疾病。

對(duì)核心靶點(diǎn)預(yù)測(cè)相關(guān)miRNA發(fā)現(xiàn)，miR-98-5p、miR-335-5p、miR-24-3p和miR-106a-5p可能對(duì)于IBD誘發(fā)OP的診治具有潛在價(jià)值。有研究表明，miR-98-5p通過(guò)靶向酪蛋白激酶2相互作用蛋白-1促進(jìn)小鼠胚胎成骨細(xì)胞前體細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化[16]，同時(shí)miR-98-5p的下調(diào)能夠增加Trib1蛋白表達(dá)改變了巨噬細(xì)胞對(duì)M2表型的極化，從而緩解了IBD癥狀[17]。而miR-335-5p具有調(diào)節(jié)小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞軟骨分化和促進(jìn)軟骨生成的能力，同時(shí)通過(guò)靶向HBP1基因和促進(jìn)軟骨細(xì)胞凋亡來(lái)介導(dǎo)骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病[18]。且miR-335-5p調(diào)節(jié)連接IBD和結(jié)腸癌促炎因子的表達(dá)，從而作為結(jié)腸癌的生物標(biāo)志物[19]。miR-24-3p可與lncRNA:LEF1-AS1相互作用，通過(guò)調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin和TGF-β/BMP途徑來(lái)介導(dǎo)成骨[20]。同時(shí)miR-24-3p還是2型糖尿病的臨床生物標(biāo)志物[21]，而諸多研究表明2型糖尿病可能損害骨基質(zhì)形成和生化能力，從而降低骨骼韌性，引發(fā)骨質(zhì)疏松，增加骨折風(fēng)險(xiǎn)[22-24]。有研究表明，miR-106a-5p通過(guò)介導(dǎo)GAS5來(lái)控制和維持糖皮質(zhì)激素敏感性和耐藥性，從而達(dá)到抗炎的目的[25]，且miR-106a-5p能夠作為阿爾茲海默癥(AD)與帕金森癥的臨床生物標(biāo)志物[26]。有學(xué)者認(rèn)為OP與AD作為老年常見(jiàn)疾病有著共通的關(guān)系[27]，存在共同致病因素并促進(jìn)兩病的發(fā)展[28-29]。目前研究表明，miR-98-5p、miR-335-5p與OP及IBD有關(guān)，證實(shí)其能夠影響OP及IBD的發(fā)生及發(fā)展，或許通過(guò)進(jìn)一步的研究能夠發(fā)現(xiàn)這兩種miRNA是改善OP與IBD的藥物或治療手段。而miR-24-3p與miR-106a-5p目前與OP及IBD具有一定的關(guān)聯(lián)但缺乏強(qiáng)相關(guān)性的文獻(xiàn)報(bào)道，因此具有潛在的研究?jī)r(jià)值。

綜上所述，本研究通過(guò)生物信息學(xué)方法探討了OP與IBD共病調(diào)控的關(guān)鍵基因，發(fā)現(xiàn)炎癥通路的激活或許是兩病的共同病因，同時(shí)篩選了關(guān)鍵靶向的4個(gè)miRNA可能作為治療IBD和OP的新手段。