秦偉瀚，蘭小中，瞿顯友，樵星芳，劉 翔，徐元江，鄒佳佳，何 丹*

1重慶醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，重慶 400016；2重慶市中藥研究院，重慶 400065；3西藏農(nóng)牧學(xué)院，林芝 860000

大花黃牡丹(Paeonialudlowii)是我國(guó)芍藥科芍藥屬牡丹組(sect.MoutanDC.)中8個(gè)品種之一，為西藏特有植物，屬叢生落葉灌木，僅見(jiàn)于西藏東南部林芝地區(qū)[1,2]。大花黃牡丹花朵碩大，色彩絢麗，是極珍貴的牡丹觀賞品種，其根及花瓣均可入藥，具有一定食用、藥用價(jià)值[3]。雖然大花黃牡丹具有較高的育種價(jià)值和觀賞價(jià)值，卻由于分布狹窄，種群持續(xù)減少，被《中國(guó)物種紅色名錄》列為瀕危植物，已處于極危狀態(tài)[4]。牡丹的化學(xué)成分研究主要集中在根部，對(duì)其他部位研究很少。自1753年以來(lái)，已有共180多個(gè)的化合物被分離出來(lái)。其化學(xué)成分主要包括：?jiǎn)屋祁?、單萜苷類、三萜類、酚類、鞣酸類、黃酮類等[5,6]。棕櫚酸是生產(chǎn)蠟燭、肥皂、潤(rùn)滑脂、軟化劑和合成洗滌劑的原料[7]。油酸有得天獨(dú)厚的抗氧化功能，是目前最安全的健康脂肪酸。油酸能調(diào)節(jié)血脂水平，降低膽固醇，防止記憶力下降；同時(shí)對(duì)代謝紊亂、皮膚損傷等都有很好的療效[8]。亞油酸可以軟化心腦血管，降低血壓與血脂，加快人體新陳代謝，能有效預(yù)防動(dòng)脈硬化發(fā)生，能提高人體免疫力，促進(jìn)骨骼發(fā)育，提高記憶力，也能延緩衰老[9]。亞麻酸是人體必需脂肪酸之一，能夠降解血栓，預(yù)防心腦血管病、抑制癌癥的發(fā)生和轉(zhuǎn)移、抑制過(guò)敏反應(yīng)和抗炎作用、抑制衰老、增強(qiáng)智力和保護(hù)視力等[10]。

近年來(lái)大花黃牡丹的研究主要集中在植物分類、生境群落以及栽培繁殖等領(lǐng)域[11-16]；化學(xué)成分及活性評(píng)價(jià)的相關(guān)報(bào)道較少，僅Zeng等[17]采用GC-MS法分析大花黃牡丹種子中棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、亞麻酸的含量。Zhang等[18-20]在大花黃牡丹仁油中鑒定出了20種脂肪酸，而采用QAMS定量分析大花黃牡丹種仁中的棕櫚酸、油酸、亞油酸、亞麻酸則未見(jiàn)報(bào)道。本研究將一測(cè)多評(píng)與指紋圖譜相結(jié)合建立大花黃牡丹種子的質(zhì)量評(píng)價(jià)方法，并通過(guò)DPPH法、Fe3+還原法對(duì)大花黃牡丹及油用牡丹種子的抗氧化活性進(jìn)行對(duì)比評(píng)價(jià)。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果有助于后續(xù)大花黃牡丹籽油、種皮的新產(chǎn)品研發(fā)，為大花黃牡丹深入綜合開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)，同時(shí)也為不同品種牡丹種子的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供有益思路。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

Agilent 6890N型氣相色譜儀(美國(guó)，安捷倫科技有限公司)；TSQ 8000 Evo型三重四級(jí)桿氣質(zhì)聯(lián)用儀(美國(guó)，賽默飛世爾科技公司)；Infinte M200 Pro型酶標(biāo)儀(中國(guó)，北京五洲東方科技發(fā)展有限公司)；BJ-100型超高速中藥粉碎機(jī)(中國(guó)，德清拜杰電器有限公司)；VGT-2013QT型超聲清洗機(jī)(中國(guó)，固特超聲公司)；BSA224S-CW型萬(wàn)分之一分析天平(德國(guó)，賽多利斯公司)；UV-3600i型紫外分光光度計(jì)(日本，島津公司)；H3-18K型臺(tái)式高速離心機(jī)(中國(guó)，湖南可成儀器設(shè)備有限公司)；SG60-1型榨油機(jī)(中國(guó)，通雨機(jī)械設(shè)備有限公司)；普及型pH計(jì)(德國(guó)，賽多利斯公司)；BHW-09C型恒溫加熱器(中國(guó)，上海博通化學(xué)科技有限公司)；Milli-Q Integral5型純水儀(美國(guó)，Millipoer公司)。

1.2 材料與試劑

對(duì)照品棕櫚酸甲酯(批號(hào)：A12A6L17796，含量≥97%)、油酸甲酯(批號(hào)：S16M9B61466，含量≥98%)、亞油酸甲酯(批號(hào)：K25N10S101770，含量≥98%)、亞麻酸甲酯(批號(hào)：S09O11B126531，含量≥98%)、十七烷酸甲酯(批號(hào)：S15H18C146523，含量≥98%)均購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；維生素C(批號(hào)：1353736)購(gòu)自上海泰坦科技股份有限公司。正己烷為農(nóng)殘級(jí)，三氟化硼、氫氧化鉀、二甲基亞砜、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、乙醇、甲醇均為分析級(jí)。高純氮?dú)狻錃?、氦氣和干燥空氣體積分?jǐn)?shù)均為99.999%(重慶高德氣體有限公司)。本研究所收集樣品經(jīng)重慶市中藥研究院生藥研究所劉翔副研究員鑒定為大花黃牡丹(PaeonialudlowiiD.Y.Hong)和油用牡丹(PaeoniasuffruticosaAndr.)的種子，樣品信息見(jiàn)表1。

表1 牡丹種子樣品信息表Table 1 Information of Peony seed sample

續(xù)表1(Continued Tab.1)

1.3 方法

1.3.1 GC-MS質(zhì)譜條件

色譜柱采用Agilent DB-1701MS柱(0.25 mm×0.25 μm×30 m)；載氣為高純氦氣；不分流模式；程序升溫：起始溫度50 ℃，保持3 min，以10 ℃/min的升溫速率升至280 ℃，保持3 min；進(jìn)樣口溫度250 ℃；傳輸線溫度280 ℃；離子源為EI源；離子源溫度300 ℃；質(zhì)譜掃描范圍40～500 Da；溶劑峰切除時(shí)間4 min；進(jìn)樣體積：1 μL。采用上述方法對(duì)甲酯化樣品進(jìn)行定性分析，共鑒定出5個(gè)色譜峰(見(jiàn)圖1)，與其他幾個(gè)成分相比較，十八烷酸甲酯的峰面積過(guò)小，不適合作為一測(cè)多評(píng)的含量檢測(cè)指標(biāo)。

圖1 甲酯化樣品的氣質(zhì)聯(lián)用總離子流圖Fig.1 GC-MS total ion chromatogram of methyl esterified sample注：1.棕櫚酸甲酯；2.十八烷酸甲酯；3.油酸甲酯；4.亞油酸甲酯；5.亞麻酸甲酯。Note:1.Methyl palmitate;2.Methyl stearate;3.Methyl oleate;4.Methyl linoleate;5.Methyl linolenate.

1.3.2 GC色譜條件

色譜柱采用Agilent DB-FATWAX柱(0.25 mm×0.25 μm×30 m)；載氣為高純氮?dú)?；分流模式，分流比?0∶1；程序升溫：起始溫度160 ℃，不保持，以5 ℃/min的升溫速率升至250 ℃，保持2 min；進(jìn)樣口溫度270 ℃；氫火焰離子化檢測(cè)器，檢測(cè)器溫度270 ℃；進(jìn)樣體積2 μL。

1.3.3 對(duì)照品溶液制備

精密稱取棕櫚酸甲酯、油酸甲酯、亞油酸甲酯、亞麻酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品適量于10 mL容量瓶中，加入正己烷溶解并定容至10 mL刻度線，混勻，即得質(zhì)量濃度分別為2.01、1.97、1.99、1.95 mg/mL的混合溶液。再將上述混合對(duì)照品溶液以2倍體積逐級(jí)稀釋至質(zhì)量濃度為0.13 mg/mL的混合溶液。

1.3.4 供試品溶液制備

1.3.4.1 質(zhì)量評(píng)價(jià)用供試品溶液制備方法

甲酯化反應(yīng)是氣相分析時(shí)常用的一種衍生化手段，是指在催化劑作用下使含羧基等沸點(diǎn)較高物質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)闅庀嗫蓹z測(cè)的甲酯的化學(xué)方法?？梢允怪舅犷惓煞衷跉庀嗌V中出峰更加對(duì)稱尖銳，并且有利于保護(hù)氣相色譜柱。

精密稱取牡丹種仁粉末樣品0.40 g于錐形瓶中，精密移入正己烷50 mL，稱定重量，超聲提取(功率300 W，頻率40 kHz)1 h，再次稱定重量，用正己烷補(bǔ)足減失重量，搖勻后過(guò)濾，取濾液4 mL于15 mL具塞玻璃試管中，精密加入2 mL氫氧化鉀甲醇溶液(2 mol/L)，渦旋1 min，再精密加入1 mL三氟化硼溶液，渦旋1 min，靜置5 min，取上層溶液，即得。

1.3.4.2 抗氧化活性評(píng)價(jià)用供試品溶液制備方法

牡丹種皮樣品：稱取10批次大花黃牡丹種皮各20.0 g，混合后于中藥高速粉碎機(jī)中粉碎成細(xì)末，過(guò)80目篩，作為大花黃牡丹抗氧化活性評(píng)價(jià)用樣品。稱取不同產(chǎn)地牡丹種皮各200.0 g，于中藥高速粉碎機(jī)中粉碎成細(xì)末，過(guò)80目篩，作為牡丹抗氧化活性評(píng)價(jià)用樣品。精密稱取上述牡丹種皮粉末0.5 g于具塞錐形瓶中，精密移入70%乙醇20 mL，稱定重量，超聲提取(功率300 W，頻率40 kHz)30 min，再次稱定重量，用70%乙醇補(bǔ)足減失重量，搖勻后以8 000 r/min離心5 min，取10 mL上清液于蒸發(fā)皿中，水浴揮干，用50%乙醇溶解定容至5 mL容量瓶，0.22 μm濾膜過(guò)濾，即得牡丹種皮樣品的乙醇溶液。

牡丹籽油樣品：稱取10批次大花黃牡丹種仁各100.0 g，混合后作為大花黃牡丹抗氧化活性評(píng)價(jià)用樣品。稱取不同產(chǎn)地牡丹種仁各1 000.0 g，作為牡丹抗氧化活性評(píng)價(jià)用樣品。將上述牡丹種仁勻速倒入榨油機(jī)中，在榨膛溫度為240 ℃條件下進(jìn)行冷榨。將榨得的牡丹籽油在高速離心機(jī)中以8 000 r/min離心10 min。精密稱取上述牡丹籽油0.50 g，加入5 mL的二甲基亞砜(DMSO)溶液，混勻，即得牡丹籽油樣品的DMSO溶液。

1.3.5 抗氧化活性評(píng)價(jià)方法

1.3.5.1 DPPH自由基清除能力測(cè)定方法

精密吸取“1.3.4.2”項(xiàng)下供試品溶液(0.05 g/mL)60 μL和3.94 mL DPPH溶液(0.1 mmol/L)于10 mL的EP管中混勻，室溫避光孵育30 min后，取200 μL混合液于96孔板中，在517 nm處檢測(cè)其吸光值(A樣品)。以未加樣品的溶劑作為空白對(duì)照，同法操作，檢測(cè)空白對(duì)照的吸光值(A空白)，并取50 μL的維生素C(VC，0.60 g/mL)作參比，每組樣品重復(fù)試驗(yàn)3次。牡丹籽樣品對(duì)DPPH自由基清除率的計(jì)算公式：清除率=[(A空白-A樣品)/A空白]×100%(A空白：空白對(duì)照組吸光度；A樣品：試驗(yàn)組吸光度)。

1.3.5.2 Fe3+還原能力的測(cè)定方法

精密吸取“1.3.4.2”項(xiàng)下供試品溶液(0.10 g/mL)5 μL與2 mL 0.20 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液(pH=6.6)于10 mL的EP管中混勻，再加入2 mL 0.03 mol/L K3Fe(CN)6溶液，混勻。在50 ℃下孵育20 min后，加入200 μL 0.60 mol/L的C2HCl3O2溶液，混勻，1 000 r/mim離心10 min。取35 μL上清液、115 μL超純水于96孔板中，混勻，再加100 mL 0.006 mol/L的FeCl3溶液，混勻后，在700 nm處檢測(cè)吸光度(A樣品)，以未加樣品的溶劑作為空白對(duì)照，同法操作，檢測(cè)空白對(duì)照的吸光值(A空白)，并取1 mL的丁基羥基茴香醚(BHA 600 μg/mL)作參比，每組樣品重復(fù)檢測(cè)3次。牡丹籽樣品對(duì)Fe3+還原能力的計(jì)算公式：Fe3+還原能力=A樣品-A空白(A樣品：試驗(yàn)組吸光度，A空白：空白對(duì)照組吸光度)。

2 結(jié)果與分析

2.1 QAMS法測(cè)定牡丹種子中4種成分含量

2.1.1 外標(biāo)法方法學(xué)考察

外標(biāo)法方法學(xué)分別考察了線性、精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性、回收率、檢測(cè)限和定量限，結(jié)果顯示(見(jiàn)表2)四個(gè)甲酯類成分在0.12～2.00 mg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；連續(xù)進(jìn)樣6次，所測(cè)成分RSD均小于1.5%，表明儀器精密度良好；樣品制備后分別于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，所測(cè)成分RSD均小于2.0%，表明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定；重復(fù)性和回收率的RSD均小于2.0%，表明樣品制備方法準(zhǔn)確可靠。

表2 檢測(cè)成分的方法學(xué)考察結(jié)果Table 2 Methodological investigation results of detected components

2.1.2 相對(duì)校正因子確定

精密吸取“1.3.3”項(xiàng)下不同質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液2 μL，采用“1.3.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄不同質(zhì)量濃度對(duì)照品的峰面積，按公式fk/x=AkCx/(AxCk) 計(jì)算各成分的相對(duì)校正因子，其中Ak、Ck分別為內(nèi)參物峰面積和濃度，Ax、Cx分別為待測(cè)成分對(duì)照品的峰面積和濃度。相較于其他幾個(gè)檢測(cè)物，油酸甲酯峰面積最大、分離度高且理論塔板數(shù)高，因此選擇以油酸甲酯為內(nèi)參物，分別計(jì)算棕櫚酸甲酯、亞油酸甲酯、亞麻酸甲酯的相對(duì)校正因子，結(jié)果見(jiàn)表3。

2.1.3 校正因子重現(xiàn)性考察

精密吸取“1.3.3”項(xiàng)下不同質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液2 μL，進(jìn)樣分析；在2個(gè)實(shí)驗(yàn)室分別考察了Agilent 6890N、Shimadzu GC2010兩種氣相色譜儀，分流比5∶1、20∶1，柱流速0.80、1.20 mL/min，對(duì)相對(duì)校正因子的影響，結(jié)果RSD均<2%，表明一測(cè)多評(píng)方法具有良好的重現(xiàn)性，結(jié)果見(jiàn)表4。

表3 相對(duì)校正因子計(jì)算結(jié)果Table 3 Results of relative correction factor

表4 校正因子重現(xiàn)性考察結(jié)果Table 4 Results of reproducibility investigation of correction factors

2.1.4 色譜峰定位

分別考察在“1.3.2”項(xiàng)中各色譜條件下，以油酸甲酯為內(nèi)參物，分別計(jì)算棕櫚酸甲酯、亞油酸甲酯、亞麻酸甲酯組分相對(duì)保留時(shí)間的重現(xiàn)性，結(jié)果表明相對(duì)保留時(shí)間的RSD均<1%，可用于待測(cè)成分色譜峰的定位，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 相對(duì)保留時(shí)間考察結(jié)果Table 5 Results of relative retention time investigation

2.1.5 QAMS法與外標(biāo)法結(jié)果比較

將產(chǎn)于西藏、山東、安徽、江蘇、河南的牡丹種子樣品，按照“1.3.4.1”項(xiàng)下方法制備供試品，按照“1.3.2”項(xiàng)下色譜條件采集峰面積，分別采用外標(biāo)法和QAMS計(jì)算4種成分含量，結(jié)果見(jiàn)表6。將10個(gè)產(chǎn)地大花黃牡丹含測(cè)結(jié)果進(jìn)行平均后，棕櫚酸、油酸、亞油酸、亞麻酸的含量分別為2.40%、13.65%、8.62%、8.10%；將4個(gè)主產(chǎn)區(qū)牡丹含測(cè)結(jié)果平均后，棕櫚酸、油酸、亞油酸、亞麻酸的含量分別為1.13%、10.85%、16.70%、18.96%。棕櫚酸為飽和脂肪酸，在大花黃牡丹種子中棕櫚酸的含量要超過(guò)牡丹約2倍，含量最高的是S2批，為2.61%，含量最低的是江蘇產(chǎn)牡丹，為1.01%。油酸為單不飽和脂肪酸，大花黃牡丹種子中油酸的含量要略高于牡丹，而其中S9批(米林縣丹娘鄉(xiāng))含量為所有批次樣品中最低，達(dá)10.43%；牡丹中油酸含量最高的是河南產(chǎn)牡丹，為11.26%。亞油酸和亞麻酸同為多不飽和脂肪酸，牡丹含量約為大花黃牡丹含量的2倍，亞油酸含量最高的是山東產(chǎn)牡丹，為17.68%，最低的是S9批，為6.81%；而亞麻酸含量最高的是山東產(chǎn)牡丹，為19.37%，最低是S9批，為6.92%。

為確定QAMS的準(zhǔn)確性，將兩種方法計(jì)算結(jié)果進(jìn)行t檢驗(yàn)(Microsoft Excel軟件；選擇T.TEST函數(shù)，在Array中選中一組數(shù)據(jù)，Tails選雙尾檢驗(yàn)，Type選雙樣本等方差假設(shè))，兩組結(jié)果的P值均>0.05，表明兩種方法計(jì)算的質(zhì)量分?jǐn)?shù)結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可見(jiàn)QAMS法以亞油酸甲酯作為參比來(lái)準(zhǔn)確測(cè)定牡丹種仁中其它3種成分含量是可行的。

表6 QAMS法與外標(biāo)法的含量比較結(jié)果Table 6 Content comparison results of QAMS method and external standard

續(xù)表6(Continued Tab.6)

2.2 大花黃牡丹指紋圖譜研究

2.2.1 參照峰選擇

牡丹種仁樣品經(jīng)過(guò)甲酯化后有5個(gè)共有峰，其中油酸甲酯色譜峰不僅分離度好，且峰面積較大，故選擇3號(hào)峰(油酸甲酯)作為內(nèi)參峰，用以計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。

2.2.2 精密度試驗(yàn)

精密稱取牡丹種仁樣品(S1批)0.40 g，采用“1.3.4.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，采用“1.3.2”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，分別計(jì)算相對(duì)峰面積與相對(duì)保留時(shí)間的RSD值。運(yùn)用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件(2004年A版)，計(jì)算不同產(chǎn)地樣品GC譜圖的相似度。結(jié)果各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均<0.11%，相對(duì)峰面積的RSD均<0.27%，指紋圖譜的相似度均>0.99。表明儀器精密度良好。

2.2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密稱取牡丹種仁樣品(S1批)0.40 g，采用“1.3.4.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，采用“1.3.2”項(xiàng)下色譜條件分別于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，記錄色譜圖，分別計(jì)算相對(duì)峰面積與相對(duì)保留時(shí)間的RSD值。結(jié)果各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均<0.14%，相對(duì)峰面積的RSD均<1.17%，指紋圖譜的相似度均>0.99。表明該方法穩(wěn)定性良好。

2.2.4 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取牡丹種仁樣品(S1批)0.40 g，采用“1.3.4.1”項(xiàng)下方法平行制備六份供試品溶液，采用“1.3.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖，分別計(jì)算相對(duì)峰面積與相對(duì)保留時(shí)間的RSD值。結(jié)果各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均<0.08%，相對(duì)峰面積的RSD均<0.51%，指紋圖譜的相似度均>0.99。表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.5 指紋圖譜建立

將10批不同產(chǎn)地的大花黃牡丹樣品按照 “1.3.4.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照“1.3.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，將樣品圖譜中各共有峰積分后生成AIA格式文件，并導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》(2004年A版)，通過(guò)設(shè)參照譜、多點(diǎn)校正、自動(dòng)匹配、生成對(duì)照等功能進(jìn)行自動(dòng)擬合，生成大花黃牡丹種子的指紋圖譜(見(jiàn)圖2)。

圖2 大花黃牡丹種仁的GC指紋圖譜Fig.2 GC fingerprints of seed kernel of P.ludlowii

共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均<0.14%，相對(duì)峰面積的RSD均<1.28%。以標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜R為對(duì)照對(duì)樣品圖譜進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，相似度結(jié)果見(jiàn)表7。相似度范圍為0.999～1，表明不同產(chǎn)地大花黃牡丹種子相似度良好。

表7 相似度計(jì)算結(jié)果Table 7 Resultsof similarity calculation

2.2.6 共有峰歸屬指認(rèn)

將油酸甲酯、亞油酸甲酯、十八烷酸甲酯等標(biāo)準(zhǔn)品采用“1.3.3”項(xiàng)下方法制備標(biāo)準(zhǔn)品溶液。精密稱取S1批樣品0.40 g，采用“1.3.4.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液。采用“1.3.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖，通過(guò)比較樣品與標(biāo)準(zhǔn)品各色譜峰的保留時(shí)間，對(duì)共有峰進(jìn)行成分歸屬，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 指紋圖譜共有峰Fig.3 Fingerprint chromatogram of common peak注：1.棕櫚酸甲酯；2.十八烷酸甲酯；3.油酸甲酯；4.亞油酸甲酯；5.亞麻酸甲酯。Note:1.Methyl palmitate;2.Methyl stearate;3.Methyl oleate;4.Methyl linoleate;5.Methyl linolenate.

2.2.7 主成分分析(PCA)

將牡丹樣品的氣相色譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA-P軟件(版本號(hào)：14.1)，通過(guò)Score Scatter Plot分析(見(jiàn)圖4)發(fā)現(xiàn)，大花黃牡丹樣品(II類)與牡丹樣品(I類)分別聚類，表明西藏的大花黃牡丹種仁中主要成分含量與牡丹有較大差異，這與定量分析結(jié)果一致。大花黃牡丹第九批(S9)樣品的數(shù)據(jù)點(diǎn)遠(yuǎn)離聚類中心，可能與該批樣品采自米林縣丹娘鄉(xiāng)有關(guān)；這也表明，大花黃牡丹雖然產(chǎn)自西藏林芝地區(qū)，但海拔、土壤、氣候等地理環(huán)境的變化仍然可以較大影響其種子中化學(xué)成分。

2.3 牡丹種子抗氧化活性評(píng)價(jià)

2.3.1 DPPH自由基清除能力測(cè)定

DP是一種早期合成的有機(jī)自由基，常用來(lái)評(píng)估抗氧化物的供氫能力，它在有機(jī)溶劑中非常穩(wěn)定，呈紫色，而且在處有一個(gè)特征吸收峰，當(dāng)遇到自由基清除劑時(shí)，DPPH的孤對(duì)電子被配對(duì)而使其退色，也就是在最大吸收波長(zhǎng)處的吸光值變小。因此，可通過(guò)測(cè)定吸光值的變化來(lái)評(píng)價(jià)樣品對(duì)DPPH自由基的清除效果。

按照“1.3.5.1”項(xiàng)下方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，DPPH實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表8。由結(jié)果可知，籽油清除率最高的是江蘇產(chǎn)牡丹，為37.56%，大花黃牡丹籽油清除率(30.14%)雖然要低于江蘇產(chǎn)牡丹，但要高于河南產(chǎn)牡丹(27.33%)、山東產(chǎn)牡丹(17.27%)和安徽產(chǎn)牡丹(18.27%)。而大花黃牡丹種皮的清除率最高，為63.62%，要明顯高于牡丹樣品。表明大花黃牡丹種皮有較強(qiáng)的自由基清除能力，即抗氧化活性強(qiáng)。

圖4 主成分分析結(jié)果Fig.4 Results of PCA

表8 大花黃牡丹與牡丹樣品的DPPH自由基清除率Table 8 DPPH radical scavenging rate of P.ludlowii and

2.3.2 Fe3+還原能力的測(cè)定

還原力的測(cè)定是檢驗(yàn)樣品是否是良好的電子供體的方法，還原力強(qiáng)的樣品應(yīng)該是良好的電子供應(yīng)者，它供應(yīng)的電子不僅能使Fe3+還原為Fe2+，也可以與自由基反應(yīng)。還原力的測(cè)定是用來(lái)評(píng)價(jià)抗氧化劑活性的常用方法。

按照“1.3.5.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，F(xiàn)e3+還原能力實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表9。由結(jié)果可知，相較于牡丹樣品，大花黃牡丹籽油和種皮的Fe3+還原能力均為最高，分別為0.24 Abs和1.01 Abs，但種皮的Fe3+還原能力是BHA對(duì)照的兩倍，而籽油則僅為BHA對(duì)照的一半，表明大花黃牡丹種皮的抗氧化能力更為明顯。

表9 大花黃牡丹與牡丹樣品的Fe3+還原能力Table 9 Fe3+ reduction ability of P.ludlowii and

續(xù)表9(Continued Tab.9)

3 討論與結(jié)論

經(jīng)課題組實(shí)地考察和查閱文獻(xiàn)可知，大花黃牡丹僅分布于西藏的林芝市。由指紋圖譜結(jié)果可以看出，10個(gè)批次大花黃牡丹樣品的相似度均高于0.99，說(shuō)明林芝地區(qū)所產(chǎn)的大花黃牡丹相似度較高。結(jié)合相似度結(jié)果表明大花黃牡丹分布集中且變異較小；通過(guò)PCA分析結(jié)果可以看出，大花黃牡丹與其他幾個(gè)產(chǎn)地的牡丹樣品區(qū)分明顯。QAMS法計(jì)算結(jié)果和外標(biāo)法計(jì)算結(jié)果基本一致，說(shuō)明QAMS法可以用于牡丹種仁中多成分的定量分析，同時(shí)也為全國(guó)其他品種牡丹籽的質(zhì)量控制提供了一種新的可靠方法。由含量結(jié)果可以看出，山東、河南、安徽、江蘇產(chǎn)牡丹種仁樣品中4種成分含量接近，而大花黃牡丹與四個(gè)產(chǎn)地牡丹種仁中4種成分含量差異較大；大花黃牡丹樣品中棕櫚酸和油酸含量為四產(chǎn)區(qū)牡丹樣品的2倍，而亞油酸、亞麻酸含量?jī)H為牡丹樣品的一半。亞油酸、亞麻酸屬于不飽和脂肪酸，是評(píng)價(jià)成品油質(zhì)量的重要影響因素，大花黃牡丹樣品中不飽和脂肪酸含量較低，是否說(shuō)明其籽油的質(zhì)量低于牡丹品種，還有待進(jìn)一步考證。

經(jīng)DPPH自由基清除率測(cè)定和Fe3+還原能力測(cè)定，大花黃牡丹種皮的抗氧化活性要明顯高于其他幾個(gè)產(chǎn)地牡丹樣品。大花黃牡丹生長(zhǎng)在高海拔地區(qū)，其紫外線較內(nèi)地要強(qiáng)，是否在種皮中產(chǎn)生了大量能夠抵御強(qiáng)紫外線的活性成分，如黃酮類、花青素類、芪類等，這些成分所具有的抗氧化作用或許是造成大花黃牡丹種皮抗氧化活性高的原因。大花黃牡丹籽油的自由基清除率為30.14%，河南產(chǎn)牡丹與之接近為27.33%，山東產(chǎn)牡丹和安徽產(chǎn)牡丹的清除率不足20.00%，僅江蘇產(chǎn)牡丹的清除率(37.56%)高于大花黃牡丹；而Fe3+還原能力測(cè)定結(jié)果表明，大花黃牡丹籽油的還原能力雖然最高，為0.24 Abs，但與其他幾個(gè)產(chǎn)地牡丹樣品測(cè)定結(jié)果相差不大，由此可見(jiàn)大花黃牡丹籽油的抗氧化活性與牡丹相較并不明顯。

牡丹籽油無(wú)急性毒性、遺傳性毒性和亞急性毒性，食用安全性高。因此，牡丹籽油被營(yíng)養(yǎng)學(xué)家稱為“世界上最好的油”。亞麻酸是人體所需的重要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，牡丹籽油富含亞麻酸，有廣闊的發(fā)展前景。牡丹籽油中維生素E和角鯊烯具有較強(qiáng)抗氧化作用，而功能性脂肪酸和甾醇等活性物質(zhì)也具有清除自由基作用，以上成分或是牡丹籽油抗氧化活性的來(lái)源[21]。研究發(fā)現(xiàn)，牡丹籽油極易被皮膚吸收，可廣泛應(yīng)用于食品化妝品領(lǐng)域，具有抗衰老、防紫外線、消炎等功能[22]；牡丹籽油的生產(chǎn)過(guò)程中還會(huì)產(chǎn)生大量副產(chǎn)品，如蛋白質(zhì)和藥用成分含量較高的牡丹籽餅。目前，已將其深加工為牡丹蛋白質(zhì)粉、牡丹營(yíng)養(yǎng)棒和牡丹休閑食品等。而籽餅中所含亞麻酸、亞油酸、牡丹酚和牡丹皂甙等藥用成分，經(jīng)過(guò)純化后可作為醫(yī)藥原料。牡丹種皮具有較好的抗氧化功效，其制品已應(yīng)用于藥品、保健品和化妝品領(lǐng)域[23]。由此可見(jiàn)，將大花黃牡丹種子進(jìn)一步加工成有長(zhǎng)期經(jīng)濟(jì)效益的高附加值產(chǎn)品，必將產(chǎn)生良好的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。