吳 凡，李澤庚，朱 潔， 王小樂(lè)，高雅婷2,，楊勤軍，吳 迪，丁煥章

1安徽中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，合肥 230012；2安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院；3安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院中醫(yī)呼吸病防治研究所； 4安徽省教育廳中醫(yī)藥防治肺系重大疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，合肥 230038

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是一種以氣流受限，氣體交換異常，黏液高分泌及肺動(dòng)脈高壓等為特征的異質(zhì)性疾病[1]。COPD在中醫(yī)上多以肺脹、咳嗽及喘證命名，發(fā)病以虛、痰、瘀為主要病機(jī)，氣虛為本，多始于肺臟、傳于脾臟、終及腎臟，肺脾腎三臟功能失調(diào)，津液代謝失常則成痰飲，血瘀、痰濁、水飲交錯(cuò)為患。補(bǔ)氣為治療COPD的重要治則之一。中醫(yī)藥治療效果明確，具有改善咳喘癥狀、提高生活質(zhì)量的作用。

新安固本培元派作為新安醫(yī)學(xué)中最具代表性的醫(yī)學(xué)流派分支，以“培補(bǔ)脾腎、顧護(hù)元?dú)狻睘閷W(xué)術(shù)主張，通過(guò)固護(hù)人體后天之本而達(dá)到扶正祛邪、治病愈疾的目的。固本關(guān)鍵在固肺、脾、腎三臟之氣，培元核心在補(bǔ)益氣血陰陽(yáng)之偏。清代休寧醫(yī)家汪文綺云“脾為倉(cāng)廩之官……若久咳而滋補(bǔ)無(wú)功，須培養(yǎng)脾元，補(bǔ)母以及其子”。歙縣名醫(yī)程文囿：“肺金之虛，多由腎水之涸……若陰損于下，陽(yáng)孤于上……是咳雖在肺，而實(shí)在腎”。新安固本培元理論以調(diào)氣血、固脾胃、補(bǔ)腎氣為治療特色，對(duì)于COPD的防治特色突出，療效明確[2]。

本文通過(guò)關(guān)聯(lián)規(guī)則挖掘出新安固本培元醫(yī)案中治療COPD常用藥對(duì)為人參(Ginseng Radix et Rhizoma，GRR)與黃芪(Astragali Radix，AR)配伍。人參-黃芪成分眾多，治療COPD機(jī)制尚不明確。對(duì)人參-黃芪藥對(duì)開(kāi)展網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究，進(jìn)一步明確人參-黃芪活性成分及作用靶點(diǎn)，并分析其治療COPD的作用機(jī)制，可以為人參-黃芪治療COPD提供理論依據(jù)，對(duì)于闡釋新安固本培元理論也有積極意義。

1 資料與方法

1.1 COPD相關(guān)醫(yī)案收集

選取《石山醫(yī)案》《孫文垣醫(yī)案》《杏軒醫(yī)案》《程茂先醫(yī)案》《素圃醫(yī)案》《程敬通醫(yī)案》《吳氏醫(yī)驗(yàn)錄》及《馮塘醫(yī)案》等新安醫(yī)籍中涉及“肺脹”“咳嗽”“喘證”的醫(yī)案，臨床表現(xiàn)及病史符合《內(nèi)科學(xué)》COPD特征，初步檢索獲取醫(yī)案205篇，去重后嚴(yán)格按照納入標(biāo)準(zhǔn)和排除標(biāo)準(zhǔn)去除53篇醫(yī)案，最后納入分析醫(yī)案152篇。

納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)癥狀符合慢性阻塞性肺疾病表現(xiàn)；(2)醫(yī)案記錄比較完整，包括主癥和方藥等記錄；(3)醫(yī)案記載，有確切療效，能夠改善相關(guān)臨床癥狀。

排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)只有癥狀及發(fā)病過(guò)程論述，或只有方藥；(2)單純針灸治療；(3)失治誤治醫(yī)案(醫(yī)案記錄中明確指出有誤的醫(yī)案)。

1.2 運(yùn)用Apriori關(guān)聯(lián)規(guī)則算法挖掘藥對(duì)

將中藥名稱(chēng)標(biāo)準(zhǔn)化后錄入Excel表格，例如將“法半夏”“清半夏”統(tǒng)一命名為“半夏”，將“炙甘草”“生甘草”統(tǒng)一命名為“甘草”，建立中藥數(shù)據(jù)庫(kù)。運(yùn)用SPSS Modeler軟件處理數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)中藥，運(yùn)用Apriori關(guān)聯(lián)規(guī)則算法建立數(shù)據(jù)挖掘模型，得出使用頻率最高的藥對(duì)[3]。

1.3 藥對(duì)中所含化學(xué)成分的收集與篩選

在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)中收集藥對(duì)的主要化學(xué)成分。結(jié)合口服生物利用度(oral bioavailability,OB≥30%)和類(lèi)藥性(drug likeness,DL≥0.18)篩選所收集到的化學(xué)成分，建立藥對(duì)的化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)[4]。將上面收集到的靶蛋白在數(shù)據(jù)庫(kù)UniProt(https://www.uniprot.org)中進(jìn)行校正，選擇物種為人(Homo sapiens)，校正靶點(diǎn)蛋白信息并轉(zhuǎn)化為gene symbol，建立藥物的靶基因數(shù)據(jù)庫(kù)。

1.4 COPD與藥對(duì)相關(guān)靶點(diǎn)收集

通過(guò)TTD數(shù)據(jù)庫(kù)(http://db.idrblab.net/ttd/)、OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)(https://omim.org/)、GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.genecards.org/)，檢索關(guān)鍵詞“chronic obstructive pulmonary disease”收集COPD相關(guān)基因，其中GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)relevance score≥30，三個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)整合并去重得到COPD相關(guān)基因，并與中藥活性成分靶基因進(jìn)行映射篩選共同靶點(diǎn)，即為藥對(duì)活性成分治療COPD的靶點(diǎn)。

1.5 “化合物-靶點(diǎn)”的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及可視化分析

利用Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建藥物活性成分-關(guān)鍵靶點(diǎn)基因網(wǎng)絡(luò)圖。網(wǎng)絡(luò)中各節(jié)點(diǎn)(node)分別代表活性成分和靶點(diǎn)基因；網(wǎng)絡(luò)中邊(edge)用來(lái)連接活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)基因；連接到網(wǎng)絡(luò)的節(jié)點(diǎn)以度值(degree)為單位進(jìn)行表示，某節(jié)點(diǎn)與其他節(jié)點(diǎn)連接的邊數(shù)越多，則說(shuō)明該節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中扮演的角色越重要，度值也越大。

1.6 蛋白網(wǎng)絡(luò)互作構(gòu)建及拓?fù)浞治?/h3>

采用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)人參黃芪與COPD的交集靶點(diǎn)進(jìn)行蛋白質(zhì)相互作用分析。物種限定為人，通過(guò)設(shè)定最小相互作用得分(interaction score)>0.4，獲得交集靶點(diǎn)的PPI(protein-protein interaction)網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)，保存“TSV”格式文件，利用Cytoscape 3.7.2軟件分析所獲得的蛋白相互作用并建立網(wǎng)絡(luò)圖。

1.7 GO生物學(xué)功能及KEGG通路富集分析

應(yīng)用metascape數(shù)據(jù)平臺(tái)(https://metascape.org/)對(duì)篩選出的共同靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能注釋和KEGG通路富集分析，選擇種族人類(lèi)(Homo sapiens)，設(shè)定P≤0.01，其余保持默認(rèn)，分析人參-黃芪治療COPD潛在的生物過(guò)程和信號(hào)通路。利用微生信在線(xiàn)平臺(tái)(http://www.bioinformatics.com.cn/)繪制GO分析條狀圖以及KEGG富集氣泡圖。

1.8 成分-靶點(diǎn)分子對(duì)接

登錄TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)下載山奈酚(kaempferol)、人參皂苷Rh2(ginsenoside Rh2)及常春藤皂苷元(hederagenin)三種活性成分的主要成分結(jié)構(gòu)，對(duì)3D結(jié)構(gòu)進(jìn)行能量最小化后保存，利用Autodock Tools 1.5.6軟件生成pdbqt格式。然后登錄PDB數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.rcsb.org)下載AKT1(PDBID:1H10)、IL6(PDBID:7NXZ)、CXCL8(PDBID:6N2U)、MAPK1(PDBID:7NR9)及TNF-α(PDBID:7ATB)等5個(gè)靶點(diǎn)蛋白3D晶體結(jié)構(gòu)，對(duì)其去水、配體，加氫，重新計(jì)算電荷；然后將活性成分文件導(dǎo)入，檢測(cè)總電荷，分配電荷，查看柔性可旋轉(zhuǎn)鍵。最后使用Autodock程序進(jìn)行分子對(duì)接，計(jì)算結(jié)合能大小。Pymol軟件將結(jié)果可視化。結(jié)合能絕對(duì)值>4.25代表分子與靶點(diǎn)初步具有結(jié)合能力，結(jié)合能絕對(duì)值>5.0代表較強(qiáng)結(jié)合能力，結(jié)合能絕對(duì)值>7.0代表很強(qiáng)結(jié)合能力[5]。

2 結(jié)果

2.1 運(yùn)用關(guān)聯(lián)規(guī)則獲取藥對(duì)

納入醫(yī)案處方152例，涉及中藥217味，總頻次1 962次，中藥類(lèi)別包括補(bǔ)虛藥、化痰止咳平喘藥、解表藥、清熱藥等18大類(lèi)?；卺t(yī)案處方中藥，運(yùn)用SPSS Modeler中的Apriori進(jìn)行建模，選取支持度≥0.11，置信度≥0.75，進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，得到二項(xiàng)關(guān)聯(lián)(見(jiàn)表1)，其關(guān)聯(lián)關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖見(jiàn)圖1。其中，置信度最高且關(guān)聯(lián)性強(qiáng)的藥對(duì)是人參-黃芪，置信度為90.91%，支持度為25.00%。

表1 治療COPD處方中藥物的關(guān)聯(lián)規(guī)則(置信度≥0.75)Table 1 Association rules for drugs in the treatment of COPD (confidence≥0.75)

續(xù)表1(Continued Tab.1)

圖1 藥物關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)圖Fig.1 Drug association network diagram

2.2 所含化學(xué)成分收集與篩選

在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)，設(shè)置篩選條件為OB≥30%、DL≥0.18后得到人參化學(xué)成分22個(gè)，黃芪化學(xué)成分20個(gè)，剔除沒(méi)有靶點(diǎn)的化學(xué)成分，人參化學(xué)成分17個(gè)，黃芪化學(xué)成分17個(gè)，山奈酚為二藥共同成

分，其中共計(jì)篩選到化學(xué)成分33個(gè)，詳見(jiàn)表2。通過(guò)Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建化學(xué)成分與治療靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖(見(jiàn)圖2)。圖2共有216個(gè)節(jié)點(diǎn)、587條邊，三角形代表活性成分，圓形為靶點(diǎn)基因。

表2 人參-黃芪活性成分Table 2 Active ingredient of Ginseng Radix et Rhizoma-Astragali Radix

圖2 人參-黃芪主要活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 Main active ingredient-target network of Ginseng Radix et Rhizoma-Astragali Radix

2.3 疾病和藥物相關(guān)靶點(diǎn)的篩選

在GeneCards、OMIM及TTD中以“chronic obstructive pulmonary disease”為關(guān)鍵詞，檢索COPD相關(guān)靶基因，去重后得到靶基因946個(gè)，并與人參-黃芪活性成分治療的靶基因取交集并繪制維恩圖(見(jiàn)圖3)。圖中共同靶點(diǎn)64個(gè)，說(shuō)明這些基因可能在人參-黃芪治療COPD過(guò)程中，發(fā)揮一定作用，為進(jìn)一步闡釋人參-黃芪治療COPD的作用機(jī)制，將這64個(gè)靶點(diǎn)作為目標(biāo)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行分析。

2.4 關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白-蛋白相互作用分析

在STRING數(shù)據(jù)庫(kù)中分析64個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)之間的相互作用關(guān)系并導(dǎo)出結(jié)果。將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2獲取PPI網(wǎng)絡(luò)，圖中顏色越深、圓圈越大則得分越高(見(jiàn)圖4)。可以看出，這64個(gè)靶點(diǎn)間有相互作用，表明這些靶點(diǎn)相互聯(lián)系，并通過(guò)多途徑、多方面的協(xié)調(diào)來(lái)起到治療COPD。經(jīng)拓?fù)浞治?，度?degree值)排名前10的靶點(diǎn)依次為IL6、TNF、AKT1、TP53、MMP9、MAPK1、CXCL8、PTGS2、EIL1B、FOS，表明這些基因在人參-黃芪治療COPD過(guò)程中具有重要意義。

2.5 GO生物學(xué)功能和KEGG通路富集分析

用Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)，從生物過(guò)程、分子功能和細(xì)胞組成3個(gè)模塊對(duì)64個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集分析，生物過(guò)程(biological process，BP)條目1 629條，主要涉及細(xì)胞分化、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、上皮細(xì)胞增殖及氧化應(yīng)激等；分子功能(molecular function，MF)條目48條，主要涉及轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，受體調(diào)節(jié)，信號(hào)受體激活、受體配體活動(dòng)及生長(zhǎng)因子活動(dòng)等；細(xì)胞組分(cellular component，CC)條目91條，主要涉及胞質(zhì)核周區(qū)域、細(xì)胞外基質(zhì)、線(xiàn)粒體外膜、細(xì)胞器外膜及膜微結(jié)構(gòu)域等，具體GO功能分析結(jié)果可見(jiàn)圖5。KEGG分析結(jié)果顯示，P≤0.01的通路共計(jì)133條。結(jié)合表3和圖6，每條通路的P值從小至大進(jìn)行排序，與人參-黃芪治療COPD相關(guān)的通路有PI3K-Akt信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路、Th17細(xì)胞分化及MAPK信號(hào)通路等。

圖3 疾病靶點(diǎn)基因與人參-黃芪靶點(diǎn)基因Veen圖Fig.3 Veen diagram of disease target genes and Ginseng Radix-Astragali Radix target genes

圖4 關(guān)鍵靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖Fig.4 PPI network diagram of key targets

圖5 GO富集分析柱狀圖Fig.5 GO enrichment analysis histogram

表3 KEGG通路富集分析(前14條)Table 3 KEGG pathway enrichment analysis (Top 14)

續(xù)表3(Continued Tab.3)

圖6 KEGG通路富集分析氣泡圖Fig.6 Bubble diagram of KEGG pathway enrichment analysis

2.6 分子對(duì)接結(jié)果

使用Cytoscape 3.7.2中的插件cytoNCA、cytoHubba篩選出degree值排名前十的主要作用靶點(diǎn)，選擇出人參、黃芪degree值得出評(píng)分較高的活性成分。結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道[6]，人參皂苷Rh2及常春藤皂苷元均有增強(qiáng)免疫作用，對(duì)于慢性支氣管炎具有一定的治療作用，人參、黃芪共同化學(xué)成分山奈酚具有抗炎、抗腫瘤、同時(shí)對(duì)肺損傷具有防治作用[7]；選擇上述三種化合物，根據(jù)KEGG分析得到得通路，運(yùn)用PyMOL、AutoDock Vina等軟件對(duì)人參-黃芪的關(guān)鍵成分及主要靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接，對(duì)上述三種化合物作用于AKT1、IL6、CXCL8、MAPK1及TNF-α的結(jié)合能進(jìn)行對(duì)接并打分。根據(jù)文獻(xiàn)[8-10]結(jié)合TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)查詢(xún)結(jié)果，以白藜蘆醇(PubChem Cid：445154)作為AKT1陽(yáng)性對(duì)照藥、槲皮苷(PubChem Cid：5280343)作為CXCL8陽(yáng)性對(duì)照藥、木犀草素(PubChem Cid：5280445)作為IL6陽(yáng)性對(duì)照藥、異槲皮苷(PubChem Cid：5280804)作為MAPK1陽(yáng)性對(duì)照藥及苯甲酸(PubChem Cid：243)作為T(mén)NF-α陽(yáng)性對(duì)照藥。表4可得出，人參皂苷Rh2、常春藤皂苷元及山奈酚與AKT1、IL6、CXCL8、MAPK1及TNF-α均有較強(qiáng)的親和力。同時(shí)運(yùn)用PyMOL、LigPlot+軟件制作了AKT1與人參皂苷Rh2、山奈酚，MAPK1與山奈酚，IL6與人參皂苷Rh2的3D對(duì)接示意圖見(jiàn)圖7。

表4 活性成分與靶點(diǎn)受體蛋白間的最低結(jié)合能Table 4 Minimum binding energy between active ingredients and target proteins

圖7 靶點(diǎn)受體蛋白與活性成分的對(duì)接模式和相互關(guān)系模擬Fig.7 Simulation of docking mode and interaction between target receptor protein and active component注：A：AKT1-人參皂苷Rh2；B：AKT1-山奈酚；C：MAPK1-山奈酚；D：IL6-人參皂苷Rh2。Note:A:AKT1-ginsenoside Rh2;B:AKT1-kaempferol;C:MAPK1-kaempferol;D:IL6-ginsenoside Rh2.

3 討論與結(jié)論

咳嗽、喘息、氣短，動(dòng)則加重及畏風(fēng)等作為肺氣虛證常見(jiàn)癥狀，最早見(jiàn)于COPD病理過(guò)程，肺氣虛漸進(jìn)性發(fā)展，影響及脾，發(fā)展為肺脾氣虛，兼見(jiàn)納呆或食少，胃脘脹滿(mǎn)或腹脹或便溏等；病情進(jìn)一步發(fā)展，可出現(xiàn)呼多吸少，呼吸表淺甚至氣少不足以吸等腎氣不足證候的癥狀，可見(jiàn)肺脾腎氣虛[11]。COPD穩(wěn)定期治療以補(bǔ)肺健脾補(bǔ)腎為主，兼顧行氣、化痰、活血，穩(wěn)定期有效防治對(duì)于減少急性發(fā)作次數(shù)、改善患者感受、延緩病理改變和病情進(jìn)展有積極意義。

在固本培元理論指導(dǎo)下，新安醫(yī)家通過(guò)補(bǔ)益肺、脾、腎之氣，恢復(fù)臟腑氣血功能，以祛痰瘀、水飲等病理產(chǎn)物，與COPD穩(wěn)定期治療高度契合。通過(guò)Apriori關(guān)聯(lián)規(guī)則分析目標(biāo)數(shù)據(jù)庫(kù)里的用藥規(guī)律得到人參與黃芪同時(shí)配伍治療COPD置信度最高。以汪機(jī)為代表的新安醫(yī)學(xué)固本培元醫(yī)家，認(rèn)為“參芪不惟補(bǔ)陽(yáng)，而亦補(bǔ)陰”，臨床擅用人參、黃芪，重固脾胃，補(bǔ)益氣血，平調(diào)陰陽(yáng)。明代祁門(mén)醫(yī)家陳嘉謨《本草蒙筌》云：“人參可定喘嗽，通暢血脈，瀉陰火……肺寒受邪，短氣少氣，虛喘宜用”。歙縣名醫(yī)汪昂《本草備要》：“黃芪炙用補(bǔ)中，益元?dú)?，溫三焦，壯脾胃……脾胃緩和，則肺氣旺而肌表固實(shí)，補(bǔ)中即所以固表也。二藥備受新安醫(yī)家喜愛(ài)，合用而固本培元、健脾補(bǔ)肺、培土生金，符合COPD穩(wěn)定期肺脾氣虛證的基本病機(jī)。近代臨床研究表明，以人參-黃芪為君藥的方藥對(duì)于COPD穩(wěn)定具有良好的治療作用，Dou等[12]研究發(fā)現(xiàn)自擬補(bǔ)肺益腎湯(黨參、生黃芪、五味子等)可以降低慢阻肺肺腎氣虛型患者的中醫(yī)證候積分，升高PaO2，減少CO2潴留。

通過(guò)Cytoscape 3.7.2中的插件cytoNCA挖掘人參-黃芪中33個(gè)活性成分，參考degree排名，結(jié)合研究文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)山奈酚、人參皂苷Rh2及常春藤皂苷元等成分發(fā)揮著重要的作用。山奈酚具一種有二苯基丙烷結(jié)構(gòu)的低分子量的黃色化合物，由4-香豆酰輔酶A與三個(gè)丙二酰輔酶A縮合而成，能夠通過(guò)抑制NF-κB與髓系分化因子88(MYD88)的結(jié)合活性，抑制炎癥反應(yīng)的發(fā)生[13]。人參皂苷Rh2是人參中主要的生物活性皂苷之一，從結(jié)構(gòu)上看，Rh2可分為S型和R型兩種構(gòu)型，其中20(S)-Rh2單體是從中草藥中分離得到的主要構(gòu)型，研究顯示人參皂苷Rh2通過(guò)調(diào)節(jié)TGF-β1/Smad通路有效地抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化和促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生[14]。常春藤皂苷元是一種天然存在的三萜類(lèi)化合物，在A環(huán)的C-4位帶有羥甲基，高度不溶于水，能夠可抑制NF-κB和p-IκBα的核轉(zhuǎn)位，從而抑制NF-κB的活化，抑制內(nèi)毒素誘導(dǎo)的細(xì)胞NF-κB水平和NF-κB的核轉(zhuǎn)位發(fā)揮抗炎作用[15]。

通過(guò)對(duì)交集靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能分析，發(fā)現(xiàn)人參-黃芪可能在胞質(zhì)核周、細(xì)胞外基質(zhì)、線(xiàn)粒體外膜區(qū)域，調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、受體調(diào)節(jié)、信號(hào)受體激活、配體活動(dòng)等分子功能，發(fā)揮抗氧化應(yīng)激、延緩炎癥及抑制細(xì)胞凋亡和上皮細(xì)胞增殖等生物過(guò)程。KEGG通路富集分析顯示，這些靶點(diǎn)參與了PI3K-Akt信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、細(xì)胞因子受體相互作用信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路、Jak-STAT信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、T細(xì)胞受體信號(hào)通路、Th17細(xì)胞分化及Foxo信號(hào)通路等。應(yīng)用Cytoscape中的cytoHubba插件篩選出degree值排名前十的核心基因，依據(jù)文獻(xiàn)[16]及KEGG富集分析的結(jié)果，選擇Toll樣受體(toll-like receptors，TLRs)和Th17細(xì)胞分化信號(hào)通路進(jìn)行深入分析，得出兩條通路富集的核心基因有AKT1、IL6、CXCL8、MAPK1及TNF-α等。TLRs是固有免疫中關(guān)鍵的模式識(shí)別受體，在吸煙、有害氣體及微生物等因素的影響下，TLRs成跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，再通過(guò)依賴(lài)于MYD88的NF-κB通路調(diào)控炎癥基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯和表達(dá)，產(chǎn)生并釋放IL-6、IL-8、COX-2、PGE2等炎性因子，在損傷細(xì)胞同時(shí)，又作為內(nèi)源性配體與中性粒細(xì)胞、NK細(xì)胞等表面受體結(jié)合，合成并釋放大量炎癥介質(zhì)和募集炎癥細(xì)胞，導(dǎo)致肺部炎癥反應(yīng)級(jí)聯(lián)被放大并持續(xù)存在，TLR2、TLR4、TLR9都參與了COPD的發(fā)病過(guò)程，其中TLR4被認(rèn)為是維持COPD炎癥反應(yīng)的主要TLRs[17]。輔助性T細(xì)胞17(T helper cell 17，Th17)是輔助性T淋巴細(xì)胞中的一個(gè)特殊亞群主要分泌白細(xì)胞介素17(interleukin 17，IL-17)和其他炎癥細(xì)胞因子，在慢性氣道炎癥性疾病中與成纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞表面的受體結(jié)合而發(fā)生免疫反應(yīng)，誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞的增殖和聚集，造成氣道上皮損傷，介導(dǎo)纖維化[18]；與Th17細(xì)胞相比，Treg細(xì)胞具有免疫調(diào)節(jié)功能，并分泌抗炎細(xì)胞因子來(lái)增強(qiáng)免疫耐受性和抑制炎癥反應(yīng)，Th17/Treg失衡被認(rèn)為是COPD發(fā)生的重要誘因[19]。AKT是進(jìn)化上高度保守的一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，AKT的活化能抑制FOXO3a的轉(zhuǎn)錄活性，誘導(dǎo)p53/p21途徑參與香煙誘導(dǎo)支氣管上皮細(xì)胞的衰老[20]。IL-6作為細(xì)胞因子之一能夠促進(jìn)Th17(輔助性T細(xì)胞17)分化通路，并誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子如IL-17(白介素17)和CXCL8(趨化因子8)的產(chǎn)生，促進(jìn)COPD發(fā)展[21]。CXCL8是中性粒細(xì)胞炎癥介質(zhì)，CXCL8和其他由肺巨噬細(xì)胞分泌的趨化因子在外界刺激(香煙煙霧、空氣污染物)下協(xié)調(diào)中性粒細(xì)胞(PMN)向肺部的運(yùn)輸，中性粒細(xì)胞和其他炎性細(xì)胞堆積產(chǎn)生的蛋白酶分泌會(huì)導(dǎo)致持續(xù)的廣泛的組織損傷，還刺激氣道上皮，使其收縮，增加其對(duì)炎癥細(xì)胞的通透性，參與COPD的發(fā)病[22]。TNF-α為一種重要的炎癥介質(zhì)，能與香煙煙霧、LPS等協(xié)同活化炎癥細(xì)胞的NF-κB系統(tǒng)，刺激IL-8等細(xì)胞因子的釋放，使中性粒細(xì)胞數(shù)量增加，還能誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP-9、MMP-12等)釋放，破壞肺泡壁而加重COPD進(jìn)展[23]。MAPK1(絲裂原活化蛋白激酶1)是細(xì)胞內(nèi)絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在進(jìn)化過(guò)程中高度保守，在活化進(jìn)入細(xì)胞核之前位于細(xì)胞質(zhì)中，可以通過(guò)磷酸化轉(zhuǎn)錄因子來(lái)改變基因表達(dá)，促進(jìn)炎癥因子TNF-α、IL-1、IL-6等的產(chǎn)生[24]，誘導(dǎo)一系列炎癥和免疫反應(yīng)，從而在COPD的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮作用[25]。AKT1、IL6、CXCL8、TNF-α、MAPK1為富集于Toll樣受體信號(hào)通路和Th17細(xì)胞分化信號(hào)通路的關(guān)鍵靶點(diǎn)，各基因之間也存在交互調(diào)控作用，可能通過(guò)炎癥免疫影響COPD的發(fā)病和進(jìn)程。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果的可靠性，利用分子對(duì)接技術(shù)將核心成分和關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，核心成分山奈酚、人參皂苷Rh2及常春藤皂苷元與AKT1、IL6、CXCL8、MAPK1及TNF-α的結(jié)合能均小于-21.4 kJ/mol，其中AKT1與人參皂苷Rh2、常春藤皂苷元的結(jié)合能為-44.8 kJ/mol，表明他們之間有強(qiáng)烈的結(jié)合活性。上述結(jié)果表明AKT1、IL6、CXCL8、MAPK1及TNF-α可能是人參-黃芪發(fā)揮作用的重要靶點(diǎn)。

綜上所述，通過(guò)數(shù)據(jù)挖掘證實(shí)新安醫(yī)學(xué)固本培元派醫(yī)家善用人參-黃芪藥對(duì)治療COPD，采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法構(gòu)建“化合物-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，從整體上分析人參-黃芪成分、靶點(diǎn)、信號(hào)通路之間的相互作用關(guān)系，推測(cè)人參-黃芪通過(guò)山奈酚、人參皂苷Rh2及常春藤皂苷元等潛在藥效成分協(xié)同作用于AKT1、IL6、CXCL8、MAPK1及TNF-α等多個(gè)靶點(diǎn)，通過(guò)Toll樣受體信號(hào)通路和Th17細(xì)胞分化信號(hào)通路等發(fā)揮抗炎及調(diào)節(jié)免疫等作用治療COPD。初步揭示了人參-黃芪藥對(duì)通過(guò)多成分、多靶點(diǎn)、多通路治療COPD的機(jī)制，后續(xù)可對(duì)人參-黃芪藥對(duì)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，篩選該藥對(duì)主要成分作用于香煙煙霧誘導(dǎo)的氣道上皮細(xì)胞模型，檢測(cè)核心靶蛋白的表達(dá)，深入探討關(guān)鍵作用機(jī)制，為COPD治療藥物的研發(fā)提供新的方向及依據(jù)。