劉江文 楊雙 唐艷紅 黃從新

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院心內(nèi)科 武漢大學(xué)心血管病研究所 心血管病湖北省重點實驗室，湖北 武漢 430060)

完全性房室傳導(dǎo)阻滯和病態(tài)竇房結(jié)綜合征等緩慢性心律失常是臨床上常見的心律失常疾病，電子起搏器仍然是這類疾病的主要治療方式。雖然電子起搏器功能越來越強(qiáng)大，體積越來越小，但它仍存在很多缺點，例如術(shù)后感染、電池壽命有限、導(dǎo)線容易脫落以及缺乏生理反應(yīng)性[1]。這些不足之處都限制電子起搏器成為治療這些疾病的最理想的方法，科學(xué)家們開始尋找符合正常人體生理的生物起搏器，生物起搏能克服當(dāng)前電子起搏器存在的缺點，更加符合人體正常的生理狀態(tài)。生物起搏指通過干細(xì)胞基因調(diào)控、基因過表達(dá)或抑制等方法來構(gòu)建出類似“竇房結(jié)”的結(jié)構(gòu)，以此來治療緩慢性心律失常。當(dāng)前構(gòu)建生物起搏細(xì)胞的方法主要是單基因、多基因聯(lián)合以及信號通路調(diào)控等，選擇一項適合的調(diào)控方法對于成功構(gòu)建生物起搏器至關(guān)重要。

1 竇房結(jié)發(fā)育過程涉及的基因

竇房結(jié)自干細(xì)胞分化開始到具有正常功能的起搏細(xì)胞涉及一系列基因表達(dá)和沉默。目前普遍接受涉及竇房結(jié)調(diào)控表達(dá)的基因有Shox2、Tbx3、Tbx18、Pitx2、Nkx2.5、Isl-1和HCN通道等，不同的基因在竇房結(jié)發(fā)育的不同階段發(fā)揮著不同的作用。當(dāng)前生物起搏中廣泛研究的基因有Tbx、HCN和Shox2，而其他生物起搏相關(guān)基因(Pitx2、Nkx2.5和Isl-1)的研究仍然匱乏。Tbx家族有一系列同源因子，如Tbx1、Tbx3、Tbx5和Tbx18等，不同的因子在心臟發(fā)育過程中發(fā)揮不同的作用，目前在生物起搏中研究較多的是Tbx3和Tbx18。Tbx3基因位于染色體12q24.1上，同源基因位于5號染色體，全長為9.0 kb，在進(jìn)化上具有高度保守性，在胚胎形成時期多個組織及器官均有表達(dá)[2]。Tbx18是與心外膜器官發(fā)育相關(guān)的Tbx1亞家族成員，在心外膜、中胚層和體節(jié)前半部分等結(jié)構(gòu)均有表達(dá)[3]。Tbx18參與竇房結(jié)頭部的發(fā)育，但并不影響竇房結(jié)尾部的功能，而Tbx3不影響竇房結(jié)的形態(tài)發(fā)育，但對竇房結(jié)的功能具有重要的影響[4]。胰島素樣生長因子-1是第二心臟區(qū)未分化的心臟祖細(xì)胞的分子標(biāo)志，對促進(jìn)心臟發(fā)育和分化起著非常重要的作用[5]。有研究[6]發(fā)現(xiàn)Isl-1基因敲除的鼠胚在第9.5天停止心臟發(fā)育或出現(xiàn)心臟嚴(yán)重畸形。Shox2對于竇房結(jié)的發(fā)育和正常結(jié)構(gòu)的形成必不可少，研究[7]表明在Shox2基因缺乏或突變的大鼠胚胎中會導(dǎo)致嚴(yán)重竇房結(jié)和竇瓣發(fā)育不良及起搏細(xì)胞的分化失敗。Shox2過表達(dá)能促進(jìn)Isl-1的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)與竇房結(jié)相關(guān)基因如Tbx3和HCN4等的表達(dá)，從而促進(jìn)干細(xì)胞向竇房結(jié)細(xì)胞的分化[8]。此外Hashem等[9]研究表明，Shox2基因敲除會導(dǎo)致胚胎產(chǎn)生緩慢的收縮頻率。竇房結(jié)細(xì)胞區(qū)別于心房和心室肌細(xì)胞的一個重要特征是4期自動去極化，其中If電流(也稱“有趣電流”，起搏特征電流)是導(dǎo)致4期自動去極化的關(guān)鍵，If電流主要由HCN4基因決定。HCN家族有4個成員，分別是HCN1、HCN2、HCN3和HCN4。在哺乳動物心臟中主要存在的是HCN1、HCN2和HCN4，未檢測到HCN3的表達(dá)[10]。有研究[11]表明HCN4通道貢獻(xiàn)了竇房結(jié)約70%的If電流，是最主要的組成部分。此外，與HCN1相比，HCN2和HCN4都對環(huán)磷酸腺苷具有較強(qiáng)的反應(yīng)性，但HCN2對環(huán)磷酸腺苷的反應(yīng)更加敏感[12]。

目前生物起搏主要通過起搏細(xì)胞的移植來實現(xiàn)。而生物起搏細(xì)胞可利用慢病毒或腺病毒載體構(gòu)建過表達(dá)上述如Tbx3、Shox2和HCN4等竇房結(jié)調(diào)控基因的載體轉(zhuǎn)染干細(xì)胞，從而調(diào)控干細(xì)胞在分化為心肌細(xì)胞的過程中分化為起搏細(xì)胞[13]。起搏細(xì)胞的鑒定則通過觀察心肌細(xì)胞搏動頻率，檢測If電流及竇房結(jié)發(fā)育相關(guān)標(biāo)志基因的表達(dá)獲得[14]。獲得的起搏細(xì)胞主要通過左心室游離壁注射以進(jìn)行體內(nèi)驗證，體外光學(xué)標(biāo)測顯示注射位點的自發(fā)搏動則證明移植的細(xì)胞存活并發(fā)揮了作用[15]。而在此之前，起搏細(xì)胞的獲得及調(diào)控方法則顯得更為重要。

2 單基因表達(dá)構(gòu)建生物起搏細(xì)胞

通過單基因表達(dá)來構(gòu)建生物起搏細(xì)胞是長久以來使用最為廣泛的方法。目前廣泛研究的單基因主要有Shox2、Tbx18和Tbx3。干細(xì)胞在分化過程中能產(chǎn)生心房肌細(xì)胞、心室肌細(xì)胞和竇房結(jié)細(xì)胞。有研究[16]表明，在胚胎干細(xì)胞分化的擬胚體中，用腺病毒構(gòu)建人Shox2基因表達(dá)載體轉(zhuǎn)染能提高干細(xì)胞向竇房結(jié)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率，檢測結(jié)果顯示Shox2組起搏細(xì)胞比例(61.9%)顯著高于對照組(26.1%)。同時，起搏細(xì)胞標(biāo)志物如HCN4、縫隙連接蛋白(connexin，Cx)45以及細(xì)胞自發(fā)收縮頻率在Shox2組也明顯高于對照組，且Shox2組對異丙腎上腺素和乙酰膽堿具有更好的反應(yīng)性。同樣，Kapoor等[17]通過腺病毒構(gòu)建過表達(dá)Tbx18的載體并轉(zhuǎn)染新生大鼠心室肌細(xì)胞(neonatal rat ventricular myocyte，NRVM)，成功誘導(dǎo)出具有起搏功能的細(xì)胞，將誘導(dǎo)分化而來的起搏細(xì)胞與正常細(xì)胞進(jìn)行比較，可發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞形態(tài)、電生理特性、表觀遺傳學(xué)以及對激素的反應(yīng)等方面均具有高度相似性。研究者將轉(zhuǎn)染Tbx18的NRVM組(Tbx18-NRVMs)與轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白的NRVM組(GFP-NRVMs)比較，發(fā)現(xiàn)與心房、心室肌細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志的mRNA和蛋白表達(dá)水平如Cx43、Kir2.1和Actc2在Tbx18實驗組中明顯下降，同時Tbx18-NRVMs組細(xì)胞跳動頻率[(95±23)次/min]明顯高于GFP-NRVMs組[(46±10)次/min]。而在此之前，Bakker等[18]研究表明Tbx3能讓終末分化的心室肌細(xì)胞重編程為起搏細(xì)胞，這項研究通過轉(zhuǎn)基因構(gòu)建攜帶“Cre可誘導(dǎo)的Tbx3表達(dá)構(gòu)建體(CT3)”，然后通過他莫昔芬誘導(dǎo)攜帶CT3的小鼠產(chǎn)生Tbx3，通過檢測Cx40、Cx43、NaV1.5和Kir基因的表達(dá)情況，在Tbx3誘導(dǎo)組中檢測到起搏細(xì)胞的生成。以上實驗結(jié)果均表明單基因過表達(dá)構(gòu)建生物起搏細(xì)胞的可行性。

3 聯(lián)合基因轉(zhuǎn)染構(gòu)建生物起搏細(xì)胞

過去幾十年，絕大部分的研究都集中在與竇房結(jié)發(fā)育相關(guān)的單基因研究，但近年來通過聯(lián)合基因轉(zhuǎn)染來構(gòu)建生物起搏細(xì)胞的方法逐漸興起。聯(lián)合基因轉(zhuǎn)染指同時將兩個或多個與竇房結(jié)發(fā)育相關(guān)的基因同時轉(zhuǎn)入干細(xì)胞中，使干細(xì)胞能分化為起搏細(xì)胞。其中涉及竇房結(jié)發(fā)育的相關(guān)基因多種多樣，因而也就產(chǎn)生了不同的聯(lián)合基因轉(zhuǎn)染方式。

3.1 Isl-1和Tbx18聯(lián)合轉(zhuǎn)染

雖然有研究[19-20]表明將過表達(dá)的Isl-1或Tbx18基因單獨導(dǎo)入干細(xì)胞均能誘導(dǎo)其分化為起搏細(xì)胞，但存在起搏細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率低下，起搏細(xì)胞與正常竇房結(jié)細(xì)胞功能存在差距等問題。為了尋找能提高干細(xì)胞轉(zhuǎn)化為竇房結(jié)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率的方法，Zhang等[21]將過表達(dá)的Isl-1和Tbx18慢病毒與8 μg/mL聚凝胺混合轉(zhuǎn)染脂肪源性干細(xì)胞，7 d后收集轉(zhuǎn)染細(xì)胞并進(jìn)行生物起搏功能及標(biāo)記基因的檢測。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，無論是與If電流相關(guān)的HCN基因表達(dá)情況，還是在細(xì)胞的自律性方面，Isl-1和Tbx18基因聯(lián)合組均較任何單一基因轉(zhuǎn)染組高，這表明二者聯(lián)合轉(zhuǎn)染干細(xì)胞比單一基因轉(zhuǎn)染干細(xì)胞能得到更高的轉(zhuǎn)化率。

3.2 Tbx3和HCN2聯(lián)合轉(zhuǎn)染

Tbx3在小鼠的胚胎發(fā)育中扮演著重要的作用。Boogerd等[22]發(fā)現(xiàn)斑馬魚在轉(zhuǎn)染Tbx3時，能顯著抑制傳導(dǎo)性較強(qiáng)的Cx40和Cx43的表達(dá)，這與Zhao等[23]的研究結(jié)果一致。在人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞過表達(dá)Tbx3能使Cx40、Cx43和SCN5A(心房細(xì)胞和心室細(xì)胞相關(guān)基因標(biāo)志)表達(dá)減少，而Cx45和Cx30.2(竇房結(jié)細(xì)胞相關(guān)基因標(biāo)志)表達(dá)增加，但通過全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)并未檢測到If電流的表達(dá)。另一項研究利用腺病毒構(gòu)建過表達(dá)的Tbx3和HCN2基因載體，并在人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化的過程中加入該病毒載體共培養(yǎng)，5 d后收集細(xì)胞進(jìn)行電生理檢測。膜片鉗技術(shù)可檢測到If電流的表達(dá)，同時與Tbx3和HCN2基因單獨轉(zhuǎn)染相比，Tbx3和HCN2聯(lián)合轉(zhuǎn)染的細(xì)胞表現(xiàn)出了更快的收縮頻率，這表明干細(xì)胞成功轉(zhuǎn)化為起搏細(xì)胞[24]，這也提示Tbx3和HCN2基因聯(lián)合轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)的起搏細(xì)胞具有更加完善的生物學(xué)功能。

3.3 Shox2、HCN2和Tbx5聯(lián)合轉(zhuǎn)染

Raghunathan等[25]將慢病毒構(gòu)建的Shox2、HCN2和Tbx5三個基因表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)入心臟祖細(xì)胞將其誘導(dǎo)分化為起搏細(xì)胞，最終在誘導(dǎo)的細(xì)胞中未檢測到起搏器特異性靶基因(Cx30.2、KCNN4和Tbx3)的表達(dá)升高，但利用四環(huán)素控制的轉(zhuǎn)錄激活共同誘導(dǎo)三者來調(diào)節(jié)它們在心肌祖細(xì)胞中的瞬時表達(dá)時，以上指標(biāo)相對于單基因轉(zhuǎn)染的細(xì)胞表達(dá)水平明顯升高。此外，聯(lián)合轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)的起搏細(xì)胞表現(xiàn)出強(qiáng)烈的HCN4電流，而這是起搏細(xì)胞的特征電流。轉(zhuǎn)錄組學(xué)也表現(xiàn)出聯(lián)合轉(zhuǎn)染的細(xì)胞表達(dá)豐富的起搏特異性基因及特異性鉀和鈣通道(KCND2、KCNK2和CACNB1)，結(jié)果表明聯(lián)合基因轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)的起搏細(xì)胞具有更加完善的生物學(xué)功能。

4 信號通路調(diào)控構(gòu)建生物起搏細(xì)胞

目前發(fā)現(xiàn)與竇房結(jié)發(fā)育有關(guān)的信號通路主要有Wnt信號通路和骨形態(tài)生成蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)信號通路[26-27]，通過藥物干預(yù)這兩條信號通路能調(diào)控干細(xì)胞向竇房結(jié)樣細(xì)胞分化。Wnt信號通路包括經(jīng)典Wnt信號通路和非經(jīng)典的Wnt信號通路[28]，在竇房結(jié)的發(fā)育過程中經(jīng)典Wnt信號通路發(fā)揮正向的調(diào)控作用。BMP屬于轉(zhuǎn)化生長因子β超家族并擁有20個以上的亞族成員。大量研究[29]表明BMP在胚胎早期發(fā)育中具有關(guān)鍵作用，例如BMP2基因敲除的大鼠會在心管形成后死亡，BMP5和BMP7同時敲除的大鼠胚胎會在第10.5天死亡[30]。最近的一項研究[31]表明經(jīng)典的Wnt信號通路(Wnt/β-catenin信號通路)使得心臟中胚層祖細(xì)胞向起搏細(xì)胞分化而抑制其向心房和心室肌細(xì)胞分化。在Flk1+/PdgfR-α+細(xì)胞分化的第3周，移除Wnt信號通路的天然抑制劑Dkk1能明顯增加Shox2、Tbx18和HCN4的表達(dá)以及Tbx3和HCN4陽性細(xì)胞的比例。同時加入Wnt信號通路激動劑Wnt3a可進(jìn)一步增加Shox2、Tbx18和HCN4的表達(dá)水平，而Nkx2.5的表達(dá)水平明顯下降，這與Wnt信號通路能抑制Nkx2.5的祖細(xì)胞分化為起搏細(xì)胞的研究一致[32]。此外，調(diào)控Wnt信號通路能提高人胚胎干細(xì)胞分化為起搏細(xì)胞的效率[33]，BMP信號通路也被發(fā)現(xiàn)有類似的效應(yīng)。Protze等[34]將BMP信號通路誘導(dǎo)劑BMP4加入人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞中誘導(dǎo)分化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BMP4誘導(dǎo)產(chǎn)生的起搏細(xì)胞能表達(dá)Tbx3，而未檢測到心室肌標(biāo)志物MLC2V和Nkx2.5的表達(dá)。之后將獲得的起搏細(xì)胞轉(zhuǎn)入大鼠心臟中發(fā)現(xiàn)能產(chǎn)生異位節(jié)律，這表明通過BMP信號通路誘導(dǎo)劑成功誘導(dǎo)出起搏細(xì)胞。有趣的是，只有在胚胎分化的第3天加入BMP4才能最大效率地誘導(dǎo)起搏細(xì)胞產(chǎn)生，在分化第2天或第4天加入都會導(dǎo)致起搏細(xì)胞產(chǎn)生效率變低，這表明BMP信號通路只在特定的時間發(fā)揮關(guān)鍵作用。BMP在低濃度能促進(jìn)人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化為竇房結(jié)樣細(xì)胞，但高濃度時誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化效率變低[35]。因而在通過調(diào)節(jié)信號通路獲得起搏細(xì)胞時，要特別注意信號通路調(diào)節(jié)藥物使用的時間和劑量，只有這樣才能最大效率地獲得起搏細(xì)胞。

5 總結(jié)與展望

目前為止，大部分研究都集中在單基因誘導(dǎo)起搏細(xì)胞的相關(guān)研究，但近年來多基因聯(lián)合誘導(dǎo)干細(xì)胞分化也逐漸受到人們的重視，目前對這方面的研究還很缺乏。竇房結(jié)的發(fā)育涉及一系列基因的作用，多個基因同時誘導(dǎo)生成的起搏細(xì)胞會更加符合竇房結(jié)的正常發(fā)育過程。但由于病毒載體只能攜帶一定長度的基因，聯(lián)合轉(zhuǎn)染對病毒載體提出了更高的要求。目前通過信號通路來構(gòu)建生物起搏細(xì)胞能克服病毒載體，會損害正常細(xì)胞，以及部分基因轉(zhuǎn)染時會導(dǎo)致轉(zhuǎn)染細(xì)胞死亡等問題[36]。雖然可通過多種方法調(diào)控干細(xì)胞分化為起搏細(xì)胞，如本文所述的有單基因表達(dá)、聯(lián)合基因轉(zhuǎn)染和信號通路的調(diào)控，但目前獲得的起搏細(xì)胞和正常的竇房結(jié)細(xì)胞特性之間存在一定的差距。同時干細(xì)胞存在多向分化潛能，定向分化為起搏細(xì)胞的效率仍然較為低下。未來仍需努力克服這些問題來高效率獲取正常生理功能的起搏細(xì)胞，為生物起搏細(xì)胞的在體研究打下堅實基礎(chǔ)，并最終克服電子起搏器的缺陷而進(jìn)入臨床。