李卓蔚，袁 林，葉明燕，蘭國新，周 濃

重慶三峽學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，重慶 404120

滇重樓(Parispolyphyllavar.yunnanensis)為百合科重樓屬多年生草本藥用植物，根莖作為其主要藥用部位，具有解毒止血、抗菌消炎、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤等功效[1]。近些年來，為了緩解市場供應(yīng)需求，滇重樓的人工種植面積被不斷擴增，然而，由于種植技術(shù)的不成熟及化肥的大量施用，嚴重破壞了滇重樓的生長環(huán)境，導(dǎo)致種植的滇重樓品質(zhì)不佳，產(chǎn)量也逐漸降低。因此，找到合理的施肥手段來增加滇重樓的可利用價值，是滇重樓規(guī)范種植體系的熱點領(lǐng)域[2,3]。

近些年來，隨著中藥產(chǎn)業(yè)的迅速發(fā)展，因環(huán)境污染引發(fā)的中藥材重金屬含量超標等問題也獲得了廣泛的關(guān)注。重金屬元素具有高隱蔽、難降解、易富集等特點，容易富集在人體內(nèi)且不易排出體外，當(dāng)人體內(nèi)重金屬含量達到一定量時，就會產(chǎn)生臟器功能性病變，從而誘發(fā)一系列疾病[4]。當(dāng)體內(nèi)汞元素含量超標時，會損傷腦組織，引起神經(jīng)系統(tǒng)失常；過量鎘元素和鉻元素會誘發(fā)腎臟等器官致癌；過量鉛元素會影響人的消化和記憶功能[5]；過量砷元素會對人體的肌肉、血液、免疫系統(tǒng)等多種組織器官產(chǎn)生不利影響[6]。解有機磷細菌作為一種新型的微生物肥料，能礦化有機磷化合物，使土壤中難溶性的有機磷化合物轉(zhuǎn)化為能被植物直接吸收利用的磷元素[7]，增加土壤有效磷含量，從而緩解植物生長缺磷的現(xiàn)象。此外，有大量研究表明，解有機磷菌還能鈍化鉛、鎘、銅等重金屬，即將土壤有機磷中釋放出的磷酸根與重金屬結(jié)合形成磷酸鹽沉淀，降低重金屬在土壤環(huán)境中的移動性和生物可利用性，起到固定或鈍化的作用，從而減輕重金屬造成的危害[8]。解有機磷菌主要包含細菌、真菌和放線菌，其中細菌的種類和數(shù)量最多，研究發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌屬、假單胞菌桿屬、節(jié)桿菌屬中的一些菌株的溶磷能力較強[9,10]，在農(nóng)業(yè)上常被作為磷素菌肥使用。據(jù)報道，解有機磷細菌對玉米[11]、花生[12]等經(jīng)濟作物的有效成分和生長發(fā)育影響具有確切效果并推廣應(yīng)用，不同種類或不同產(chǎn)地滇重樓藥材及土壤重金屬含量等方面的研究結(jié)論已十分成熟[4,13]，Yang等[2]也探究了叢枝菌根真菌對滇重樓根莖及土壤重金屬元素的影響，但接種解有機磷細菌對滇重樓藥材及土壤重金屬含量的影響還未見報道。

因此本研究采取單因素室內(nèi)盆栽的方式，將篩選出的3株解有機磷細菌優(yōu)勢種為菌種[14]，分別接種和組合接種于栽培基質(zhì)中，以滇重樓根莖、須根和根際土壤為研究對象，采用電感耦合等離子體質(zhì)譜法(inductively coupled plasma mass，ICP-MS)對汞(Hg)、鎘(Cd)、鉛(Pb)、鉻(Cr)、砷(As)5種重金屬元素進行檢測，探討解有機磷細菌及其組合對滇重樓根莖、須根及根際土壤重金屬元素含量的影響，以期為滇重樓人工規(guī)范化種植與發(fā)展提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試種苗為同一批長勢良好，且無病蟲害的四年生滇重樓實生苗，由云南省大理州永平縣杉陽鎮(zhèn)普棚村規(guī)范化種植基地(25° 39′13.56′′N，99° 33′58.38′′E)提供，將滇重樓實生苗根系附帶土壤清理干凈后，采用單株低溫干燥保存，以保證種質(zhì)資源的穩(wěn)定性和均一性，并經(jīng)保山中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校楊發(fā)建副教授鑒定；栽培基質(zhì)為普通黃壤土、沙土和有機土按2∶1∶1的比例配制而成，過2 mm篩，采用高壓蒸汽滅菌鍋121 ℃高溫滅菌30 min，取出冷卻密封放置待用；供試菌株為課題組前期從滇重樓根際土壤中分離篩選出的3株溶磷效果最佳的解有機磷細菌，分別為運動芽孢桿菌(Bacillusmycoides)、維德曼芽孢桿菌(Bacilluswiedmannii)、蛋白水解芽孢桿菌(Bacillusproteolyticus)，活化后，用移液槍取少量菌液接種于裝有牛肉膏蛋白胨液培養(yǎng)基的三角瓶中培養(yǎng)，培養(yǎng)菌懸液密度至1×106CFU/mL，每種解有機磷細菌菌懸液培養(yǎng)約4 L。

1.2 儀器和試劑

SPX-80型生化培養(yǎng)箱(上海躍進醫(yī)療器械有限公司);金牛4010型微波消解儀(南京瑞尼克科技開發(fā)有限公司);EXPEC 7000型電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(杭州聚光科技股份有限公司)。Hg(GSB04-1729-2004，1 000 μg/mL)、Cd(GSB04-1721-2004，1 000 μg/mL)、Pb(GSB04-1742-2004，1 000 μg/mL)、Cr(GSB04-1723-2004，1 000 μg/mL)、As(GSB04-1714-2004，1 000 μg/mL)，購自國家有色金屬及電子材料分析測試中心。實驗試劑為優(yōu)級純，水為純凈水。所有玻璃器皿采用15%硝酸浸泡24 h，蒸餾水沖洗干凈后烘干備用。

1.3 試驗設(shè)計

試驗采用室內(nèi)盆栽的方法，于2020年12月在貴州省安順市安順學(xué)院(26° 24′95.21′′N，105°90′75.95′′E)的試驗種植基地進行種植。試驗共分為8組，包括7個試驗處理組(S1～S7)和1個對照組(CK)，實驗對3株解有機磷細菌優(yōu)勢種采取單株接種、兩兩組合接種以及三種菌混合接種的方式分組培養(yǎng)，處理方式：處理組S1接種菌株B.mycoides、處理組S2接種菌株B.wiedmannii、處理組S3接種菌株B.proteolyticus、處理組S4接種菌株B.mycoides和B.wiedmannii、處理組S5接種菌株B.mycoides和B.proteolyticus、處理組S6接種菌株B.wiedmannii和B.proteolyticus、處理組S7接種菌株B.mycoides、B.wiedmannii和B.proteolyticus，CK組不接種處理。每組重復(fù)10次，每盆種植5株生長狀況良好的滇重樓實生苗，菌懸液接種量為150 mL/盆，栽培期間按照滇重樓植株室內(nèi)栽培標準進行管理。一年后采收滇重樓藥材，將根莖和須根于45 ℃烘箱中烘干，粉碎后過80目篩，密封干燥保存；通過抖根法取其根際土壤，室溫自然風(fēng)干，密封干燥保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 測定指標及方法

1.4.1 滇重樓根莖及須根消解

精密稱取0.2 g滇重樓藥材樣品于消解罐中，平行3次，加入濃HNO38 mL密封，浸泡過夜，采用同法不加樣品制備空白溶液。次日采用Li等[4]方法進行微波消解。

1.4.2 滇重樓根際土壤消解

精密稱取0.2 g根際土壤樣品于消解罐中，平行3次，加入濃HNO37 mL、HF 2 mL和HClO40.6 mL密封，浸泡過夜，采用同法不加樣品制備空白溶液。次日采用Lan等[15]方法進行微波消解。

1.4.3 標準工作液的制備

精密稱取適量混合對照品儲備液，采用2%的稀硝酸逐級稀釋，具體配置濃度參照Huang等[16]方法進行。

1.4.4 元素含量測定

參照Li等[4]方法進行。

1.4.5 藥材重金屬限量標準

藥材限量標準參照《中國藥典》(2020年版)[17]和《食品安全國家標準食品中污染物限量》(GB2762-2017)規(guī)定[18]：Hg≤0.2 mg/kg，Cd≤1.0 mg/kg，Pb≤5.0 mg/kg，Cr≤2.0 mg/kg，As≤2.0 mg/kg。

1.4.6 土壤污染現(xiàn)狀評價方法

已測得CK、S4和S5組pH值大于7.5，S1～S3、S6、S7組pH值介于6.5～7.5之間。參考《土壤環(huán)境質(zhì)量農(nóng)用土壤污染風(fēng)險管控標準》(GB15618-2018)[19]對5種重金屬元素的限量：當(dāng)6.57.5時，Hg≤3.4 mg/kg，Cd≤0.6 mg/kg，Pb≤170 mg/kg，Cr≤250 mg/kg，As≤25 mg/kg。參照《土壤環(huán)境檢測技術(shù)規(guī)范》(HJ/T166-2004)，采用單項污染指數(shù)法和內(nèi)梅羅污染指數(shù)評價標準對滇重樓根際土壤污染情況進行評價[20]，土壤內(nèi)梅羅污染指數(shù)評價標準分級見表1。其中：

土壤單項污染指數(shù)(Pi)=

土壤污染物實測值(Ci)/土壤污染物質(zhì)量標準(Si)

內(nèi)梅羅污染指數(shù)(Pn)=

{[(Pi均2)+(Pi最大2)]/2}1/2

表1 土壤內(nèi)梅羅污染指數(shù)評價標準Table 1 Evaluation standard of soil Nemero pollution index

1.5 數(shù)據(jù)處理

原始數(shù)據(jù)處理采用Excel 2003軟件，方差分析及相關(guān)性分析采用SPSS 22.0軟件，繪圖采用Origian 9.0軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 解有機磷細菌對滇重樓根莖和須根重金屬元素含量的影響

不同解有機磷細菌接種處理后，滇重樓根莖5種重金屬元素含量見圖1。由圖可知，7個處理組中Pb元素的含量均顯著低于CK組(P<0.05)，表明接種解有機磷細菌能夠降低滇重樓根莖對Pb元素的吸收能力，其中含量最低的為S5組，其含量為0.723 mg/kg，僅是CK組含量的12.86%。此外，S5組的Hg和Cd元素含量為最低值，顯著低于CK組，表明S5組的接種處理能有效降低滇重樓根莖對Hg、Cd和Pb 3種重金屬元素的吸收力。Cr和As元素含量最低均為S7組，且都顯著低于CK組，表明3種菌混合處理能有效降低滇重樓根莖對重金屬元素Cr和As的吸收能力。總體上來看，接種解有機磷細菌后對滇重樓根莖中Hg、Cd、Pb和Cr元素含量均有所改善，但對As元素含量的改善效果不明顯，其中，接種效果較好為S5、S6和S7組。參考《中國藥典》(2020年版)和《食品安全國家標準食品中污染物限量》(GB2762-2017)可知，在已獲得的根莖重金屬元素含量中，除CK和S2組的Pb、Cr元素含量以及S5組的Cr元素含量略有超標以外，其余組中的重金屬元素含量均已達標。

滇重樓須根中5種重金屬元素含量如圖2所示。由圖可知，接種處理后須根中Hg元素的含量較CK組均有所降低，表明接種解有機磷細菌能夠降低滇重樓須根對Hg元素的吸收能力，其中含量最低的為S4組，為0.116 mg/kg，僅占CK組含量的12.86%。此外，Cd和Pb元素含量最低的為S4組，且均顯著低于CK組，表明S4組的接種處理方式能有效降低滇重樓須根對Hg、Cd和Pb 3種重金屬元素的吸收力。S7組的Cr和As元素含量均顯著低于CK組，且達到最低，此結(jié)果與根莖中Cr和As元素含量所得相同，表明3種菌混合處理能有效降低滇重樓根莖和須根對Cr和As的吸收能力?？偟膩砜矗臃N解有機磷細菌后對滇重樓須根中Hg、Pb、Cr和As元素含量均有較大改善，而對Cd元素含量的改善效果不明顯，其中，S4和S7組的接種效果表現(xiàn)良好。由對藥材重金屬限量標準規(guī)定可知，除As元素外，其余元素都有一些組超，除S2組的Pb元素外，其余超標均不過2倍。

圖1 接種解有機磷細菌對滇重樓根莖5種重金屬含量的影響Fig.1 Effects of inoculation with organophosphate-degradation bacteria on the contents of five heavy metals in the rhizomes of Paris polyphylla var.yunnanensis注：圖中不同小寫字母代表不同處理組間的差異顯著(P<0.05)，下同。Note:Different lowercase letters in the figure represent significant differences among different treatment groups (P<0.05),the same below.

2.2 解有機磷細菌對滇重樓根際土壤重金屬元素含量的影響及重金屬污染評價

滇重樓根際土壤5種重金屬元素含量變化見圖3，由圖可知，與CK組相比，接種解有機磷細菌后，滇重樓根際土壤中的重金屬含量變化不明顯且無規(guī)律性，表明接種處理對滇重樓根際土壤中的重金屬元素含量不會造成影響，而各組中重金屬含量的微小變化可能是由混土不勻或者實驗過程中的人為誤差造成。由《土壤環(huán)境質(zhì)量農(nóng)用土壤污染風(fēng)險管控標準》(GB15618-2018)對農(nóng)田土壤重金屬限量標準規(guī)定可知，所有處理組中的重金屬含量均達標。單項污染指數(shù)和內(nèi)梅羅污染指數(shù)的評價結(jié)果見表2。由表可知，所有重金屬元素的單項污染指數(shù)均<1，除S1組的內(nèi)梅羅污染指數(shù)介于0.7～1.0之間，土壤處于尚清潔水平，存在被污染的風(fēng)險以外，其余處理組的內(nèi)梅羅污染指數(shù)均<0.7，為清潔土壤水平。

2.3 滇重樓根莖和須根重金屬元素富集系數(shù)

植物體中重金屬元素的富集系數(shù)(BCF)(BCF =元素在植物中的含量/元素在其植物所生長土壤中的含量)能側(cè)面反映植物對其根際土壤中重金屬的富集能力[2]，BCF<0.1表示絕對貧化，0.13.0表示絕對富集[21]。滇重樓根莖和須根重金屬元素的富集系數(shù)見表3。

圖2 接種解有機磷細菌對滇重樓須根5種重金屬含量的影響Fig.2 Effects of inoculation with organophosphate-degradation bacteria on the contents of five heavy metals in fibrous roots of Paris polyphylla var.yunnanensis

圖3 接種解有機磷細菌對滇重樓根際土壤5種重金屬含量的影響Fig.3 Effects of inoculation with organophosphate-degradation bacteria on the contents of five heavy metals in the rhizosphere soil of Paris polyphylla var.yunnanensis

表2 滇重樓根際土壤重金屬污染評價Table 2 Evaluation of heavy metal pollution in the rhizosphere soil of Paris polyphylla var.yunnanensis

由表可知，在滇重樓根莖中，S5組的Hg、Cd和Pb元素BCF最低，S7組的Cr和As元素BCF最低，而CK組的Hg、Cd、Pb和Cr元素的BCF均為最高值，表明接種解有機磷細菌后，能一定程度上降低滇重樓根莖對重金屬元素的吸附。其中，Cd元素的BCF相對較高，CK、S1、S3、S4和S6組的富集能力>0.5，表明滇重樓根莖對Cd元素的吸附能力較強。此外，除CK和S2組的Pb元素以及S1組的As元素的BCF大于0.5以外，其余根莖中的重金屬元素富集能力均偏小，富集能力最小的為Cr元素，表明滇重樓根莖對重金屬Cr的吸附能力較弱。在滇重樓須根BCF中，S4組的Hg、Cd和Pb元素BCF最低，S7組的Cr和As元素BCF最低，CK組的Hg和As元素的BCF最高，表明接種解有機磷細菌后，能緩解滇重樓須根對重金屬元素的吸附能力。其中，在須根中Cd元素的BCF相對較高，S1組的富集能力大于3.0，S7組的富集能力大于1.5，表明滇重樓根莖對Cd元素的吸附能力較強。此外，除CK和S2組中的Pb元素以外，其余須根中的重金屬元素BCF均小于0.5，其中Cr元素的BCF最小，均小于0.1，表明滇重樓須根對Cr的吸附能力較弱，此結(jié)果與根莖的富集系數(shù)結(jié)果相似。

表3 滇重樓根莖和須根富集系數(shù)Table 3 Enrichment coefficients of rhizomes and fibrous roots of Paris polyphylla var.yunnanensis

2.4 相關(guān)性分析

滇重樓根莖、須根及根際土壤中5種重金屬元素相關(guān)性分析如表4所示。由表可知，根莖與須根中的Hg元素呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，相關(guān)系數(shù)為0.771；Pb元素中，須根與根莖呈顯著正相關(guān)，與土壤呈顯著負相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.758和-0.750；根莖及須根中的Hg和Pb元素呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.761和0.811；根莖中的Hg和Cd元素之間呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.807；根莖中的Cr元素與須根中的As元素呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.822；根莖中的As元素與土壤中的Cd元素呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.747。

3 討論與結(jié)論

解有機磷細菌可以通過礦化有機磷化合物，將土壤中難溶性的有機磷化合物轉(zhuǎn)化為植物能直接吸收利用的有效磷，促進滇重樓的生長發(fā)育，進而獲得高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的中藥材[22,23]，同時解有機磷細菌還能固定和鈍化土壤中重金屬元素[8]，使其難以被藥用植物直接吸收，從而減輕中藥材中重金屬元素殘留。在本研究中，與不接種的CK組相比，接種解有機磷細菌后，總體上能降低滇重樓根莖和須根中的重金屬含量，對Pb元素含量的降低程度最為顯著，其原因是解有機磷細菌可以鈍化土壤中的Pb元素，使重金屬Pb由活性高的形態(tài)轉(zhuǎn)化為活性低的形態(tài)，降低其生物有效性[24,25]，從而減少了滇重樓對Pb元素的吸收利用。對Hg和Cr元素含量也有較大改善，且混合接種處理優(yōu)于單接種處理，S6和S7組的接種處理方式對滇重樓的影響效果最佳。參考《中國藥典》(2020年版)和《食品安全國家標準食品中污染物限量》(GB2762-2017)作為滇重樓藥材限量標準，根莖中僅一些處理組中的Pb和Cr略有超出標準，而須根中大部分重金屬已超出限量標準，其原因可能是由于須根表面存在大量根毛，不僅能直接吸收土壤中的各種有害物質(zhì)，還能有效增大與土壤的接觸面積，從而增大對土壤元素的吸收能力[26]。在滇重樓根際土壤中，接種解有機磷細菌后，土壤中的重金屬含量沒有改變。以《土壤環(huán)境質(zhì)量農(nóng)用土壤污染風(fēng)險管控標準》(GB15618-2018)為參考，所有處理組土壤均未超出國家限定標準；而以《土壤環(huán)境檢測技術(shù)規(guī)范》(HJ/T166-2004)為評價標準，所有處理組中的單項污染指數(shù)均<1，除S1組的內(nèi)梅羅指數(shù)大于0.7，土壤屬于尚清潔水平，存在污染風(fēng)險以外，其余處理組的土壤均達到清潔水平。表明本試驗所用的栽培基質(zhì)中的重金屬含量完全符合種植標準，且接種解有機磷細菌后并沒有對土壤造成較大的重金屬污染風(fēng)險，因此對滇重樓植株接種解有機磷細菌的試驗安全有效。

表4 滇重樓根莖、須根及根際土壤中重金屬含量相關(guān)性分析Table 4 Correlation analysis of heavy metal contents in rhizomes,fibrous roots and rhizosphere soils of Paris polyphylla var. yunnanensis

重金屬富集系數(shù)是描述重金屬在生物體內(nèi)累積趨勢的重要指標，側(cè)面反映了植物對其根際土壤中重金屬的富集能力。一般來說，作物對重金屬的富集系數(shù)越小，則表明其吸收重金屬的能力越差，對于土壤重金屬的抗逆性則越強[27]。水稻對Cd的富集作用較強，在種植水稻過程中則需要注意土壤及環(huán)境中Cd的殘留量，避免對Cd的過度富集導(dǎo)致大米中Cd含量超標，從而危害人類健康[28]。本研究中，接種不同解有機磷細菌，滇重樓根莖和須根對Hg、Cd、Pb、Cr、As 5種重金屬元素的富集能力各不相同，其中，Cr元素的富集能力屬于強烈貧化，而對Cd元素生物累積作用則較大，但均顯著低于超富集植物臨界含量標準(1 000 mg/kg)，須根的富集系數(shù)大于根莖，混合接種處理組的富集能力弱于單接種處理組。因此，不考慮將滇重樓須根作為藥用部位，可考慮將效果最佳的兩種接種處理方式作為生物菌肥的參考，應(yīng)用于滇重樓人工種植過程中，從而降低滇重樓藥材的重金屬污染風(fēng)險，而在今后對解有機磷細菌和滇重樓大田推廣栽培實驗中，應(yīng)優(yōu)先對Cd元素進行調(diào)控。

相關(guān)性分析表明，接種解有機磷細菌后，Hg和Pb元素之間的相關(guān)性較大，其他元素的相關(guān)程度則較小，表明接種解有機磷細菌后，滇重樓對根際土壤中Hg和Pb元素的吸收具有顯著的協(xié)同作用；此外，根莖與須根的相關(guān)性強于根際土壤，表明根莖之間、須根之間以及根莖與須根之間的重金屬元素含量相互影響能力較強。因此，在今后的大田栽培中，應(yīng)同時考慮根莖與須根之間以及Hg和Pb元素之間的協(xié)同影響作用。

綜上所述，接種不同解有機磷細菌或復(fù)合菌，能有效降低滇重樓根莖、須根中Hg、Pb和Cr元素含量，從而降低滇重樓藥材重金屬含量超標風(fēng)險，還能有效控制滇重樓根際土壤重金屬污染風(fēng)險。同時，本研究結(jié)果也表明，3種菌混合接種以及混合接種菌株B.wiedmannii和B.proteolyticus這兩種方式對滇重樓的影響效果最佳，因此，可將這兩種解有機磷細菌的接種方式推廣應(yīng)用到滇重樓人工種植過程中，從而為滇重樓人工種植過程中重金屬污染修復(fù)提供參考。