李振雨，周湘媛，馬懿飛，何民友， 劉曉霞，陳向東，孫冬梅,3,4，羅文匯,3,4

1廣東一方制藥有限公司；2廣東省中藥配方顆粒企業(yè)重點實驗室，佛山 528244； 3江西一方天江藥業(yè)有限公司，南昌 330000；4湖南一方天江藥業(yè)有限公司，常德 415000

中藥標準湯劑是以中藥飲片為原料，參考傳統(tǒng)中藥湯劑煎煮習慣，以水為溶劑，采用標準化的煎藥模式制備得到的單味中藥飲片水煎液。中藥標準湯劑作為一種標準物質或標準體系，常用于標化中藥臨床用藥，規(guī)范中藥配方顆粒等新型中藥飲片在臨床上的使用，從而保障中藥臨床用藥的準確性[1]。因此，通過建立中藥標準湯劑的質量標準，能夠為相應的中藥配方顆粒及經典名方等現(xiàn)代中藥制劑質量標準的建立提供重要參考。

白茅根為禾本科植物白茅ImperatacylindricaBeauv.var.major(Nees) C.E.Hubb.的干燥根莖，具有涼血止血，清熱利尿的作用[2]?，F(xiàn)代研究表明，白茅根含有三萜、黃酮、有機酸、苯丙素、內酯、甾醇等多種化學成分[3]，具有止血、利尿、鎮(zhèn)痛、抑菌、抗炎、抗氧化、降血壓、保肝、調節(jié)機體免疫等多種藥理活性[4,5]。2020年版《中國藥典》白茅根藥材項下質量標準缺乏含量指標，現(xiàn)行的質量標準難以較全面反映白茅根的內在質量。已有的研究報道，多采用指紋/特征圖譜結合綠原酸含量測定對白茅根進行質量控制[6-8]，尚未見到指紋圖譜結合多指標成分的定量研究。研究表明，中藥中的酚酸類成分具有抗炎、抑菌、抗氧化、抗腫瘤等作用，是極具研究價值和應用潛力的天然活性產物[9]。白茅根中含有較多的酚酸類成分[10]，其抗炎、抑菌、抗氧化等藥理活性與白茅根功能主治密切相關[11]，因此，本次研究通過建立白茅根標準湯劑UPLC指紋圖譜并首次實現(xiàn)對標準湯劑中綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸和對羥基肉桂酸含量的同時測定，結合化學計量學分析方法，為不同產區(qū)的白茅根標準湯劑質量評價提供依據(jù)。

1 儀器、試劑與試藥

1.1 儀器

Waters高效液相色譜儀(H-Class，沃特世公司)；Waters CORTECS T3 C18(2.1 mm×150 mm，1.6 μm)色譜柱；百分之一電子分析天平(JJ600，常熟市雙杰測試儀器廠)；萬分之一電子分析天平(ME204E，梅特勒-托利多公司)；百萬分之一電子分析天平(XP26，梅特勒-托利多公司)；數(shù)控超聲波清洗器(KQ500DE，昆山市超聲儀器有限公司)；超純水系統(tǒng)(Milli-Q Direct默克股份有限公司)。

1.2 試劑與試藥

試劑：乙醇(廣東光華科技股份有限公司，分析純)；甲醇(廣東光華科技股份有限公司，分析純)；磷酸(天津市科密歐化學試劑有限公司，色譜純)；甲醇(默克股份有限公司，色譜純)；水為超純水。

試藥：綠原酸(中國食品藥品檢定研究院，批號：110753-201716，含量：99.3%)；新綠原酸(四川省維克奇生物科技有限公司，批號：wkq21083002，含量：96.7%)；隱綠原酸(成都樂天美醫(yī)藥科技有限公司，批號：DST210427-035，含量：99.1%)；對羥基肉桂酸(成都普菲德生物技術有限公司，批號：21001401，含量：99.8%)。

1.3 樣品

實驗所用18批白茅根藥材由廣東一方制藥有限公司采購管理部于產地購買和收集，產地信息見表1所示，經廣東一方制藥有限公司孫冬梅主任中藥師鑒定為禾本科植物白茅ImperatacylindricaBeauv.var.major(Nees) C.E.Hubb.的干燥根莖，并經廣東一方制藥有限公司質量中心檢定合格，均符合2020年版《中國藥典》(一部)白茅根藥材項下的各項規(guī)定，并按照2020年版《中國藥典》(一部)白茅根飲片項下炮制規(guī)定制成白茅根飲片，具體炮制方法為：取白茅根藥材，挑去非藥用部位、雜質，洗凈，稍潤，切10～15 mm的段，干燥，篩去碎屑。

2 方法與結果

2.1 白茅根標準湯劑的制備

根據(jù)《中藥配方顆粒質量控制與標準制定技術要求》和《醫(yī)療機構中藥煎藥室管理規(guī)范》，確定白茅根標準湯劑的制備工藝為：取白茅根飲片100 g，加水煎煮兩次，第一次加9倍量水，浸泡30 min，煎煮30 min，趁熱過濾，濾液迅速冷卻；第二次加7倍量水，煎煮25min，趁熱過濾，濾液迅速冷卻，合并兩次濾液，減壓濃縮至100 mL的濃縮液，冷凍干燥，得白茅根標準湯劑凍干粉。

2.2 指紋圖譜的建立

2.2.1 色譜條件

選擇Waters CORTECS T3 C18(2.1 mm×150 mm，1.6 μm)色譜柱；以甲醇為流動相A，以0.1%磷酸溶液為流動相B；梯度洗脫(0～4 min，4%A；4～12 min，4%→7%A；12～15 min，7%→13%A；15～25 min，13%→16%A；25～27 min，16%→20%A；27～35 min，20%A)；流速為0.30 mL/min；柱溫為40 ℃；檢測波長為325 nm；進樣量為2 μL。

2.2.2 對照品溶液的制備

取綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸和對羥基肉桂酸對照品適量，精密稱定，加50%甲醇制成每1 mL含綠原酸9.27 μg、新綠原酸4.06 μg、隱綠原酸4.12 μg、對羥基肉桂酸5.10 μg的混合溶液，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備

取白茅根標準湯劑凍干粉適量，研細，取約0.1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇15 mL，稱定重量，超聲處理(功率300 W，頻率40 kHz)30 min，放冷，再稱定重量，用50%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 方法學驗證

2.2.4.1 精密度考察

取白茅根標準湯劑凍干粉(編號：S1)適量，研細，取約0.1 g，精密稱定，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，精密吸取上述供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件重復進樣6次，以綠原酸色譜峰為參照峰S，計算各共有指紋峰與S峰的相對保留時間RSD值在0.05%～0.13%范圍內，相對峰面積RSD值在0.32%～2.61%范圍內，均小于3.0%，表明儀器精密度良好。

2.2.4.2 重復性考察

取同一批白茅根標準湯劑凍干粉(編號：S1)適量，研細，取約0.1g，精密稱定，平行6份，按“2.2.3”項下方法制備6份供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進樣分析，以綠原酸色譜峰為參照峰S，計算各共有指紋峰與S峰的相對保留時間RSD值在0.03%～0.17%范圍內，相對峰面積RSD值在0.36%～2.76%范圍內，均小于3.0%，說明該方法重復性良好。

2.2.4.3 穩(wěn)定性考察

取白茅根標準湯劑凍干粉(編號：S1)適量，研細，取約0.1 g，精密稱定，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件，分別在0、3、6、9、12、18、24 h進樣分析，以綠原酸色譜峰為參照峰S，計算各共有指紋峰與S峰的相對保留時間RSD值在0.03%～0.21%范圍內，相對峰面積RSD值在0.37%～2.34%范圍內，表明供試品溶液在24h內穩(wěn)定性良好。

2.2.5 指紋圖譜的建立及共有峰的標定

分別取18批白茅根標準湯劑凍干粉適量，研細取約0.1 g，精密稱定，按“2.2.3”項下方法制備18份供試品溶液，分別按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄各批次白茅根標準湯劑樣品指紋圖譜，并導出指紋圖譜CDF格式，將18批白茅根標準湯劑樣品指紋圖譜CDF格式導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012版)》軟件中，以編號為S1的樣品指紋圖譜為參照圖譜，進行保留時間校正和全峰匹配，18批白茅根標準湯劑指紋圖譜共標識出9個共有指紋峰(見圖1)，以中位數(shù)法生成白茅根標準湯劑對照指紋圖譜(見圖2)。

圖1 18批白茅根標準湯劑指紋圖譜疊加圖Fig.1 Superimposed fingerprints of 18 batches of Imperatae Rhizoma standard decoction

圖2 白茅根標準湯劑指紋圖譜共有模式Fig.2 Common pattern of the fingerprint of Imperatae Rhizoma standard decoction

2.2.6 相似度計算

采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012.130723版本)》軟件計算18批白茅根標準湯劑樣品指紋圖譜與白茅根標準湯劑對照指紋圖譜的相似度值，結果見表2所示。結果顯示，18批白茅根標準湯劑指紋圖譜與對照指紋圖譜的相似度在0.920～0.997，其中河北產區(qū)的6批相似度值在0.972～0.986，安徽產區(qū)的4批相似度值在0.991～0.997，江蘇產區(qū)的5批相似度值在0.954～0.992，河南3批相似度值在0.920～0.945。從相似度計算結果可知，河北、安徽和河南的樣品存在一定的差異，而江蘇產區(qū)的樣品不同批次間指紋峰的峰面積比例波動較大，與河北和安徽的樣品并不能明顯地區(qū)分和鑒別。這種差異可能與不同產地的白茅根藥材的生長環(huán)境、產地加工和采收時間的不同有關，此外，白茅根中含量較高的酚酸類成分，遇熱不穩(wěn)定，藥材的儲藏方式、放置時間均可能對藥材的質量造成一定的影響。

表2 相似度評價結果Table 2 Evaluation results of the similarity

2.2.7 共有峰的指認

取白茅根標準湯劑凍干粉(編號：S1)適量，研細，取約0.1 g，精密稱定，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，取“2.2.2”項下混合對照品溶液和白茅根標準湯劑供試品溶液，按 “2.2.1”項下色譜條件進樣分析，結果如圖3所示。經與對照品保留時間和紫外-可見光3D光譜比對分析，確定峰1為新綠原酸，峰5為綠原酸，峰8為隱綠原酸，峰9為對羥基肉桂酸。

圖3 共有指紋峰的指認Fig.3 Identification of common peaks 注：A：對羥基肉桂酸對照品；B：隱綠原酸對照品；C：綠原酸對照品；D：新綠原酸對照品；E：供試品。1：新綠原酸；5：綠原酸；8：隱綠原酸；9：對羥基肉桂酸。Note:A:P-hydroxycinnamic acid reference; B:Cryptochlorogenic acid reference; C:Chlorogenic acid reference; D:Neochlorogenic acid reference; E:Sample.1:Neochlorogenic acid; 5:Chlorogenic acid;8:Cryptochlorogenic acid; 9:p-Hydroxycinnamic acid.

2.3 化學計量學分析

化學計量學中的模式識別技術，分為有監(jiān)督和無監(jiān)督兩種方式，無監(jiān)督模式識別技術用于中藥研究領域，用的最多諸如聚類分析(HCA)和主成分分析(PCA)，常用于觀察樣本之間的分類趨勢；而有監(jiān)督模式識別技術常用的方法為偏最小二乘法-判別式分析以及正交偏最小二乘法-判別式分析，用于顯示樣品間的差異主要由哪些變量引起，化學計量學分析方法已廣泛用于中藥的真?zhèn)舞b別、基原研究、炮制工藝研究及質量分析[12,13]。

2.3.1 聚類分析(HCA)

采用IBM SPSS Statistics 20.0軟件，以18批白茅根標準湯劑指紋圖譜的9個共有指紋峰的峰面積積分值為變量，并采用Z得分法對峰面積積分值進行標準化處理，樣本間距以平方Euclidean距離表征，采用組間聯(lián)接法對18批白茅根標準湯劑指紋圖譜進行系統(tǒng)聚類分析，結果見圖4所示。結果顯示，當組間距離為10時，18批白茅根標準湯劑樣品被分為三類，其中編號S7～S12的樣品歸為一類，編號S1～S6的樣品歸為第二類，編號S13～S18的樣品歸為第三類。通過產地分析可知，河北產區(qū)的白茅根標準湯劑自成一類，而江蘇產區(qū)的白茅根標準湯劑部分批次分別與安徽和河南產區(qū)的樣品聚為一類，聚類分析結果基本與相似度評價結果相類似。

圖4 聚類分析圖Fig.4 Cluster analysis diagram

2.3.2 主成分分析(PCA)

以白茅根標準湯劑指紋圖譜9個共有峰的峰面積積分值為變量，導入SIMCA14.1軟件，進行PCA分析，共生成3個主成分，R2X為0.963，Q2為0.741，均大于0.5，證明模型有效。其中主成分1累積貢獻率為77.3%，主成分2累積貢獻率為13.2%，前兩個主成分累積貢獻率在90%以上，以前兩個主成分的得分值為X、Y軸，自動生成18批白茅根標準湯劑指紋圖譜PCA得分圖，結果見圖5所示。結果顯示，除江蘇外，其余3個產區(qū)的樣品相互比較，同一產區(qū)樣品在PCA得分圖上分布較集中，說明其指紋圖譜共有峰的差異性較小，不同產區(qū)樣品在PCA得分圖上的位置相距較遠，說明其共有峰的差異較大。與河北、安徽、河南3個產區(qū)相比，江蘇產區(qū)的5批白茅根標準湯劑在PCA得分圖上分布較為分散，其中編號為S11和S12的樣品在PCA得分圖上與安徽產區(qū)的樣品距離接近，編號為S13～S15的樣品在PCA得分圖上與河南產區(qū)的樣品距離接近，說明江蘇產區(qū)不同批次的白茅根標準湯劑化學成分也存在較大差異，PCA分析結果基本與HCA結果基本一致。

圖5 PCA得分圖Fig.5 PCA scores plot

2.3.3 正交偏最小二乘法-判別式分析(OPLS-DA)

以9個共有指紋峰的峰面積積分值為變量導入SIMCA14.1軟件，進行OPLS-DA分析，運用統(tǒng)計推斷方法分析該模型，將模型隨機排列200次做置換檢驗，結果見圖6。由圖6可知，R2和Q2截距值分別為0.083和-0.449，置換檢驗圖左邊的R2和Q2值均小于最右邊的值，說明建立的OPLS-DA模型沒有出現(xiàn)過擬合現(xiàn)象。通過SIMCA14.1軟件，建立4個產區(qū)白茅根標準湯劑樣品的OPLS-DA模型，生成OPLS-DA得分圖，見圖7所示，OPLS-DA模型中累積解釋能力參數(shù)R2X(cum)為0.954，累積解釋能力參數(shù)R2Y為0.716，預測能力參數(shù)Q2為0.608，均大于0.5，表明模型的擬合準確性好，具有較強的解釋和預測能力，利用SIMCA14.1軟件生成變量VIP圖，對變量的顯著性進行預測，結果見圖8所示。結果顯示，4個產區(qū)白茅根標準湯劑樣品OPLS-DA得分圖與PCA得分圖類似，表明以9個共有指紋峰的峰面積為變量，不同產區(qū)的標準湯劑樣品存在明顯差異，而同一產區(qū)，除江蘇外，共有峰的差異較小。以VIP>1.0篩選具有顯著差異的色譜峰，并以VIP值進行排序，結果顯示，峰9(對羥基肉桂酸)>峰6>峰5(綠原酸)>峰2>峰8(隱綠原酸)>峰1(新綠原酸)>峰3>峰7>峰4，其中VIP值大于1.0的色譜峰分別為峰9(對羥基肉桂酸)、峰6和峰5(綠原酸)，說明不同產區(qū)白茅根標準湯劑羥基肉桂酸和綠原酸的含量有著較明顯的差異，可能與藥材的采收時間和產區(qū)加工方式的不同有關。

2.4 含量測定

2.4.1 精密度考察

精密吸取白茅根標準湯劑(編號：S1)供試品溶液，按照“2.2.1”項下色譜條件重復進樣6次，記錄綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸和對羥基肉桂酸色譜峰面積，并計算峰面積RSD值分別為0.25%、0.12%、0.20%及0.51%，表明該方法精密度良好。

圖6 OPLS-DA模型置換檢驗圖Fig.6 OPLS-DA model permutation test diagram

圖7 OPLS-DA得分圖Fig.7 OPLS-DA scores diagram

圖8 OPLS-DA模型VIP圖Fig.8 VIP diagram of OPLS-DA

2.4.2 線性關系考察

精密稱定綠原酸對照品3.734 mg、新綠原酸對照品1.679 mg、隱綠原酸對照品1.663 mg、對羥基肉桂酸對照品2.036 mg，置20 mL量瓶中，加50%甲醇溶解，并稀釋至刻度，即得綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸和對羥基肉桂酸混合對照品儲備液。精密量取上述混合對照品儲備液0.2、0.4、1、2、4 mL，分別置20 mL量瓶中，加50%甲醇稀釋，并定容至刻度，搖勻，制成每1 mL含綠原酸1.86、3.71、9.27、18.54、37.08 μg，含新綠原酸0.81、1.62、4.06、8.12、16.24μg，含隱綠原酸0.82、1.65、4.12、8.24、16.48 μg，含對羥基肉桂酸1.02、2.03、5.08、10.16、20.32 μg的混合對照品應用液，分別精密吸取上述對照品儲備液和應用液，按“2.2.1”項下色譜條件依次進樣2μL，記錄色譜峰面積。以峰面積為縱坐標(Y)，對照品濃度為橫坐標(X)繪制標準曲線，結果顯示，綠原酸的線性回歸方程為：Y=24 218.07X+21 285.41，相關系數(shù)r=0.999 9，表明在濃度1.86 μg/mL～185.39 μg/mL的范圍內綠原酸濃度與峰面積線性關系良好，新綠原酸的線性回歸方程為：Y=25 449.74X-893.08，相關系數(shù)r=1.000 0，表明在濃度為0.81 μg/mL～81.20 μg/mL的范圍內新原酸濃度與峰面積線性關系良好，隱綠原酸的線性回歸方程為：Y=27 804.92X-6 109.84，相關系數(shù)r=0.999 8，表明在濃度為0.82 μg/mL～82.40 μg/mL的范圍內隱綠原酸濃度與峰面積線性關系良好，對羥基肉桂酸的線性回歸方程為：Y=26 415.77X-7 481.78，相關系數(shù)r=0.999 9，表明在濃度為1.02 μg/mL～102.00 μg/mL的范圍內對羥基肉桂酸濃度與峰面積線性關系良好。

2.4.3 重復性考察

取同一批白茅根標準湯劑凍干粉(編號：S1),平行稱定6份，按“2.2.3”項下確定的供試品溶液制備方法，制備供試品溶液6份。按“2.2.1”項下色譜條件進行測定，分別計算綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸和對羥基肉桂酸的含量和RSD值，結果顯示，綠原酸的平均含量為1.91 mg/g，RSD值為0.91%，新綠原酸的平均含量為0.84 mg/g，RSD值為1.02%，隱綠原酸的平均含量為0.85 mg/g，RSD值為1.27%，對羥基肉桂酸的平均含量為1.06 mg/g，RSD值為1.56%，表明該方法重復性良好。

2.4.4 加樣回收率考察

取已知含量的白茅根標準湯劑凍干粉(編號：S1)適量，研細，取約0.05g，精密稱定，平行6份，按樣品與對照品含量比為1∶1的比例加入綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸和對羥基肉桂酸對照品，按“2.2.3”項下方法制備6份供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，計算加樣回收率，結果見表3。結果顯示，綠原酸的加樣回收率均值為99.93%，回收率范圍為99.02%～100.78%，RSD值為0.71%，新綠原酸的加樣回收率均值為101.78%，回收率范圍為100.47%～102.61%，RSD值為0.83%；隱綠原酸的加樣回收率均值為99.59%，回收率范圍為98.27%～102.51%，RSD值為1.72%，對羥基肉桂酸的加樣回收率均值為98.79%，回收率范圍為97.15%～101.22%，RSD值為1.85%，均符合2020年版《中國藥典》通則9101的規(guī)定，表明該方法的準確度良好。

表3 加樣回收率測定結果Table 3 Results of the sample recovery rate

續(xù)表3(Continued Tab.3)

2.4.5 穩(wěn)定性考察

精密吸取白茅根標準湯劑(編號：S1)供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件，分別在0、3、6、8、12、18、24 h進樣分析，計算峰面積RSD值，結果顯示，綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸和對羥基肉桂酸的峰面積RSD值分別為0.19%、0.56%、0.96%和1.02%，均小于3.0%，說明供試品溶液在24h內穩(wěn)定性良好。

2.4.6 樣品測定

取18批白茅根標準湯劑凍干粉，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進樣分析，分別記錄供試品溶液中綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸和對羥基肉桂酸的色譜峰面積，并采用外標法計算含量，結果如表4所示。結果顯示，白茅根標準湯劑4種酚酸的總含量：河北>安徽>江蘇>河南，不同產區(qū)的樣品4種酚酸類成分的含量差異較大，主要由白茅根藥材的含量差異所致，根據(jù)對藥材的測定結果來看，河北產區(qū)的白茅根藥材4種酚酸的總含量最高，河南產區(qū)的3批樣品含量較低，這種差異可能與不同產區(qū)的白茅根藥材的生長環(huán)境、產地加工和采收時間的不同有關。此外，河南產區(qū)白茅根標準湯劑綠原酸、新綠原酸和隱綠原酸的含量均低于其他產區(qū)，安徽產區(qū)的白茅根標準湯劑對羥基肉桂酸的平均含量最高且比較穩(wěn)定，但綠原酸、新綠原酸和隱綠原酸的含量并不高；江蘇產區(qū)不同批次白茅根標準湯劑對羥基肉桂酸和4種酚酸的總含量波動比較大，綠原酸、新綠原酸和隱綠原酸的含量也不高。根據(jù)上述研究結果，企業(yè)將白茅根藥材的固定產地規(guī)定為河北省邢臺市具有一定的現(xiàn)實意義。

表4 18批白茅根標準湯劑含量測定結果 Table 4 Content determination of 18 batches of Imperatae Rhizoma standard decoction

續(xù)表4(Continued Tab.4)

3 討論與結論

3.1 含量指標的選擇

目前對白茅根含量測定指標的研究較少，多集中在對酚酸和糖類的測定上[14,15]，也有報道測定白茅根中白茅素、蘆竹素的含量，但白茅素和蘆竹素在藥材中的含量很低[16]，白茅根標準湯劑以水為溶劑，有效成分以水溶性成分為主，白茅素、蘆竹素不僅含量低，且為脂溶性成分，因此，不適宜作為指標成分，糖類成分專屬性差，也不宜作為指標性成分。從指紋圖譜的研究中也發(fā)現(xiàn)，白茅根雖然化學成分多，但有效成分含量均較低。從指紋圖譜中指認出4個峰型較高的色譜峰，均為酚酸類成分，且均與白茅根標準湯劑的藥理活性密切相關，因此，在含量指標的選擇上，首選酚酸類成分的測定。研究表明，綠原酸、新綠原酸和隱綠原酸在酸性pH條件下較為穩(wěn)定，而在中性和堿性條件下不穩(wěn)定，相互之間存在一定的轉化[17,18]。我們在對白茅根藥材和標準湯劑指紋圖譜研究過程中發(fā)現(xiàn)，相對于白茅根藥材，白茅根標準湯劑指紋圖譜，峰1(新綠原酸)、峰8(隱綠原酸)與峰5的峰面積比例明顯增加，由此推測，白茅根在煎煮過程中，綠原酸、新綠原酸和隱綠原酸存在較大的轉化幾率。綠原酸、新綠原酸和隱綠原酸結構類似，具有相同或相近的藥理活性[9]，因此，我們認為，白茅根標準湯劑在選擇含量指標時，應以測定綠原酸、新綠原酸和隱綠原酸的總量為佳，而不僅僅是測定單一的綠原酸類成分。研究結果顯示，不同產區(qū)的白茅根標準湯劑4種酚酸類成分的總量存在明顯差異，反映了不同產區(qū)白茅根藥材質量的優(yōu)劣，可能與不同產區(qū)藥材的采收時間和產地加工方式的不同有關。

3.2 分析方法的建立

目前采用指紋圖譜結合多成分定量對白茅根進行質量控制的研究尚未見到，白茅根標準湯劑凍干粉含有較多的糖類，且酚酸類成分結構相似，對色譜分離要求較高。因此，在方法的建立中，充分考察不同的流動相比例、不同的色譜柱、柱溫、流速對各指紋峰，尤其是含量測定色譜峰的分離效果，優(yōu)選最佳的色譜條件和色譜柱；選擇280、300、325、350 nm作為檢測波長，并進行全波掃描，記錄樣品在200～400 nm范圍內的吸收光譜，結果顯示，不同波長下，各色譜圖色譜峰數(shù)目和峰型無明顯區(qū)別，采用325 nm為檢測波長，色譜峰的吸收值最大，因此，選擇325 nm作為該特征圖譜的檢測波長。采用單因素分析方法，對提取溶劑(甲醇、10%甲醇、50%甲醇、70%甲醇、70%乙醇、50%乙醇、10%乙醇)、提取方式(超聲和加熱回流)，溶劑用量(15、25、50 mL)和提取時間(15、30、45 min)進行考察，最終確定合理的供試品溶液的制備方法。

3.3 相似度評價和化學計量學分析

指紋圖譜相似度計算結果顯示，河南產區(qū)3批白茅根標準湯劑的相似度值明顯低于其他產區(qū)，說明河南的白茅根在化學成分的組成比例上與其他產地存在明顯差異。HCA和PCA結果均能很好區(qū)分河北、安徽、河南產區(qū)的樣品，但對江蘇產區(qū)的樣品區(qū)分不明顯。綠原酸等酚酸類成分易溶于水，遇熱不穩(wěn)定，因此，產地加工、儲藏、運輸?shù)染鶗绊懰幉牡馁|量，從而導致不同產區(qū)白茅根標準湯劑質量的差異。采用OPLS-DA尋找到3個差異性標志物，根據(jù)VIP值排序，分別為峰9>峰6>峰5，說明不同產區(qū)的白茅根標準湯劑峰9、峰6和峰5的差異具有顯著性，已經證實峰9為對羥基肉桂酸，峰5為綠原酸、峰6有待進一步研究。目前多省出臺地方政策，鼓勵藥材產地鮮切，減少有效成分的損失[19]，有報道研究顯示，草珊瑚藥材趁鮮清洗、切段制成的飲片中綠原酸、新綠原酸和隱綠原酸等成分的含量明顯高于傳統(tǒng)加工方式制成的飲片，趁鮮加工的草珊瑚飲片抗炎、鎮(zhèn)痛的效果明顯優(yōu)于傳統(tǒng)飲片，表明草珊瑚炮制與產地加工一體化的可行性[20]。白茅根富含酚酸類成分，尤其適用于產地鮮加工，從而提高藥材的含量。

本研究建立了白茅根標準湯劑UPLC指紋圖譜方法并同時對4種酚酸類成分進行測定，該方法操作簡便，穩(wěn)定可靠，重復性好，為白茅根標準湯劑、藥材、飲片及其相關制劑的質量評價提供重要參考。