陳旭春，程穎（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院器官移植科，遼寧 沈陽 110001）

由于移植腎器官短缺，尸體供腎的評估及有效合理應(yīng)用非常重要。機(jī)械灌注（machine perfusion，MP）可能通過降低移植腎功能延遲（delayed graft function，DGF）的發(fā)生率和改善移植腎的預(yù)后，從而增加供腎的使用和改善移植結(jié)局。機(jī)械灌注方法有低溫機(jī)械灌注（hypothermic machine perfusion，HMP）、低 溫 氧 合 機(jī) 械 灌 注（hypothermic oxygenated machine perfusion，HOPE）、亞常溫機(jī)器灌注 （subnormothermic machine perfusion， SMP）和常溫氧合機(jī)械灌注（normothermic machine perfusion，NMP）等方法［1-2］。本綜述旨在描述機(jī)器灌注的歷史、常用類型、相對于靜態(tài)冷保存（static cold storage，SCS）的優(yōu)勢、實(shí)際問題、當(dāng)前使用和未來前景。

1 機(jī)械灌注的歷史

1849 年，Loebell［3］首次通過豬腎的血管對腎臟上進(jìn)行了體外灌注，注入了抗凝血液，觀察到尿液形成。20 世紀(jì)30 年代，Carrel 等［4］設(shè)計(jì)了第一臺使用人工營養(yǎng)介質(zhì)的灌注設(shè)備，并提出器官可以儲存在封閉系統(tǒng)中。然而，用于移植的體外灌注器官保存技術(shù)難度大，成本高昂，很快就不受歡迎。20 世紀(jì)50 年代末，Schloerb 等［5］描述，如果將器官儲存在低溫介質(zhì)中，器官可以保存更長的時(shí)間。1962 年，Humphries 等［6］應(yīng)用低溫保存血漿在脈沖灌注泵中對犬的腎臟進(jìn)行機(jī)械灌注，灌注24 h 后成功地進(jìn)行了犬自體腎移植。隨后Collins等［7］使用晶體溶液代替血漿，也獲得了動物試驗(yàn)的成功。1967 年，Belzer 等［8］在器官移植的機(jī)器灌注方面取得了實(shí)際可行的突破。但是由于靜態(tài)冷保存的簡單性、經(jīng)濟(jì)可行性以及機(jī)器灌注效果的不確定性，因此靜態(tài)冷保存在半個世紀(jì)的時(shí)間內(nèi)仍然是主要的保存技術(shù)［9］。然而過去的10 ～15 年內(nèi)，機(jī)械灌注重新引起了人們的興趣，并且獲得了很多積極的結(jié)果［10］。

2 低溫機(jī)械灌注

HMP 是目前用于腎臟保存的最常用的機(jī)器灌注類型。在HMP 中，灌注液是無細(xì)胞膠體液，灌注溫度控制在1 ～ 8℃。無論是靜態(tài)冷保存還是HMP，都是通過降低器官代謝率和氧需求來延長器官的保存時(shí)限。HMP 的其他益處包括含灌注液的活躍循環(huán)、清除代謝產(chǎn)物和器官內(nèi)血流動力學(xué)的改善，以及其他潛在機(jī)制比如內(nèi)皮保護(hù)作用。

有很多關(guān)于靜態(tài)冷保存與HMP 對移植物功能影響的對比研究。HMP 有助于立即改善腎臟微循環(huán)，這種作用可能是通過保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞抵抗缺血/再灌注損傷和減少凋亡［11］。有很多研究證明HMP 顯著降低了DGF 的發(fā)生率和持續(xù)時(shí)間。在最近發(fā)表的一項(xiàng)涉及14 項(xiàng)臨床試驗(yàn)的薈萃分析中［12］，與SCS（來自14 項(xiàng)研究的2138 例參與者，RR ＝0.77；0.67 ～ 0.90，P ＝0.0006） 相 比，HMP 降 低 了所有類型供腎的DGF 風(fēng)險(xiǎn)，包括腦死亡后捐贈（donation after brain death，DBD）和心臟死亡捐獻(xiàn)（donation after cardiac death，DCD）。在另一項(xiàng)薈萃分析中也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果［13］，包括7 項(xiàng)隨機(jī)對照試驗(yàn)和11 項(xiàng)非隨機(jī)對照試驗(yàn)。

Moers 等［14］在歐洲進(jìn)行的隨機(jī)對照研究也顯示在HMP 組內(nèi)DGF 的發(fā)生率和持續(xù)時(shí)間減少，與所用腎臟類型（DCD、DBD、SCD 或DCD）沒有區(qū)別，這項(xiàng)研究被稱為HMP 和SCS 對比的里程碑式研究。在亞組分析中，在HMP 組中，冷缺血時(shí)間延長被發(fā)現(xiàn)是DGF 的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，在冷缺血時(shí)間短的組內(nèi)，DGF 的發(fā)生率最低。

HMP 在保護(hù)腎臟方面的長期效果仍然存在爭議，爭議的焦點(diǎn)在于HMP 應(yīng)用引起的DGF 減少是否會轉(zhuǎn)化為移植物和患者存活率的提高。有薈萃研究顯示HMP 對原發(fā)性無功能、急性排斥反應(yīng)、移植物或患者長期生存率沒有明確的益處，盡管DGF發(fā)生率顯著降低［15］。在最近的1 項(xiàng)隨機(jī)對照試驗(yàn)中［16］，80 對DBD 腎臟隨機(jī)分為HMP 組和SCS 組，HMP 組的DGF 發(fā)病率較低。但急性排斥反應(yīng)、原發(fā)性無功能、移植物丟失或患者死亡的發(fā)生率并沒有差異。有研究表明HMP 可安全延長DBD 供腎的冷缺血時(shí)間［17］。2009 年的歐洲移植RCT 確實(shí)顯示HMP 在移植術(shù)后1 年GFR 和減少移植失敗方面優(yōu)于SCS。然而，PNF 和1 年患者生存率沒有差異［12］。他們對同一隊(duì)列的3 年隨訪顯示，機(jī)器灌注組的整體移植物存活率更高，對DBD 腎的影響更大，但對DCD 腎的影響不明顯，對ECD 腎的影響最為顯著［18］。在延長SCS 持續(xù)時(shí)間后，將腎臟放置在HMP 上也可以降低DGF。有兩項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn)，對較長時(shí)間SCS 的腎臟進(jìn)行額外的HMP，可以使DGF 發(fā)生率下降［19-20］。

2.1 HMP 的相關(guān)問題

2.1.1 壓力控制與流量控制的對比：關(guān)于機(jī)械灌注采用壓力控制還是流量控制更優(yōu)的研究數(shù)據(jù)有限。Wszola 等［21］在壓力基礎(chǔ)和流量基礎(chǔ)系統(tǒng)之間進(jìn)行的一項(xiàng)前瞻性試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，DGF 的發(fā)生率相似，但壓力基礎(chǔ)中的DGF 持續(xù)時(shí)間短，移植物的1 年存活率也較好。DGF 發(fā)生率較低被認(rèn)為是因?yàn)樵诳刂茐毫Φ那闆r下，剪切力和內(nèi)皮功能障礙較少。

2.1.2 HMP 的最佳持續(xù)時(shí)間：HMP 的最佳持續(xù)時(shí)間尚不完全清楚。Patel 等［22］對190 個腎臟進(jìn)行機(jī)械灌注研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在2 h 內(nèi)可以達(dá)到平均流量目標(biāo)，在灌注后4 h 和6 h，流量參數(shù)并沒有繼續(xù)改善，而且DGF 發(fā)生率沒有下降。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，持續(xù)機(jī)械灌注確實(shí)可以降低移植器官的廢棄率（20%對34%，P ＜0.05），但以較高的DGF 發(fā)生率（64%對39%，P ＜0.05）為代價(jià)，對死亡刪失的移植物存活率沒有任何影響。其他研究［23］提示增加灌注時(shí)間對DGF、SGF、移植物和患者存活率沒有明顯的影響。

2.1.3 用灌注相關(guān)參數(shù)評價(jià)和優(yōu)化腎臟的活力：研究表明［24］，如果流量大于100 ml/（min·100 g），腎臟灌注會更好，如果流量小于80 ml/（min·100 g），則會出現(xiàn)低灌注。在歐洲機(jī)械灌注臨床試驗(yàn)中［14］，灌注壓力保持在30 mmHg（1 mmHg ＝0.133 kPa）。腎臟阻力指數(shù)是以mmHg 為單位的平均灌注壓力與以ml/min 為單位的通過腎臟的流量之間的比率。在Bissolati 等［25］所做的一項(xiàng)研究中，如果在機(jī)械灌注后1 h 內(nèi)腎臟阻力指數(shù)達(dá)到1.0 以下，PNF/DGF的發(fā)生率會降低，同時(shí)腎臟恢復(fù)更快。

機(jī)械灌注泵參數(shù)，如阻力指數(shù)和灌注流量指數(shù)，在預(yù)測邊緣腎和DCD 供腎的DGF 和移植物結(jié)局方面似乎具有更大的區(qū)分價(jià)值。在最近一項(xiàng)［26］對58 例DCD/ECD 腎臟進(jìn)行機(jī)器灌注的研究中，發(fā)現(xiàn)1 h 阻力指數(shù)＝0.4 是預(yù)測DGF（敏感性為61.54%，特異性為81.25%）和更高的1 年血清肌酐水平的最佳分界點(diǎn)。在另一項(xiàng)對446 個DCD 供腎的研究中提示在非ECD 供腎中，如果終末灌注流量增加到大于100 ml/min，DGF 發(fā)生率顯著降低 （P ＜0.05）［27］。此外，終末腎臟阻力指數(shù)是預(yù)測DGF 的最重要參數(shù)（OR ＝2.44；P ＜0.001）。

2.1.4 基于灌注參數(shù)所做出的腎臟廢棄決定：在一項(xiàng)研究中［8］，與未采用機(jī)械灌注相比，采用機(jī)械灌注的ECD 供腎的丟棄率小。丟棄率與腎臟阻力指數(shù)相關(guān)。阻力指數(shù)大于0.26 的腎臟被丟棄的更多。然而，也有其他研究發(fā)現(xiàn)，盡管灌注后的阻力指數(shù)和流量參數(shù)并不理想，SCD 和ECD 供腎的移植和患者預(yù)后卻很好。因此，機(jī)械灌注的流量參數(shù)不應(yīng)作為丟棄腎臟的獨(dú)立判斷標(biāo)準(zhǔn)。2020 年的一項(xiàng)研究［29］發(fā)現(xiàn)HMP 期間的RR 趨勢與ECD 腎臟的組織學(xué)活檢評分有很好的相關(guān)性，并且在灌注120 min 時(shí)，0.88 的臨界值在區(qū)分低評分和高評分方面具有很好的準(zhǔn)確性，HMP 期間的RR 趨勢與ECD 腎臟的組織學(xué)評分相關(guān)，可作為評估移植物質(zhì)量的可靠參數(shù)。

2.2 HMP 的其他研究方向：移植物在冷保存并再灌注后，突然恢復(fù)常溫條件，需要大量的能量，而仍處于低溫麻痹狀態(tài)的細(xì)胞尚未滿足這一需求。因此，有人提出了一種通過離體機(jī)器灌注階梯升高移植物溫度的方法。2020 年Minor 等［30］首次報(bào)道了在移植前用無細(xì)胞的灌注液進(jìn)行控制性復(fù)溫和常溫灌注的臨床病例，取得了良好的效果。2022 年同一團(tuán)隊(duì)發(fā)表了第一個臨床試驗(yàn)研究［31］，6 個ECD 腎臟在植入前應(yīng)用機(jī)器灌注期間接受受控的階梯升溫。對照組為常規(guī)冷保存配對腎臟。階梯升溫從10℃開始，在持續(xù)灌注期間，溫度分別在30、60、75 和90 min 后緩慢升高至17℃、30℃和35℃。在35℃的最終穩(wěn)態(tài)期間，灌注壓力從30 mmHg 平行調(diào)整至75 mmHg。這項(xiàng)研究在低溫灌注和隨后的復(fù)溫期間，持續(xù)向氧合器供給1 L/min的100%氧氣，從而使氧氣充分輸送至移植物。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)COR 可顯著改善移植后的早期同種異體移植功能。術(shù)后第7 天，COR 后肌酐清除率和鈉排泄分?jǐn)?shù)在正常范圍內(nèi)高出2 倍以上，顯著高于對照組。COR 可以安全地應(yīng)用于移植腎，是預(yù)測和改善移植腎早期功能的有價(jià)值的工具。

在腎移植供腎中采用低溫氧合機(jī)灌注（hypothermic oxygenated perfusion，HOPE）目前已經(jīng)開展了臨床前試驗(yàn)［32］。一項(xiàng)研究關(guān)于HOPE對ECD 的影響文章已經(jīng)發(fā)表，這項(xiàng)研究中對15 例ECD 在缺血結(jié)束后進(jìn)行（152±92）min 的HOPE，并與接受CCS 的腎臟匹配進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)DGF發(fā)生率沒有差異（分別為53%和33%；P ＝0.197），與CCS 組相比，HOPE 組術(shù)后血清尿素水平較低（P ＝0.003），而CCS 組術(shù)后第7 天和第14 天的血清肌酐水平較低，eGFR 率較高。

3 亞常溫機(jī)械灌注

關(guān)于機(jī)械灌注溫度的研究有很多。Brasille 等［33］在32 ～ 34℃的亞常溫溫度下，利用一種稱為無血性代謝支持（exsanguinous metabolic support，EMS）的灌注系統(tǒng)進(jìn)行了灌注研究，應(yīng)用動物研究表明，延長EMS 使用時(shí)間可以降低血清肌酐峰值，改善冷缺血損傷。作者對廢棄的人腎臟進(jìn)行了研究，得出了類似的結(jié)果。

4 常溫機(jī)械灌注（normothermic machine perfusion，NMP）

NMP 的 概 念 并 不 新 鮮。1930 年，Carrel 和Lindbergh 試圖在接近生理的條件下穩(wěn)定人體器官時(shí)，采用了NMP 這種方法。但近一個世紀(jì)以來，NMP 在技術(shù)上一直存在很大的挑戰(zhàn)性，而且由于SCS 和HMP 對器官的儲存效果令人滿意，NMP 的發(fā)展一直停滯不前。近年來，隨著更多邊緣腎臟的應(yīng)用和簡易體外循環(huán)裝置的開發(fā)，移植后DGF 的發(fā)病率不斷增加，人們對NMP 的使用重新產(chǎn)生了興趣。

NMP 將器官維持在接近生理的溫度和壓力下，所應(yīng)用的灌注液是一種攜氧載體（通常以紅細(xì)胞為基礎(chǔ)）。NMP 的潛在優(yōu)勢包括避免冷缺血損傷和ATP的生成。此外，還可以對供腎功能進(jìn)行評估，監(jiān)測尿量，并在機(jī)器灌注期間提供治療使移植物損傷加快修復(fù)。盡管在動物模型的研究顯示移植物功能都取得了良好的結(jié)果。但是僅在過去幾年中，NMP 的使用才從動物實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)向人類使用。Hosgood 等［34］于2011 年首次在人腎臟移植中進(jìn)行了NMP 體外試驗(yàn)。2013 年，同一研究小組發(fā)表了第一項(xiàng)NMP 的臨床研究［35］，共計(jì)18 個ECD 供腎，灌注平均溫度為34.6℃，平均時(shí)間為（63±16）min，灌注液為無血漿紅細(xì)胞溶液。對照組為47 例采用低溫靜態(tài)冷保存的ECD 供腎。NMP 組的DGF 顯著降低 （5.6%比36.2%，P ＝0.014），但1 年時(shí)的移植物或患者存活率無任何差異。作者［36］最近提出了一個NMP質(zhì)量評估分?jǐn)?shù)，用3 個標(biāo)準(zhǔn)來評估腎臟質(zhì)量：宏觀外觀、平均腎血流量和總尿量。利用這些參數(shù)進(jìn)行評估，研究者對5 個最初被所有移植中心認(rèn)為不適合移植的腎臟采用NMP，結(jié)果5 例移植后有4 例無DGF。通過這樣的灌注方法，期望可以通過降低邊緣腎和DCD 腎的丟棄率來緩解器官短缺。2021 年，一項(xiàng)關(guān)于單純HMP 與HMP 后額外2 h 的NMP 的單中心、開放、隨機(jī)對照臨床試驗(yàn)已經(jīng)開始［37］，納入供體為ECD 和DCD，期望獲得NMP 對HMP 的額外附加價(jià)值。

總之，根據(jù)目前的證據(jù)，NMP 似乎比SCS 更具優(yōu)勢。NMP 的最佳持續(xù)時(shí)間尚不清楚，理想的灌注液也是如此。在當(dāng)今時(shí)代，它在技術(shù)上具有挑戰(zhàn)性，每次移植的成本也更高，但通過減少DGF 和增加其他廢棄腎臟的使用，它最終可能對衛(wèi)生經(jīng)濟(jì)學(xué)更有利。臨床試驗(yàn)正在進(jìn)行，以確認(rèn)最初的有利發(fā)現(xiàn)，并擴(kuò)大其使用范圍。

5 機(jī)械灌注中的生物標(biāo)志物

由于機(jī)械灌注循環(huán)液體的生化特性是已知的，因此可以通過分析灌注中生物標(biāo)記物來評估器官活力和組織損傷程度。移植中常用的生物標(biāo)志物有乳酸脫氫酶（lactic dehydrogenase，LDH）、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（glutathione S-transferase，GST）、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（aspartate transaminase，AST）、N-乙酰-b-D-氨基葡萄糖苷酶（N-acetyl-β-Dglucosaminidase，NAG）和心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白（heart-type fatty acid binding protein，H-FABP）。GST 水平與熱缺血時(shí)間（warm ischemia time，WIT）密切相關(guān)，也是DGF 的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。較高的NAG 和H-FABP 水平提示存在DGF 的高風(fēng)險(xiǎn)，但在區(qū)分移植物功能方面沒有預(yù)測價(jià)值。與DBD 和活體供腎相比，DCD 供腎中LDH、NGAL、MMP-2 等其他組織損傷標(biāo)志物的水平更高。組織損傷的非特異性標(biāo)記物，如LDH，在WIT 或移植物功能之間沒有顯著相關(guān)性，最好與其他生物標(biāo)記物結(jié)合使用，而不是單獨(dú)使用。

把生物標(biāo)記物與機(jī)械灌注相關(guān)參數(shù)綜合分析，具有更高的實(shí)用性。最近，細(xì)胞外組蛋白和microRNA-21（miR-21）的灌注水平引起了許多研究者的注意。在一項(xiàng)對390 例DCD 供腎進(jìn)行組蛋白分析的研究中［38］，發(fā)現(xiàn)組蛋白水平與PNF、DGF和1 年移植失敗的風(fēng)險(xiǎn)有相關(guān)性。在另一項(xiàng)研究中，在HMP 組的11 個ECD 供腎中，移植后6 個月和12 個月，MiR-21 水平與eGFR 的水平相關(guān)。器官質(zhì)量的評估非常重要，因此需要在更大的試驗(yàn)中驗(yàn)證此類新型生物標(biāo)記物的研究結(jié)果。

6 間充質(zhì)干細(xì)胞在機(jī)器灌注中的應(yīng)用

間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cell，MSC）是一種多能細(xì)胞，可減輕免疫和炎癥反應(yīng)，促進(jìn)組織修復(fù)。MSC 具有可再生和低免疫原性等特征。Gregorini 等［39］最近在大鼠DCD 移植模型上進(jìn)行的一項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn)，在灌注液中補(bǔ)充MSC，且從MSC 分離的細(xì)胞外小泡，可改善組織病理學(xué)，上調(diào)細(xì)胞能量代謝和膜轉(zhuǎn)運(yùn)的基因，降低灌注液缺血和損傷生物標(biāo)記物的水平。在人類腎移植中［40］，已經(jīng)證實(shí)經(jīng)靜脈輸注MSC 對移植物或患者存活沒有有害影響。對這些輸注MSC 的患者進(jìn)行5 ～ 7 年隨訪，發(fā)現(xiàn)這些患者循環(huán)記憶CD8 陽性T 細(xì)胞百分比降低，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞/記憶性CD8陽性T細(xì)胞比率長期增加，允許少數(shù)患者的免疫抑制顯著減弱［41］。在一些初步研究中［42］，將MSC 注入移植物可以減少免疫抑制劑并誘導(dǎo)免疫耐受。因此，機(jī)器灌注有可能為一些新的療法提供可能，例如將MSC 注入灌注器官的環(huán)境中，并且由于灌注器官內(nèi)更具耐受性的免疫表型，因此可能允許較低的免疫抑制劑。

7 結(jié) 論

在器官短缺的時(shí)代，機(jī)械灌注似乎在保存腎臟方面有著很好的前景。雖然HMP 似乎在減少DGF方面有明顯的益處，但其他類型的機(jī)械灌注需要在臨床試驗(yàn)研究中得到重現(xiàn)。此外，還需要特定的生物標(biāo)記物和灌注參數(shù)來評估和改善灌注腎的活力。